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Unidad XIII
Para su producción,
producción es necesario atravesar todas las etapas del clonado
molecular dado que es necesario generar construcciones genéticas.
Sistemas de expresión
Transferirla al organismo
adecuado
Transferirla al organismo
adecuado
Inoculación en un mamífero
Clonado molecular
Transferirla al organismo
adecuado
Inmovilización en un soporte,
o formulación líquida
Sistemas de expresión
Transferirla al organismo
adecuado
Formulación
F l ió para su
administración
Sistemas de expresión
Transferirla al organismo
adecuado
Formulación
F l ió para su
administración
Sistemas de expresión
Transferirla al organismo
adecuado
Formulación
F l ió para su
administración
Expresión de proteínas recombinantes
gen
proteína
organismo
g
Seleccionar el Evaluar la
Construir un gen que
organismo adecuado producción de la
exprese la proteína de
para la expresión
p p del proteína de interés
p
interés
gen
Expresión de proteínas recombinantes
Jackson et al, 2004. Cell-free protein synthesis for proteomics. BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS. VOL 2. NO 4.
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistemas lib
libres de
d células
él l
Plásmidos Bacterias
Plásmidos Levaduras
Plásmidos Células animales
Vi
Virus Cél l de
Células d insectos
i t
Virus Células de mamíferos
g
Transgenes Toda clase de organismos
g
Expresión de proteínas recombinantes
Plá id de
Plásmidos d expresión
ió procariotas
i t
Expresión de proteínas recombinantes
C
Construcción
t ió del
d l gen: selección
l ió de
d vector
t
AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTT
Promotor T7 Operador lacI
TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCGGGCG
RBS NdeI pel B
ATGGCCTGGCCATGGATATCGGAATTAATTTCGGATCCGGATATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCCCTCGAGCACC
pel B NcoI BamHI EcoRV SacI SalI HindIII XhoI
ACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAG
His-tag STOP
CATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTT
Terminador T7
Expresión de proteínas recombinantes
C
Construcción
t ió del
d l gen: selección
l ió de
d vector
t
pET-Blue (Novagen)
Expresión de proteínas recombinantes
C
Construcción
t ió del
d l gen: selección
l ió de
d vector
t
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/bacterias
lá id /b t i
Plásmidos Bacterias
Plásmidos Levaduras
Plásmidos Células animales
Vi
Virus Cél l de
Células d insectos
i t
Virus Células de mamíferos
g
Transgenes Toda clase de organismos
g
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras
lá id /l d
Entre
E t las
l consideraciones
id i en la
l construcción
t ió del
d l gen, deben
d b
incorporarse todos los componentes típicos de la sintaxis génica
eucariota
Expresión de proteínas recombinantes
S
Secuencia
i consenso de
d Kozak
K k
GCCGCC(A/G)-3CCA1UGG+4
+1 de traducción
Los plásmidos
L lá id que replican
li en levaduras
l d poseen los
l siguientes
i i
elementos:
Origen 2 µ
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d C
Construcción
t ió del
d l gen
Origen 2 µ
YEP
YEP
YEP
YRP
YCP
YCP
YIP
YIP
1ra Etapa
Clonado molecular
en bacterias
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d S l
Selección
ió de
d la
l levadura
l d
gen
Seleccionar
especies de
organismo
g
levaduras
Seleccionar el
Construir un gen que
organismo adecuado
exprese la proteína de
para la expresión
p p del
interés
gen
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d S l
Selección
ió de
d la
l levadura
l d
2da Etapa
Transferencia a
levaduras
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d S l
Selección
ió de
d levaduras
l d
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d S l
Selección
ió de
d levaduras
l d
Kawai et al, 2010. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi Methods and possible underlying mechanism.. Bioengineered Bugs 1:6, 395-
403.
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d E
Ensayos d inducción
de i d ió
gen
proteína
levadura
Seleccionar la Evaluar la
Construir un gen que
levadura adecuada producción de la
exprese la proteína de
para la expresión
p p del proteína de interés
p
interés
gen
Expresión de proteínas recombinantes
E
Ensayos d inducción
de i d ió
2-3 hs
Inducción
((introducción del agente
g
inductor a
concentración deseada)
(por ejemplo metanol,
para las metilotróficas)
Expresión de proteínas recombinantes
E
Ensayos d inducción
de i d ió
Balasubramanian et al, 2004. Comparative Analysis of Cytokinesis in Budding Yeast, Fission Yeast and Animal Cells. Current Biology, Vol. 14, R806–R818.
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d S l
Selección
ió de
d levaduras
l d
Yeong. 2005. Severing all ties between mother and daughter: cell separation in budding yeast. Molecular Microbiology. 55 (5), 1325–1331
Expresión de proteínas recombinantes
E
Ensayos d inducción
de i d ió
SDS-PAGE
Western Blot
Ensayos de Actividad
Expresión de proteínas recombinantes
C
Cromosomas artificiales
tifi i l ded levaduras
l d
Expresión de proteínas en
células animales
Expresión de proteínas recombinantes
Plásmidos Bacterias
Plásmidos Levaduras
Plásmidos Células animales
Vi
Virus Cél l de
Células d insectos
i t
Virus Células de mamífero
g
Transgenes Toda clase de organismos
g
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/células
lá id / él l animales
i l
A partir de tejidos animales es posible obtener células libres que
pueden ser cultivadas en condiciones de laboratorio.
laboratorio
En tanto,
tanto algunos cultivos de células animales logran
inmortalizarse debido a cambios genéticos, constituyendo así líneas
celulares establecidas.
Las células
L él l d i d
derivadas d tumores,
de t ll
llamadas
d “t
“transformadas”,
f d ”
suelen constituir líneas inmortales.
Replicón viral:
Marcadores de selección:
El ssistema
ste a más ás ut
utilizado
ado pa
para
a
esto es el de los lentivirus.
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/levaduras:
lá id /l d S l
Selección
ió de
d células
él l
gen
Seleccionar
líneas celulares
organismo
g
animales
Seleccionar las
Construir un gen que
células adecuadas
exprese la proteína de
para la expresión
p p del
interés
gen
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/células
lá id / él l animales
i l
Lí
Línea celular
l l P
Procedencia
d i Ti
Tipo celular
l l ded origen
i
PROCEDIMIENTOS DE TRANSFECCIÓN
El DNA disuelto en un buffer Los lípidos catiónicos El DEAE-Dextrano El DNA ingresa por los
fosfato genera un precipitado forman complejos es un policatión que microporos de las
en contacto con iones de estables con el DNA. se asocia al DNA. células al someterlas
calcio. con un pulso eléctrico.
Estos complejos se El complejo se
La célula incorpora el asocian a las asocia a las
precipitado mediante membranas membranas
endocitocis
endocitocis. celulares e ingresan celulares e ingresa
por endocitocis. por endocitocis.
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/células
lá id / él l animales
i l
Transitorios Estables
gen
proteína
levadura
Seleccionar la línea Evaluar la
Construir un gen que
celular para la producción de la
exprese la proteína de
p
expresión del g
gen proteína de interés
p
interés
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/células
lá id / él l animales:
i l E
Expresión
ió
Clonado en
Escherichia coli
Transiente
o estable
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema plásmidos/células
lá id / él l animales:
i l E
Expresión
ió
Células Sf21
40 X
Microscopio de fluorescencia Luz Blanca
Expresión de proteínas
utilizando virus de insectos
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema virus/hospedador
i /h d d
Entre ellas,
ellas la producción de proteínas recombinantes es un
objetivo ampliamente abordado para el diseño de sistemas de
expresión del tipo virus/hospedador.
Expresión de proteínas recombinantes
Plásmidos Bacterias
Plásmidos Levaduras
Plásmidos Células animales
Vi
Virus Cél l de
Células d insecto
i t
Virus Células de mamíferos
g
Transgenes Toda clase de organismos
g
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
Infección secundaria
Muerte celular
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
El g
genoma de los baculovirus es infectivo p
per se
Al ser transfectado como DNA desnudo en una línea celular susceptible es capaz de
iniciar la cascada de transcripción, traducción y replicación necesarias para la
generación de progenie (viriones brotantes y viriones ocluidas)
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
E función
En f ió de
d todas
t d las
l consideraciones
id i anteriores:
t i
De hecho,
hecho existen numerosos ejemplos en el mercado biotecnológico de
sistemas basados en baculovirus y células de insecto.
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
Dentro de
E. coli
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
Dentro de
E. coli
Luego de transponer
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
gen
Seleccionar
líneas celulares
organismo
g
hospedadoras
Seleccionar las
Construir un gen que
células de insecto
exprese la proteína de
p
hospedadora p
para el
interés
virus
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
1 2 3 4 5 6 7 8 9
SDS-PAGE 10%
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema b
baculovirus/insectos
l i /i t
Rachiplusia nu
infectada
con AcMNPV
(ph-, DsRed+)
Rachiplusia nu
no infectada
Plásmidos Bacterias
Plásmidos Levaduras
Plásmidos Células animales
Vi
Virus Cél l de
Células d insecto
i t
Virus Células de mamíferos
g
Transgenes Toda clase de organismos
g
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema virus
i d
de mamíferos/células
íf / él l ded mamíferos
íf
E t ellos
Entre ll se pueden
d mencionar
i a Vaccinia
V i i y all Herpes
H virus.
i
Entre ellos, se encuentran: HSV-1 (Herpes Simplex Virus Type 1), HSV-2
(Herpes
p Simplex
p yp 2), HCMV (Human Cytomegalovirus
Virus Type y g ), EBV (Epstein
p
Barr Virus), HHV3 (Varicella Zoster), KSHV (Kaposi’s sarcoma-associated
herpesvirus).
Proteínas
regulatorias
dsDNA lineal
(~ 150 kpb)
10
glicoproteínas
Envoltura lipídica
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema virus
i h
herpes/células
/ él l ded mamíferos
íf
Suresh de Silva and William J. Bowers. Herpes Virus Amplicon Vectors. Viruses 2009, 1, 594-629; doi:10.3390/v1030594
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema virus
i h
herpes/células
/ él l ded mamíferos
íf
Los vectores
L t b
basados
d en ell genoma del
d l virus
i h
herpes se denominan
d i
amplicones (herpes amplicon vectors).
Para encapsidar
P id
y resolver
multímeros
Suresh de Silva and William J. Bowers. Herpes Virus Amplicon Vectors. Viruses 2009, 1, 594-629; doi:10.3390/v1030594
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema virus
i h
herpes/células
/ él l ded mamíferos
íf
Suresh de Silva and William J. Bowers. Herpes Virus Amplicon Vectors. Viruses 2009, 1, 594-629; doi:10.3390/v1030594
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema virus herpes/células
p de mamíferos
Plásmidos Bacterias
Plásmidos Levaduras
Plásmidos Células animales
Vi
Virus Cél l de
Células d insecto
i t
Virus Células de mamíferos
g
Transgenes Toda clase de organismos
g
Expresión de proteínas recombinantes
Si t
Sistema OGM
Louis-Marie Houdebine. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 32
(2009) 107–121
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema OGM
Louis-Marie Houdebine. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 32
(2009) 107–121
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema OGM
Louis-Marie Houdebine. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 32
(2009) 107–121
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema OGM
Louis-Marie Houdebine. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 32
(2009) 107–121
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema OGM
Louis-Marie Houdebine. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 32
(2009) 107–121
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema OGM
insulina Lactoferrina y
Hormona de
lisozima
crecimiento
Expresión de proteínas recombinantes
Sistema OGM