Cinética Enzimática

Enrique Rivera González

Importancia
• Las enzimas son proteínas capaces de catalizar específicamente
reacciones bioquímicas.

• La actividad catalítica de las enzimas depende de su estructura.

Pueden requerir:
1) Sólo su secuencia de aminoácidos y su conformación
2) Un cofactor (iones inorgánicos como Fe2+, Mg2+, Cu2+)
3) Un grupo prostético (porfirinas)

2
• Las catálisis enzimática es esencial
para sistemas vivos.

• Permite que procesos químicos no

favorables energéticamente se lleven a
cabo en condiciones biológicas:
 Medio acuoso, pH neutro, temperatura
y presión bajas.

• Cuando la enzima se desnaturaliza,

pierde su estructura y por lo tanto su
actividad catalítica.

3
 Aequorea victoria

Aequorina

HO HO

O
O2, Ca2+ O + CO2 + hv (466 nm)
N N N NH
Aequorina

N N
H
HO HO

4
 Sustrato

• Una reacción catalizada enzimáticamente

se lleva a cabo en el sitio activo, que es el
Enzima
conjunto de residuos de aminoácidos de la
enzima que se unen a la molécula que va a
transformarse.

• La molécula que se une al sitio activo se

Complejo denomina sustrato.
enzima -
sustrato
• Generalmente un sitio activo es específico
para un determinado sustrato y al unirse
forman un complejo enzima-sustrato

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Productos
 Factores energéticos
Reacción sin catalizar
Estado de transición
Energía libre G

𝑆→𝑃
no catalizada
Reacción catalizada
por enzimas
catalizada

𝑘1 𝑘2
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝑃 + 𝐸
𝑘−1

Coordenada de reacción

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Cinética de Michaelis-Menten

Observaciones experimentales
• A bajas [S], v0 incrementa linealmente

v0
mientras [S] aumenta

• A mayores [S], los incrementos de v0 se

hacen menores mientras [S] aumenta.

• Después de una cierta [S], v0 ya no

aumenta, alcanzando un máximo Vmax [S]

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• Para explicar este comportamiento cinético, Michaelis y Menten
propusieron en 1913 el siguiente mecanismo:
1) La enzima (E) se combina reversiblemente con sus sustrato (S)
para formar un complejo enzima-sustrato (ES).
2) En un paso lento el complejo ES da lugar a la enzima libre (E) y
a los productos de la reacción (P).

𝑘1 𝑘2
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃
𝑘−1
sitio activo

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Deducción de la ecuación de velocidad
𝑘1 𝑘2
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝑃 + 𝐸
𝑘−1

Se define la ecuación de velocidad total.

𝑑[𝑃]
𝑣0 = = 𝑘2 [𝐸𝑆]
𝑑𝑡 0
En la primera reacción se plantea una situación de equilibrio
y las velocidades hacia ambas direcciones se igualan.
𝑘−1 𝐸 [𝑆]
𝑘1 𝐸 [𝑆] = 𝑘−1 [𝐸𝑆] 𝐾𝑠 = =
𝑘1 [𝐸𝑆]

9
A cualquier tiempo en una reacción catalizada enzimáticamente, la
enzima existe en dos formas: E y ES y su concentración total se expresa:

[𝐸]0 = 𝐸 + [𝐸𝑆] 𝐸 = 𝐸𝑆 − [𝐸]0

𝐸 [𝑆] ( 𝐸𝑆 − 𝐸 0 )[𝑆]
𝐾𝑠 = =
[𝐸𝑆] [𝐸𝑆]
𝐸 0 [𝑆]
Despejando [ES]. 𝐸𝑆 =
𝐾𝑠 + [𝑆]

Sustituyendo [ES] en la expresión de velocidad.

𝑑[𝑃] 𝑘2 𝐸 0 [𝑆]
𝑣0 = = 𝑘2 𝐸𝑆
𝑑𝑡 0
𝐾𝑠 + [𝑆]
10
 𝒌𝟐 𝑬 𝟎 [𝑺]
𝒗𝟎 =

v0
𝑲𝒔 + [𝑺]
1) Cuando [S] es baja
𝑺 ≪ 𝑲𝒔
𝑘2
𝑣0 = 𝐸 0 𝑆 𝑣0 ∝ 𝑆
𝐾𝑠

2) Cuando [S] es alta [S]

𝑺 ≫ 𝑲𝒔 𝑣0 = 𝑘2 𝐸 0 = 𝑽𝒎𝒂𝒙
Vmax se observa cuando prácticamente toda la enzima se encuentra
saturada con su sustrato (formando complejo ES) y un incremento
en [S] no tiene efecto en la velocidad de reacción.
11
Cinética de Briggs-Haldane
Basándose en el esquema de reacción de Michaelis y Menten, en 1925
Briggs y Haldane propusieron que durante las reacciones enzimáticas,
la [ES] se mantiene constante hasta que una cantidad significativa de
sustrato ha sido consumida.

Es aplicable la aproximación de estado estacionario para ES

12
Deducción de la ecuación de velocidad
𝑘1 𝑘2
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝑃 + 𝐸
𝑘−1

Se define la ecuación de velocidad total.

𝑑[𝑃]
𝑣0 = = 𝑘2 [𝐸𝑆]
𝑑𝑡 0
Se plantea la diferencial de ES.

𝑑[𝐸𝑆]
= 𝑘1 𝐸 𝑆 − 𝑘−1 𝐸𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 = 0
𝑑𝑡

13
La concentración total de la enzima se expresa:
[𝐸]0 = 𝐸 + [𝐸𝑆] 𝐸 = 𝐸𝑆 − [𝐸]0
Sustituyendo [E] en la ecuación de estado estacionario.
𝑘1 𝐸 𝑆 − 𝑘−1 𝐸𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 = 0
𝑘1 ( 𝐸𝑆 − 𝐸 0 ) 𝑆 − 𝑘−1 𝐸𝑆 − 𝑘2 𝐸𝑆 = 0

Despejando [ES].
𝑘1 𝐸 0 𝑆
𝐸𝑆 =
𝑘−1 + 𝑘2 + 𝑘1 𝑆
Sustituyendo [ES] en la expresión de velocidad.
𝑑[𝑃] 𝑘22 𝑘𝐸1 0𝐸𝑆0 𝑆
𝑣0 = ==
= 𝑘𝑘2 𝐸𝑆
𝑑𝑡 0 𝑘1−1𝑆+ + 𝑘2𝑘 + 𝑘
+−1𝑆 2
𝑘1 14
 𝑘1 𝑘2
𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝑃 + 𝐸
𝑘−1
Aproximación al equilibrio: Aproximación de estado estacionario:
𝑘2 𝐸 0 [𝑆] 𝑘2 𝐸 0 𝑆 𝑘2 𝐸 0 [𝑆]
𝑣0 = 𝑣0 = =
𝐾𝑠 + [𝑆] 𝑘−1 + 𝑘2 𝐾𝑚 + [𝑆]
+ 𝑆
𝑘1
𝑘−1 𝑘−1 + 𝑘2
𝐾𝑠 = 𝐾𝑚 =
𝑘1 𝑘1
• Michaelis y Menten asumieron que la unión al sustrato y la disociación del
complejo ES ocurrían más rápido que la formación de producto (𝑘−1 ≫ 𝑘2 ).
• Briggs y Haldane no asumieron nada acerca de los valores de 𝑘−1 𝑦 𝑘2 .

El modelo cinético de M-M es un caso especial del modelo de B-H.

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 𝑘2 𝐸 0 [𝑆] 𝑽𝒎𝒂𝒙 [𝑺]
𝑣0 = 𝑽𝒎𝒂𝒙 = 𝑘2 𝐸 𝒗𝟎 =
𝐾𝑚 + [𝑆] 0 𝑲𝒎 + [𝑺]
Ecuación de Michaelis-Menten

De la ecuación cinética de Michaelis-Menten se puede obtener una relación

matemática cuando la velocidad inicial es la mitad de Vmax.
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑣0 = =

v0
𝐾𝑚 + [𝑆] 2
[𝑆] 1
=
𝐾𝑚 + [𝑆] 2

𝑽𝒎𝒂𝒙
𝑲𝒎 = 𝑺 𝑐𝑢𝑎𝑛𝑑𝑜 𝒗𝟎 =
𝟐
[S] = Km [S] 16
Linealización de Lineweaver-Burk

• Experimentalmente el valor de Vmax puede no llegar a obtenerse

porque la enzima no se haya saturado completamente.
• La ecuación de Michaelis-Menten puede expresarse algebraicamente
de otras formas tales que permitan una práctica determinación de los
parámetros cinéticos Km y Vmax .

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣0 =
𝐾𝑚 + [𝑆]

1 𝐾𝑚 1
= +
𝑣0 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥
17
Linealización de Eadie-Hofstee

• Es otra técnica similar a la de Lineweaver-Burk para determinar Km y Vmax .

• El principal problema de este método es que tanto la variable dependiente
como la independiente dependen de v0 y que un error experimental
afectaría a ambos ejes.
𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣0 =
𝐾𝑚 + [𝑆]
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑚 + [𝑆]
=
𝑣0 [𝑆]

𝐾𝑚 𝑣0
𝑣0 = − + 𝑉𝑚𝑎𝑥
[𝑆]
18
Interpretación de Km
• Representa la [S] a la cual la mitad de las moléculas de enzima se
encuentran saturadas, formando complejo ES.

• El valor de Km sugiere la afinidad de la enzima con sus sustrato.

Un valor bajo de Km indica mayor afinidad y por lo tanto una mayor
velocidad a cualquier [S].

• Km es utilizado para identificar isoenzimas, las cuales presentan

diferente afinidad por el mismo sustrato.

• Km es sensible a condiciones como pH y temperatura, lo cual permite

identificar cambios estructurales de la enzima.
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 𝑘2 𝐸 0 [𝑆]
Interpretación de k2 𝑣0 =
𝐾𝑚 + [𝑆]

• k2 también conocida como kcat o número de recambio es la constante

de velocidad para el paso determinante de velocidad.

• kcat se define como el número de moléculas de producto formadas a

partir del sustrato por una enzima en una unidad de tiempo.

kcat
• El cociente , denominado como cociente de especificidad permite
K𝑚
comparar la eficiencia catalítica de diferentes enzimas o de la
transformación de dos sustratos diferentes por la misma enzima.

20
21
Los siguientes datos experimentales fueron obtenidos durante un estudio de la
actividad catalítica de una peptidasa intestinal con el sustrato glicilglicina de
acuerdo a la siguiente reacción:
𝐺𝑙𝑖𝑐𝑖𝑙𝑔𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 + 𝐻2 𝑂 → 2 𝐺𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎

[S] (mM) V0 (μM/min)

1.6 0.21
2.0 0.24
3.0 0.28
4.0 0.33
8.0 0.40
16.0 0.45

Sabiendo que [E]=0.3μM, determina la eficiencia catalítica de la enzima.

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Se determinó la velocidad inicial a varias concentraciones de sustrato para una
reacción catalizada enzimáticamente de acuerdo con los siguientes datos:

[S] /105(M) V0 /106(mol/min) a) Menciona si la reacción sigue una cinética

2.5 0.21 de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten.
4.0 0.24
b) Si kcat es 8.0 𝑥 102 , ¿Cuál fue la
6.0 0.28
concentración de enzima utilizada?
8.0 0.33
16.0 0.40 c) Calcula v0 cuando [𝑆] = 5.0 𝑥 10−5 y
20.0 0.45 [𝑆] = 5.0 𝑥 10−1

d) Si se duplicara la concentración de la
enzima, ¿Cómo se verían afectados los
valores de Km, kcat y Vmax?
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