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2.1.- Introducción
Los compuestos polifenólicos son antioxidantes que constituyen una clase de
metabolitos secundarios biosintetizados por el reino vegetal [1].
Debido a que los antioxidantes sintéticos utilizados en la industria tienen la desventaja
de ser muy volátiles y se sospecha que son perjudiciales para la salud, existe en la
actualidad un gran interés por la búsqueda de sustancias o compuestos alternativos,
preferiblemente de origen biológico, que además de ser eficaces como antioxidantes, su
aprovechamiento no impacte negativamente sobre el medio ambiente.
Por otro lado, cada día se conoce más acerca de los beneficios del empleo de
antioxidantes naturales en la salud humana e industria, por lo que es necesario explorar
nuevas fuentes. Los residuos de la poda de olivo podrían resultar una excelente opción,
ya que estudios recientes a nivel internacional evidencian la presencia de compuestos
polifenólicos con propiedades antioxidantes en la hoja de olivo, lo que condujo a la
comercialización de sus extractos debido a la gran utilidad en fitoterapia, cosmética y
las industrias farmacológicas y de la alimentación. En contraste, apenas existen
antecedentes sobre la composición fenólica en la madera de esta especie.
Por lo expuesto y teniendo en cuenta que la provincia de Catamarca presenta una
extensa área de cultivo de olivo, con perspectiva de crecimiento y consecuente
producción de una biomasa de residuos de poda, actualmente sin aprovechamiento,
surge la necesidad de desarrollar un método confiable que implique procedimientos de
extracción y tratamientos de la muestra para extraer la mayor cantidad de fenoles
presentes en las hojas y la madera de olivo, manteniendo algunas de las características
beneficiosas de sus extractos, como ser el poder antioxidante.
[2]
De acuerdo con lo presentado por Waterman y Mole (1994) , con respecto a los
solventes y condiciones de trabajo para la extracción de CF de materiales vegetales y en
función de los mejores resultados registrados en antecedentes que se refieren al poder
[3]
extractivo de diferentes solventes orgánicos sobre la madera y la hoja de olivo , en el
presente ensayo se aplica la extracción por maceración con etanol acuoso y acetato de
etilo sobre residuos de poda de la variedad Arbequina del Valle Central de Catamarca
para evaluar su poder extractivo y la actividad antioxidante de los extractos obtenidos.
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
Los extractos en etanol acuoso al 50% y en acetato de etilo se obtienen utilizando una
relación 1:10 p/v. Para ello se pesan, por quintuplicado, 5 g de muestra de hoja y 5 g
de muestra de madera, por separado. Se adicionan 50 ml de etanol acuoso al 50%, se
dejan macerar en vasos de precipitado, recubiertos con film y papel de aluminio, a
temperatura ambiente, durante 24 hs. Posteriormente se filtran al vacío y al residuo
remanente se le adicionan 50 ml de solvente fresco. Se repite el proceso estimando 48
hs de maceración. Los extractos obtenidos de la primera y segunda maceración se
combinan y el volumen final de cada extracto se divide en dos alícuotas de 50 ml,
medidos en matraz aforado. Una de las alícuotas se destina para la cuantificación de
polifenoles, ortodifenoles y para calcular actividad antioxidante, la otra se utiliza para
determinar la cantidad de sólidos totales. Las muestras se almacenan en recipientes
ámbar para mayor protección contra la luz a una temperatura de 5-10 ºC.
El procedimiento se repite para la obtención de los extractos con acetato de etilo
(Anexo 4; Fotos A.4.7 a A.4.28).
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
I. Recta de calibrado
Se prepara una solución de ácido cafeico de 210 ppm. A partir de ésta se calculan los
volúmenes apropiados para preparar 25 ml de soluciones patrones de 0.0; 2.0; 4.0; 8.0;
12.0; 16.0 ppm (Tabla 2.1).
Luego se llevan a matraz aforado de 25 ml en los que previamente se adicionan 10 ml
de agua bidestilada, se someten a reacción con 1,25 ml de Folín Ciocalteu. Se agita
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
Estas soluciones se mantienen en oscuridad durante una hora para que se complete la
reacción. Se mide la absorbancia de cada muestra patrón en espectrofotómetro a
longitud de onda de 725 nm. Una vez obtenidos los datos de absorbancia, se construye
la recta de calibrado.
II. Determinación de la concentración de polifenoles en los extractos de hoja y madera
de olivo
Se miden 10 ml de agua bidestilada, se llevan a matraz aforado de 25 ml y se adiciona
0,1 ml de extracto. Se agrega 1 ml de reactivo Folín Ciocalteu, se agita vigorosamente y
se deja reposar por tres minutos. Por último se agregan 2,5 ml de Na2CO3 saturado y se
enrasan con agua bidestilada. Estas soluciones se mantienen en oscuridad durante una
hora para que se complete la reacción. Se mide la absorbancia de cada muestra en
espectrofotómetro a longitud de onda de 725 nm.
Cálculo: ppm PFT = L x VD x VT/(VA x MM)
Donde: L: Lectura de la curva en ppm.
VD: Volumen de dilución.
VT: Volumen total de extracto.
VA: Volumen de la alícuota.
MM: Masa de la muestra.
c. Ortodifenoles
Método de molibdato de sodio.
Reactivos:
Ácido cafeico
Agua bidestilada
Extractos hoja- etanol 50% (EHE)
Extractos hoja- acetato de etilo (EHAc)
Extractos madera- etanol 50% (EME)
Extracto madera- acetato de etilo (EMAc)
Solución de molibdato de sodio al 5 % en etanol al 50%
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
I. Recta de calibrado
Se prepara una solución de ácido cafeico de 210 ppm. A partir de ésta se miden los
volúmenes apropiados para preparar 10 ml de soluciones patrones de 0.0; 2.0; 4.0; 8.0;
12.0; 16.0 ppm (Tabla 2.2).
Concentración Volumen
(ppm) (ml)
0.0 0
2.0 0,095
4.0 0,190
8.0 0,380
12.0 0,570
16.0 0,760
Tabla 2.2. Volúmenes para preparar 10 ml de soluciones patrones de ODF.
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
Los gráficos 2.1 y 2.2 muestran las medianas de los rendimientos en ST, PFT y ODF de
los extractos etanólicos y con acetato de etilo de las hojas de olivo.
HE 25,53
ST/ %
La extracción de los principios activos a partir de las hojas de olivo por maceración con
etanol acuoso al 50 %, manifiesta un rendimiento significativamente superior en ST
(p<0,0079) respecto de los macerados con acetato de etilo en un 72,30 % (Tabla 2.4;
Gráfico 2.1).
5018,80
HAc
10562,84
PFT ODF
Extractos
17401,08
HE
27467,65
Igualmente, son los extractos etanólicos los que muestran rendimientos en PFT y ODF
significativamente superiores (p<0,0079) que los macerados en acetato de etilo, tal
como evidencian la tabla 2.4 y gráfico 2.2. La concentración de PFT registrada en los
extractos etanólicos de hojas de olivo, se impone en un 61,54% sobre los fenoles
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
Extractos
Medidas
Parámetros
descriptivas ME MAc
Máx 18,07 3,64
Mín 13,88 2,34
Sólidos Mediana 17,54 3,00
Totales
(%) Media 17,21 2,96
DE 1,20 0,47
CV% 6,97 6,30
Máx 21246,00 6087,78
Polifenoles Mín 18520,01 4792,79
Totales Mediana 18938,85 5395,13
(mg de ácido
cafeico kg - 1 Media 19635,51 5412,26
de madera) DE 1293,02 476,42
CV% 6,58 8,80
Máx 7708,75 4512,18
O-difenoles Mín 7202,78 2360,35
(mg de ácido Mediana 7313,85 3463,80
cafeico kg - 1 Media 7422,45 3453,65
de madera) DE 278,76 762,31
CV% 3,76 22,07
Tabla 2.5. Medidas descriptivas de los rendimientos en ST, PFT y ODF de los extractos etanólicos y
con acetato de etilo de madera de olivo.
Analizando la tabla 2.5 se observa que las DE calculadas son elevadas y por ello se
decide trabajar con las medianas para realizar el análisis estadístico.
En la tabla 2.6 se exhiben las medianas de los rendimientos en ST, PFT y ODF para los
extractos etanólicos y con acetato de etilo con las diferencias estadísticas respectivas,
calculadas mediante el análisis unilateral da varianza por rangos de Kruskal Wallis.
(Anexo 3, Tablas A.3.3.4 a A.3.3.6).
Extractos Medianas*
ST PFT ODF
ME 17,54 A 18938,85A 7313,85 A
MAc 3,00 B 5395,13 B 3463,80 B
% Diferencia de extracción por solvente 82,90 71,51 52,64
* Letras distintas indican diferencias significativas al 5%
Tabla 2.6. Medianas de rendimientos en ST, PFT, ODF de los extractos etanólicos y con acetato de
etilo de madera de olivo.
Los gráficos 2.3 y 2.4 muestran las medianas de los rendimientos en ST, PFT y ODF de
los extractos etanólicos y con acetato de etilo de madera de olivo.
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Extractos
ME 17,54
ST/ %
7313,85
ME
18938,85
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
De acuerdo con el análisis estadístico el rendimiento en PFT y ODF del etanol acuoso
es significativamente superior al acetato de etilo tanto en hoja como en madera de olivo
(p<0,0079, en ambas variables) (Tablas 2.4 y 2.6). El mayor poder extractivo del etanol
frente al acetato de etilo sobre compuestos fenólicos de diferentes fuentes vegetales fue
registrado recientemente por otros autores para madera y hoja de olivo cultivado bajo
[3] [4]
las condiciones edafoclimáticas del mediterráneo y sobre soja y salvado de avena
(Tabla 2.8), coincidiendo con los resultados obtenidos en la presente tesis para residuos
de poda de Arbequina, cultivadas en zonas cálidas.
MAc 3,00
HE ME
ME 17,54
HE 25,53
ST/ %
Gráfico 2.5. Medianas de los rendimientos en ST de los extractos MAc, HAc, ME y HE.
3463,80
MAc
5395,13
ODF
5018,80
PFT
HAc
Extractos
10562,84
7313,85
ME
18938,85
17401,08
HE
27467,65
Gráfico 2.6. Medianas de los rendimientos en PFT y ODF de los extractos MAc, HAc, ME y HE.
En función de lo expuesto, se puede concluir que existe una mayor afinidad entre las
estructuras fenólicas presentes en los dos residuos vegetales y el etanol acuoso al 50 %,
lo que confirma la naturaleza polar de los fenoles presentes en ambos materiales. Queda
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comprobado además, que los residuos foliares del cultivar Arbequina presentan un
rendimiento significativamente superior en ST (p<0,0079), PFT (p<0,0079) y ODF
(p<0,0079 y p <0,0159), tanto en etanol acuoso al 50% como en acetato de etilo que la
madera de la misma variedad (Tabla 2.7 y Gráficos 2.5 y 2.6).
Un análisis más profundo de los rendimientos fenólicos revela que en los extractos la
mayor proporción de ODF no siempre coincide con la mayor concentración en PFT y en
ODF. Así, en el caso de los extractos MAc, que registra concentraciones en PFT y ODF
inferiores al resto de los extractos ensayados, es el que contiene mayor proporción de
ODF, ya que un 64,20% de los fenoles totales cuantificados resultan ser ODF, por lo
que se esperaría que este extracto manifieste la mejor propiedad antioxidante frente a un
sistema radicalario. El extracto HE, con los contenidos más elevados en PFT y ODF es
el que le sigue en este aspecto al extracto MAc con un 63,35% de ODF sobre el total de
PFT. En el caso del extracto HAc un 47,51% de los PFT son ODF y en ME este
porcentaje baja a un 38,62% (Tabla 2.4 y 2.6).
En síntesis, en base a los resultados registrados en el presente estudio, se puede estimar
que con acetato de etilo se puede llegar a extraer por kilogramo de residuo 18,94 g de
PFT en hoja y 5,40 g de estos compuestos bioactivos en la madera. En tanto, con el
etanol acuoso puede llegar a obtenerse para la hoja y madera respectivamente 27,48 g y
10,56 g de fitofenoles por kilogramo de residuo, lo que incrementa el interés del estudio
de la potencialidad de los extractos para contrarrestar la acción de RL sobre diferentes
sustratos. Por otra parte, cabe señalar que desde el punto de vista de las posibles
aplicaciones de los extractos como conservantes de productos alimenticios o su empleo
en la industria farmacológica y cosmetológica, el mayor poder extractivo de la mezcla
etanólica acuosa resulta positivo debido a la inocuidad del etanol y la toxicidad e
inflamabilidad del acetato de etilo. Resta comprobar la actividad antioxidante de los
extractos sobre distintos sistemas radicalarios.
En los capítulos 3 y 4 se analiza la incidencia de las propiedades antioxidantes de los
extractos frente a dos sistemas radicalarios diferentes, solución metanólica de DPPH y
aceite de oliva virgen sometido a condiciones forzadas de oxidación, respectivamente.
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Capítulo II: Extracción de compuestos polifenólicos
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[2]. Waterman P y Mole S. (1994). “Methods in ecology. Analysis of phenolic plant
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[3]. Pérez-Bonilla M., Salido S., Linares P., van Beek T., Altarejos J., Nogueras M.,
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naturales”. Foro de la tecnología oleícola y la calidad. Código TEC-26. Disponible en:
<http://www.expoliva.com/expoliva2003/simposium/com.asp?anio=2003&codigo=TE
C>.
[4]. Janczuk L., Gutiérrez M., Della Rocca P. (2007). “Antioxidantes naturales en
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[5]. Vázquez A., Janer del Valle C., Janer del Valle M. (1975). “Polifenoles naturales y
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