UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE YUCATÁN

CAMPUS DE CIENCIAS DE LA SALUD

FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

Laboratorio de Inmunología clínica

Docentes: Dr. Víctor Arana, Dr. Guillermo Valencia

Reporte de práctica 1. IFI

29/09/2017
Marco teórico.

La técnica de inmunocitoquímica más antigua que se utiliza para identificar la

distribución de un antígeno dentro de las células y los tejidos se conoce como
inmunofluorescencia directa. Esta técnica se vale de un anticuerpo primario
marcado con un fluorocromo que reacciona con el antígeno dentro de la muestra.
La visualización de las estructuras no es ideal a causa de la poca intensidad de
la emisión de la señal. La inmunofluorescencia indirecta (IFI) tiene una
sensibilidad mucho mayor que los métodos directos, donde el fluorocromo se
conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario. El
método indirecto aumenta en forma considerable la señal fluorescente emitida
por el tejido. Una ventaja adicional de la IFI es que un solo anticuerpo secundario
puede utilizarse para localizar la unión histoespecífica de varios anticuerpos
primarios diferentes. Las desventajas de la IFI son el costo, requieren de mayor
trabajo que las directas y no se adaptan a procedimientos automatizados. 1

Los fluorocromos son colorantes que pueden originar un nivel elevado de energía
después de absorber luz ultravioleta, cuando las moléculas vuelven a su estado
de energía normal más bajo liberan el exceso de energía en forma de luz visible.
El color de la luz fluorescente depende del colorante y los filtros de luz utilizados,
en la inmunoflourescencia los más utilizados son el Isotiacianato de fluoresceína
(FITC) que emite un color característico verde a una luz de excitación de 450 -
490 nm, el Isotiocianato de tetrametilrodamina (TRIC) que emite una luz roja a
una absorción máxima de 580 nm y la Ficoeritrina que da una fluorescencia roja
con una absorción máxima cercana a la fluoresceína de tal manera que permite
hacer una doble tinción sin cambiar de filtro.2

La IFI se usa actualmente para la detección de anticuerpos anti-DNA de doble

cadena o DNA nativo, se utiliza como sustrato el parásito Crithidia luciliae.
Cuando se utiliza Crithidia luciliae, se considera la prueba positiva cuando los
anticuerpos reaccionan con el DNAn del cinetoplasto. Solo se considera positiva
la prueba cuando se tiñe el cinetoplasto independientemente del núcleo. 3
 DIAGRAMA METODOLÓGICO. INICIO

Se realizó una dilución 1:20 a las muestras problema. R1

Una vez atemperarada el portaobjetos con sustrato, se retiró de su empaque y

se señalaron los pocillos donde se colocarían las muestras y los controles.

Se depositó una gota de control positivo, control negativo y de cada dilución

1:20 de muestras en los pocillos del portaobjetos con sustrato.

Se incubó el portaobjetos, dentro de una cámara húmeda, a temperatura

ambiente durante 30 min.

Después del tiempo de incubación, se eliminó el exceso de muestra con papel R2

absorbente.

Se colocó la placa en un vaso de precipitados con PBS y se realizó un lavado

durante 5 min. Al finalizar se cambió el PBS y se repitió el lavado. R3

Cuando se terminó el lavado, se retiró el excedente de PBS con papel

absorbente. R2

Se dispensó una gota del conjugado en cada pocillo y se incubó en la cámara

húmeda a temperatura ambiente durante 30 min.

Se realizaron dos lavados nuevamente con PBS . R3

Se retiró el excedente de PBS y se dejó secar el portaobjetos recubierto con

papel aluminio. R2

Una vez seco, se depositó una gota de glicerol en cada pocillo y se le añadió
el cubreobjetos.

Se observó en cuarto oscuro con un microscopio de fluorescencia a un R4

objetivo de 100x.

FIN
Manejo de residuos
SÍMBOLO RESIDUO DESECHO
Dilución 1:20 de Recipiente hermético
muestra problema rojo de RPBI
R1

Papel con excedente de Basura común

R2
muestra o PBS

PBS usado en lavados Disoluciones de metales

y sales inorgánicas
R3

Portaobjetos con Recipiente de RPBI de

sustrato y muestra polietileno para
R4
punzocortantes

Resultados y discusiones
En la figura 1 se muestran los sitios de la placa donde se colocaron las distintas
muestras. En la posición 1 se colocó el control positivo, en la posición 2 se colocó
el control negativo, en la posición 3 se colocó una muestra positiva con altos
niveles de anticuerpos a LES y en la posición 4 se colocó la muestra del paciente.

Figura 1. Placa para técnica de IFI contra anticuerpos anti-DNA.

En la figura 2 se muestran los resultados de la posición 1, el control positivo. Se
logra ver el fondo rojizo del parasito debido a la fluorescencia natural de la célula.
También se logra ver que no se unieron los anticuerpos a ambos sitios diana,
razón por la cual en algunos parásitos solo se ve marcado o el cinetoplasto o el
núcleo (Flecha roja).

Figura 2. Posición 1, control positivo.

En la figura 3 se muestran los resultados de la posición 2, en control negativo.

Ausencia de fluorescencia y un fondo rojizo como resultado de la fluorescencia
natural de la célula.

Figura 3. Posición 2, control negativo.

Figura 4 se muestra la posición 3, que corresponde a la muestra con altos niveles
de anticuerpos anti-DNA contra LES. Se logra ver la fuerte fluorescencia tanto en
el núcleo como en el cinetoplasto.

Figura 4. Posición 3, muestra positiva a LES

En la figura 5 se muestran los resultados de la posición 4, correspondiente al

paciente. Se logra ver el fondo rojizo de la célula debido a la fluorescencia natural.
Algunos puntos fluorescentes debido a que la muestra de suero no está purificada
y contiene proteínas que pueden hacer que se fijen pequeñas cantidades de
anticuerpo.

Figura 5. Posición 4, muestra del paciente.

La realización pruebas de detección de anticuerpos anti-ADN nativo es
fundamental para la identificación de pacientes con LES debido a su expresión
prácticamente exclusiva para esta enfermedad.4

La utilización de inmunofluorescencia como técnica para el diagnóstico de LES

permite una obtención rápida de resultados con un alto grado de especificidad,
en la cual se utilizan como sustrato antigénico Chritidia luciliae por la presencia
de un cinetoplasto, donde se encuentran contenidas grandes cantidades de ADN
circular de doble cadena sin asociación a ARN ni con proteínas nucleares, lo cual
permite una fácil unión de los anticuerpos en cuestión en caso de estar presentes
en la muestra.4 ,5

Para tomar como positiva la prueba de inmunofluorescencia tiene que existir la

reacción antígeno-anticuerpo en presencia de las moléculas de ADN de doble
cadena en el cinetoplasto, ya que, a pesar de la existencia de estas mismas
moléculas en el núcleo del parásito utilizado, puede existir reactividad con otros
componentes y dar resultados falsos positivos.3, 4

A pesar de la especificidad de la técnica antes mencionada, no se puede

considerar para la misma la presencia de una alta sensibilidad, por lo que en
ciertos casos es recomendable la confirmación de los resultados por otras
pruebas más sensibles.3
Referencias
1. Ross, M.; Wojciech, P. Histologia: texto y atlas color con biología celular y
molecular, 5ª ed.; Buenos Aires: Medica Panamericana, 2008; pp10-11.
2. Brío, M.; Riera, P. Manual de bases teórico-prácticas de
inmunocitoquímica. Universidad de Oviedo; pp 43-44.
3. Ramírez, D.; Cabiedes, J. Técnicas inmunológicas que apoyan el
diagnóstico de las enfermedades autoinmunes. Reumatología Clínica.
2010, 6, 3, 173-177.
4. A. Ramos, M. Enfermedades autoinmunes sistémicas y reumatológicas.
Masson, España: 2005, pp. 63-64.
5. B. Griemberg, G. Inmunofluorescencia con Crithidia luciliae para la
detección de anticuerpos anti-ADN. Imágenes atípicas y su relación con
enfermedad de Chagas y leishmaniasis. Fundación Revista Medicina. [En
línea] 2006, 66, 1, 3-8.
6.