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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN


FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISIS DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS DE ESPECIES


MEXICANAS DE ANÍS Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD
BIOLÓGICA SOBRE MICROORGANISMOS PATÓGENOS

POR
QBP. YADIRA QUIÑONES GUTIÉRREZ

TESIS QUE PRESENTA COMO REQUISITO PARCIAL


PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS
CON ACENTUACIÓN EN QUÍMICA DE PRODUCTOS
NATURALES

SAN NICOLÁS DE LOS GARZA, N.L. NOVIEMBRE DE 2012

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

ANÁLISIS DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS DE ESPECIES


MEXICANAS DE ANÍS Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD
BIOLÓGICA SOBRE MICROORGANISMOS PATÓGENOS

Aprobación de la Tesis

_________________________________________
Presidente: Dra. María Julia Verde Star

_________________________________________
Secretario: Dra. Catalina Rivas Morales

_________________________________________
Vocal: Dra. Azucena Oranday Cárdenas

_________________________________________
Vocal: Dr. Abelardo Chávez Montes

_________________________________________
Vocal: Dr. Roberto Mercado Hernández

SAN NICOLÁS DE LOS GARZA, N.L. NOVIEMBRE DE 2012

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ANÁLISIS DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS DE ESPECIES


MEXICANAS DE ANÍS Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD
BIOLÓGICA SOBRE MICROORGANISMOS PATÓGENOS

POR

QBP. YADIRA QUIÑONES GUTIERREZ

Que presenta como requisito parcial

para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS con

Acentuación en QUÍMICA DE PRODUCTOS NATURALES

Este trabajo fue realizado en los Laboratorios de Fitoquímica y Química Analítica


del Departamento de Química y en el Laboratorio de Biología Celular del
Departamento de Biología Celular y Genética de la Facultad de Ciencias Biológicas
de la Universidad Autónoma de Nuevo León, bajo la dirección de:

Dra. María Julia Verde Star


Director

Dra. Ma. Porfiría Barrón González


Asesor

SAN NICOLÁS DE LOS GARZA, N.L. NOVIEMBRE DE 2012

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DEDICATORIA

Para quienes son mi vida entera:


A mi Madre, porque gracias a ti soy quien soy, por tu ejemplo de
fortaleza y humanidad, porque siempre me motivaste en cada proyecto
de mi vida y aun con tu ausencia física y desde el cielo sigues
dándome vida…te extraño y te amo siempre.
A mis hijos Josafat y Brayan la razón de mi existir, no existe otra
palabra si no se las diría …los amo.
Al compañero de mi vida Cesar por que siempre has estado a mi lado
en las buenas y en las malas, hoy te sigo amando con todo mi corazón.
Gracias por darme la oportunidad de conocer dos mundos maravillosos
a tu lado.
A mi pequeñita Anita, mi yuyu, porque tu y yo tenemos un pacto y
amarnos siempre será nuestro gran secreto.
A Luz, Edgar, Enoc porque aunque los kilómetros nos separen, al
amor de hermanos siempre nos acercaran.
A mi tia tere, tia tita, fabis por estar al pendiente de mi y de mis
hijos.

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AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología becario No. 204368, por la beca que
me fue otorgada.

Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

Departamento de Química: Laboratorios de Fitoquímica y Química Analítica

Departamento de Biología y Genética: Laboratorio de Biología Celular

Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

Laboratorio de Química Analítica

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra.Ma. Julia Verde Star, por ser ejemplo a seguir de que lo humano y lo
profesional si pueden ir de la mano hacia el éxito, gracias Dios por tener tanto
espacio en este mundo y darme la oportunidad de coincidir con ella, mil gracias
Doctora Julia.

A la Dra.Catalina Rivas Morales, gracias doctora por su disposición de compartir


toda su experiencia, por ser un ejemplo con su trayectoria y sobre todo por
motivarme siempre a culminar este proyecto.

A la Dra.Azucena Oranday Cardenas, gracias por compartir su conocimientos y por


darme los consejos y palabras de apoyo que me llevaban a pensar positivo y darme
aliento a seguir adelante.

A la Dra.María Porfiria Barrón González, infinitamente gracias por su incondicional


ayuda a la elaborar este trabajo, por enseñarme a retomar ideas y seguir siempre
adelante, por esas largas tardes de trabajo, mil gracias.

Al Dr.Abelardo Chávez Montes, por sus acertados consejos y por su disposición


para realizar este trabajo

Al Dr Roberto Mercado Hernández, por su disposición para este trabajo siempre con
una actitud de profesionalismo y humana.

A Carmen Vázquez por compartir la mesa de trabajo, de comida, de risa y de llantos,


muchísimas gracias.

A la Lic.Denis, Ing.Martha, Ing.Luis, Dr.Balde, porque dentro de nuestras loqueras


siempre están al pie del cañon, para hacerme sonreir, gracias que haría yo sin esas
sonrisas de lunes a viernes.

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TABLA DE CONTENIDO

Agradecimientos v

Tabla de contenido vii

Lista de figuras xi

Lista de tablas xiii

Nomenclatura xiv

Resumen y Abstract xv

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN 1

2. HIPÓTESIS 5

3. OBJETIVOS 6

3.1 Objetivo general 6

3.2 Objetivos específicos 6

4. ANTECEDENTES 8

4.1 Uso de plantas medicinales 8

4.2 Efectos de los extractos de plantas sobre bacterias 11

4.3 Efectos de los extractos de plantas sobre E.histolytica 12

4.4 Plantas en estudio 14

4.4.1 Illicium anisatum 14

4.4.2 Pimpinella anisum 17

4.4.3 Illicium verum 20

5. MATERIAL Y MÉTODOS
25

5.1 Colecta e identificación de material vegetal de estudio 25

5.2 Extracción Soxhlet 25

5.2.1 Obtención de los extractos de las plantas en estudio 26

5.3 Pruebas para la determinación de la actividad antibacteriana de los


extractos 27

5.3.1 Activación de las bacterias 28

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5.3.2 Cultivo de bacterias 28

5.3.3 Determinación de la actividad antimicrobiana 28

5.4 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los


extractos que muestran actividad biológica 29

5.5 Identificación de las fracciones con actividad bacteriana 30

5.5.1 Cromatografía de capa delgada de los extractos con concentración

mínima inhibitoria relevante para la separación de fracciones 30

5.5.2 Identificación de fracciones activas 31

5.6 Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50) sobre


E. histolytica HM1-IMSS, bajo condiciones axénicas in vitro 32

5.6.1 Cinética de Crecimiento 32

5.6.2 Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50) 33

5.6.2.1 Illicium anisatum 33

5.6.2.2 Pimpinella anisum 33

5.6.2.3 Illicium verum 33

5.6.3 Evaluación de la actividad antiamibiana de las fracciones del


extracto metanólico de P. anisum. 35

5.7 Identificación parcial de los componentes de los extractos


36
5.7.1 Identificación de grupos funcionales
36
5.8 Análisis Estadísticos
40
5.9 Análisis espectroscópicos
41
5.9.1 Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
42
5.9.2 Espectroscopía de masas

6. RESULTADOS

6.1 Extractos vegetales


43

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6.1.1 Obtención de extractos metanólicos y hexánicos de P.anisum.I.


anisatum,I.verum 43

6.1.2 Identificación parcial del compuestos de plantas en estudio 44

6.2 Actividad bactericida de los extractos de las plantas en estudio 45

6.3 Actividad amebicida de los extractos metanólicos y hexánicos de


P.anisum, I. anisatum e I.verum sobre Entamoeba histolytica 47

6.3.1 Cinética de crecimiento 47

6.3.2 Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50) 48

6.4 Separación de fracciones por cromatografía del extracto metanólico


P. anisum 53

6.5 Evaluación de la fracción del extracto metanólico de P.anisum 54

6.5.1 Evaluación de actividad antibacteriana de las fracciones del extracto 54


metanólico de P. anisum

6.5.2 Evaluación de actividad antimibiana de las fracciones del extracto


metanólico de P. anisum 55

6.6 Análisis espectroscópicos del compuesto obtenido de una fracción del 56


extracto P. anisum

6.6.1 Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear


56
6.6.2 Espectroscopia de masas
61

7. DISCUSIÓN 62

8. CONCLUSIONES 68

9. LITERATURA CITADA 70

10. APÉNDICES 83

10.1 Resumen Curricular 84

10.2 Artículo 85

x
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LISTA DE FIGURAS

No. DESCRIPCIÓN PÁGINA

1 Illicium anisatum (anís estrellado japonés o badiana de Japón) 14

Imagen foliar de P. anisum (anís verde) (a) e imagen de la


2 17
semilla (b).
.

Illicium verum (anís estrellado, anís estrellado chino, badiana


3 de China) 20

25
4 Extractor Soxhlet

5 Diagrama de obtención de los extractos 26

6 Determinación de la actividad antimicrobiana 29

7 Cromatográfia en capa fina 31

Determinación Concentración Inhibitoria Media(CI50) sobre E


8
histolytica 34

Cinética de crecimiento de E. histolytica HM1-IMSS


9 47

CI50 de los extractos metanólico y hexánico de P. anisum, I.


verum e I. anisatum sobre el cultivo axénico in vitro de E.
10 49
histolytica HM1-IMSS.

Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto metanólico


11 50
del fruto de P. anisum sobre E. histolytica HM1-IMSS.

12 50
Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto metanólico

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del fruto de I.llicium verum sobre E. histolytica HM1-IMSS

Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto


13 metanólico del fruto de I. anisatum sobre E. histolytica HM1- 51
IMSS.

Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto hexánico


14 51
del fruto de I. anisatum sobre E. histolytica HM1-IMSS

Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto hexánico 52


15
del fruto de I. verum sobre E. histolytica HM1-IMSS.

Determinación de CMI de la fracción del extracto metanólico


16 54
de P.anisum con actividad sobre E. coli

Actividad antiamibiana de fracciones de extracto metanólico de


17 55
P. anisum

Espectro de 1H-RMN (499 MHz) General del Compuesto 56


18
obtenido de una fracción del extracto de P. anisum

Espectro de 1H-RMN(499 MHz) General del Compuesto


19 57
obtenido de una la fracción 7 del extracto de P. anisum

Ampliación del Espectro de 1H-RMN del Compuesto obtenido


20 57
de una fracción del extracto de P. anisum

Espectro COSY del Compuesto obtenido de una fracción del


21 59
extracto de P. anisum

Espectro de Masas General del Compuesto obtenido de una


22 61
fracción del extracto de P. anisum

Estructura propuesta para el compuesto obtenido de una 61


23
fracción del extracto de P. anisum

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LISTA DE TABLAS

No.
DESCRIPCIÓN PÁGINA
TABLA

I Microorganismos utilizados 27

II Procedimiento para realizar las pruebas de 36


identificación química

Rendimiento de los extractos y parte utilizada de las


III 43
plantas

Grupos funcionales de los extractos metanólicos y


IV 44
hexánicos de I. anisatum, P. anisum e I. verum.

Actividad antibacteriana de los extractos metanólicos


V 45
de las plantas en estudio sobre bacterias patógenas.

Actividad antibacteriana de los extractos hexánicos


VI 46
sobre bacterias patógenas

Comparación del valo CI50 de los extractos metanólico


VII 48
y hexánicos de las plantas en estudio

VIII Fracciones obtenidas de el extracto metanólico de 53


P. anisum

Datos espectroscópicos de 1H-RMN del compuesto de


IX 58
la fracción siete del extracto metanólico de P. anisum

Correlación del espectro COSY del compuesto


X obtenido de la fracción siete del extracto metanólico de 60
P. anisum

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ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

Abs Absorbancia
% Porciento
°C Grados centígrados
cel Células
CCF Cromatografía en capa fina
CI50 Concentración Inhibitoria Media
cm Centímetros
CMI Concentración Mínima Inhibitoria
COSY Correlation Spectroscopy
1
H-RMN Resonancia Magnética Nuclear de Protones
13
C-RMN Resonancia Magnética Nuclear de Carbono-13
d Días
δ Desplazamiento Químico
g Gramos
G Tiempo de generación
h Horas
IR Infrarrojo
m Metros
MeOH Metanol
MHz Megahertz
mg Miligramos
min Minutos
ml Mililitros
mm Mililitros
nm Nanómetros
OMS Organización Mundial de la Salud
P/E Penicilina/Estreptomicina
PAHO Pan American Health Organization
RMN Resonancia Magnética Nuclear
UFC Unidades formadoras de colonias
UV Ultravioleta
WHO World Health Organization
µg Microgramos
µl Microlitros

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RESUMEN

Debido al uso indiscriminado de medicamentos para el control de enfermedades

causadas por microorganismos patógenos al hombre, éstos han desarrollado drogo–

resistencia, por lo que los productos naturales de plantas representan una alternativa

para el control de enfermedades que aquejan al género humano, la Organización

Mundial de la Salud registra que un 80% de la población mundial depende de la

medicina tradicional para su atención primaria. En este trabajo fueron evaluadas las

actividades bactericida y amebicida de extractos metanólicos y hexánicos de

diferentes especies mexicanas conocidas como anís (Illicium anisatum, Pimpinella

anisum e Illicium verum) e identificada parcialmente la presencia de compuestos

químicos en los extractos, los cuales mostraron actividad bactericida contra Bacillus

subtilis, Salmonella sp., Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Escherichia coli,

Staphilococcus aureus y Salmonella typhi ; estos extractos también mostraron

actividad inhibitoria sobre el crecimiento axénico in vitro de E. histolytica HM1-

IMSS. Mediante separación por cromatografía en capa fina del extracto metanólico

de P.anisum se aisló una fracción que presentó la mayor actividad amebicida con

una CI50 = 0.034 µg/mL. Empleando las técnicas 1HRMN y 13


CRMN se identificó

que el metabolito secundario de P.anisum con actividad amebicida es el 1-

benzopirilio(C11H11O2), el cual está ampliamente distribuido en las plantas, los

resultados obtenidos son prometedores para continuar con futuras investigaciones

para la obtención de metabolitos para el desarrollo de nuevos agentes

quimioterapéuticos.

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

ABSTRACT

Due to the indiscriminate use of medications for the control of diseases caused by

micro-organisms pathogenic to man, these have developed drug-resistance, by which

natural products from plants represent an alternative for the control of diseases that

afflict mankind, the World Health Organization (WHO) reports that 80% of the

world's population depends on traditional medicine for their primary care. In this

work were evaluated the bactericidal and amebicidal activities of methanol and

hexan extracts of different Mexican species known as anise (Illicium anisatum,

Pimpinella anisum e Illicium verum) and partially identified the presence of chemical

compounds in the extracts, which showed activity bactericide against some of the

microorganisms tested by disk diffusion technique, Bacillus subtilis, Salmonella sp.,

Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Salmonella typhi, these extracts also showed activity against E.histolytica HM1-

IMSS under axenic conditions in vitro, through separation by thin layer

chromatography of P.anisum methanol extract ,was isolated a fraction that presented

the highest amebicidal activity with an IC50 = 0.034 µg/mL. Using the 1HRMN and
13
CRMN techniques has been identified that the secondary metabolite of P.anisum

with amebicidal activity is 1-benzopyrylium (C11H11O2), found widely distributed in

plants, the results obtained are promising to continue with future research to obtain

metabolites for the development of new chemotherapeutic agents

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1. INTRODUCCIÓN

El uso de las plantas como una fuente medicinal se ha utilizado desde

inmemorables tiempos (50,000 años a.c.) hasta la fecha ya que se han encontrado

evidencias que los Vedas, Mesopotamia, Asirios, han utilizado estas fuentes

naturales como remedios o medicamentos que han curado sus enfermedades

(Yesilada, 2005). En las plantas existen compuestos químicos que sirven como

sistemas de protección y para tratamientos de enfermedades, por lo tanto es

importante investigar las propiedades curativas de éstas, y conocer las

substancias activas llamadas líderes las que después de ser modificadas

químicamente se utilizan en contra de diferentes enfermedades. La posibilidad de

encontrar compuestos activos dentro de los productos naturales que nos ofrezcan a

los seres humanos tratamientos que no sean más toxicas para los órganos del ser

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humano que para el microorganismo a tratar es de vital importancia (Phillipson

J.D.,1994).

Nuestro México es considerado como un país tolerante en referencia al uso de

la medicina tradicional y otras formas de atención medica no institucionales, sin

embargo el que la medicina tradicional mexicana no tenga reconocimiento oficial

nos dificulta

determinar el número real de mexicanos que recurren a ella para tratar sus

enfermedades.

En las últimas tres décadas ha renacido el interés por los productos naturales

y sus posibles aplicaciones en la industria farmacéutica en su búsqueda de nuevos

medicamentos más eficientes (Butler, 2004), importante es señalar que cerca del 30%

de los fármacos empleados en los países industrializados proceden o se han

modelado a partir de productos vegetales (Newman y Cragg, 2007), por lo que

debemos valorar a las plantas como una fuente importante para la producción de

medicamentos.

Todas las plantas contienen familias de compuestos relacionados, llamados

metabolitos secundarios, que interaccionan y dan como resultado efectos biológicos

(Heber, 2007; Sarker et al., 2006). El hecho del porque en nuestra actualidad las

plantas sean una alternativa importante para la obtención de nuevas e importantes

drogas o compuestos semisintéticos, para varias naciones como China, Nigeria,

Tailandia, México podría ser tal vez debido a la presencia de drogo-resistencia que

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presentan los microorganismos, el uso indiscriminado de drogas, el difícil acceso a

tratamientos convencionales farmacológicos por su elevado costo o disponibilidad

(Rates, 2000).

Dentro de las afecciones microbianas a las cuales se enfrenta la población, se

encuentran las afecciones de origen bacteriano, parasitarias, virales, micóticas,

principalmente.

Una de las afecciones parasitarias y considerada dentro del grupo

enfermedades olvidadas por parte de la OMS se encuentra la amibiasis, ocasionada

por Entamoeba histolytica. La amibiasis tiene una distribución cosmopolita y es

considerada como una infección endémica con una incidencia mundial del 12%

(Petri et al., 2000). En México representa un problema muy importante de salud

pública por su frecuencia y mortalidad (Gutiérrez y Muñoz; 1994). El sistema

nacional de vigilancia epidemiológica reportó 25,766 casos de amibiasis intestinal

durante 2012 y de los cuales 388 correspondieron al estado de Nuevo León

(Epidemiología SS; 2005). Entamoeba histolytica presenta resistencia al

metronidazol, considerada el fármaco sistémico de elección, es por ello busca alguna

fuente alternativa de origen natural que no presente efectos secundarios al ser

humano.

En años recientes, la población mundial ha aumentado su interés en usar

drogas naturales y terapias alternativas obtenidas de plantas como infusiones

herbales, extractos etanólicos, metanólicos, clorofórmicos, tinturas, suplementos

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

alimenticios, fitofarmacéuticos y productos farmacéuticos (American Medical

Association, 1997).

México es un país en donde su población tiene una relación estrecha en el uso

de la medicina tradicional, por tal motivo es de gran importancia aportar

científicamente evidencias que avalen su empleo, así como con ayuda de la

fitoquímica, determinar las estructuras responsables de la actividad biológica y

encontrar las posibles aplicaciones. Lo que puede permitir una mayor disponibilidad

de agentes quimioterapéuticos que sean más efectivos, menos tóxicos y que ofrezcan

un menor costo del tratamiento en regiones endémicas.

El objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad antibacteriana y

amebicida de tres especies de anís contra microorganismos de importancia médica,

como una alternativa natural y avalar científicamente su uso como tratamiento

natural.

xx
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

2. HIPÓTESIS
Los extractos de las especies mexicanas de Anís: Illicium anisatum, Pimpinella

anisum e Illicium verum presentan actividad biológica sobre microorganismos

patógenos para el hombre.

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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General

Obtener y caracterizar compuestos activos de las especies mexicanas de anís: Illicium

anisatum, Pimpinella anisum e Illicium verum y evaluar su actividad biológica

sobre microorganismos patógenos para el humano.

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

3.2 Objetivos Específicos

 Obtener del material vegetal de diferentes especies de anís: Illicium anisatum,

Pimpinella anisum e Illicium verum e identificarlas taxonómicamente.

 Obtener los extractos hexánico y metanólico del material vegetal en estudio.

 Evaluar la actividad bactericida de los extractos obtenidos de las diferentes

especies de anís sobre Bacillus subtilis, Salmonella sp., Bacillus cereus,

Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphilococcus aureus y Salmonella

typhi.

 Evaluar la actividad antiprotozoariia de los extractos obtenidos de las

diferentes especies de anís sobre Entamoeba histolytica HM1-IMSS.

 Determinar la CI50 de los extractos activos sobre Entamoeba histolytica cepa

HM1-IMSS bajo condiciones axénicas in vitro.

 Separar mediante cromatografía en capa delgada los extractos con actividad

biológica relevante e identificar las fracciones activas contra

microorganismos patógenos.

 Obtener la concentración mínima inhibitoria de las fracciones activas.

 Identificar parcialmente los compuestos que presentan actividad biológica

relevante sobre los microorganismos estudiados mediante Análisis

espectroscópicos.

xxiii
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4.ANTECEDENTES

4.1 Uso de plantas medicinales

Sin duda alguna el reino vegetal nos ofrece una mayor variedad de sustancias

potencialmente útiles aplicables a las enfermedades humanas, en la actualidad se

contempla como una alternativa, pero el uso de compuestos naturales obtenidos

de plantas data de mucho tiempo atrás. Existen pruebas de que los hombres del

Neandertal que ocuparon Irak hace 60.000 años usaban plantas con fines

medicinales (Stockwell, 1998). Posteriormente contemplamos ejemplos bien

documentados como Hipócrates en la medicina griega, Avicena en la árabe y

Paracelso en la centroeuropea que han sido documentados como auténticos

especialistas en la aplicación de las plantas en medicina (Domingo et al, 2003).

El empleo empírico y conocimiento de las propiedades farmáceuticas se conoce

en América desde antes de la llegada de los españoles (González Ferrara, 1998).

Nadie sabe exactamente donde se originó el uso de las plantas medicinales

por primera vez, seguramente la búsqueda de algún remedio fue algo que se dio

en todas las culturas a la vez, fruto del deseo de sanar. La mayoría de las veces

los descubrimientos fueron simplemente resultado de la búsqueda de nuevos

alimentos, los antepasados tenían que comprobar si las nuevas especies eran

comestibles lo que les llevaba a descubrir en su propio cuerpo que muchas de

ellos eran evidentemente comestibles; otros venenosos y otros producían efectos

diferentes. Los conocimientos de las plantas medicinales se escribieron por

xxiv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

primera vez hace unos 4000 años y aparece en una tablilla de arcilla en la cultura

de los Sumerios, un antiguo pueblo que vivía al sur de los ríos Éufrates y Tigris,

lo que hoy en la actualidad es Iraq. Se conocen más de 700 formulas en las que

aparecen estas plantas y el documento impreso más interesante es el Papiro de

Ebers, el año 1700 A.C., y trata sobre el uso de las plantas, indicaciones al

médico sobre la preparación e indicaciones al paciente sobre su uso (Panoto-S.,

2007).

Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los

países en desarrollo. Aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión

del uso global de plantas medicinales, la Organización Mundial de la Salud

(OMS) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza,

rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de

atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales

implica el uso de extractos de plantas o sus principios activos (Akerele, 1993;

Sheldon et al., 1997; Shrestha y Dhillion, 2003; Katewa et al., 2004). De

acuerdo a la OMS (1979) una planta medicinal es definida como cualquier

especie vegetal que contiene sustancias que pueden ser empleadas para

propósitos terapéuticos o cuyos principios activos pueden servir de precursores

para la síntesis de nuevos fármacos. Estas plantas también tienen importantes

aplicaciones en la medicina moderna.

Entre otras, son fuente directa de agentes terapéuticos, se emplean como

materia prima para la fabricación de medicamentos semisintéticos más

complejos, la estructura química de sus principios activos puede servir de

modelo para la elaboración de drogas sintéticas y tales principios se pueden

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

utilizar como marcadores taxonómicos en la búsqueda de nuevos medicamentos

(Akerele, 1993).

En México, la historia de la medicina herbolaria se remonta más allá de la

época precolombina, actualmente representa una alternativa económica en el

cuidado de la salud (FHEUM, 2001).

En los últimos años las infecciones causadas por microorganismos se han

incrementado debido diferentes causas como al aumento de pacientes

inmunodeprimidos, uso frecuente de procedimientos como la diálisis, a

tratamientos prolongados con antibióticos de amplio espectro (Mesa Arango,

2004).

La gran producción de la penicilina en la década de los años cuarenta dio

inicio al gran auge con los antibióticos este se probó en cerdos en dosis

subterapéuticas como promotor de crecimiento. Los antibióticos son sustancias

químicas producidos por especies de microorganismos o sintetizados por

métodos químicos, cuya función es suprimir el crecimiento de otros

microorganismos y eventualmente destruirlos (Patiño , 2003).

4.2 Efectos de los extractos de plantas sobre bacterias

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Se han realizado diversos estudios de los extractos de plantas sobre los

efectos inhibitorios del crecimiento de muchas bacterias. En 1995 se estudiaron

los extractos metanólicos de Camellia sinensis L. y de Euphorbia hirta L., donde

se observó que estos extractos presentaron efecto contra la disentería causada

por Shigella spp, además de no ser citotóxicos sobre el hospedero (Vijaya y

Nalini, 1995). Posteriormente en 1996 se estudiaron 20 extractos metanólicos de

plantas contra S. aureus, E.coli, P. aeruginosa y C. albicans, los resultados

mostraron que los extractos de Eucaliptus globolus, Punica granatum, Artemisia

mexicana y Bocconia arborea poseen actividad contra estas bacterias (Navarro

et al., 1996). En 1997, se investigaron 15 extractos de plantas de la familia

Chenopodiáceas donde analizaron alcaloides, antraquinonas, cumarinas,

flavonoides, saponinas, esteroles y/o terpenos y taninos, y se encontró que en la

mayoría de los extractos tienen actividad antimicrobiana contra E.coli, P.

aeruginosa, S. aureus y B. subtilis (Alsaleh y et al., 1997).

4.3 Efecto de los extractos de plantas sobre E. histolytica

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La amibiasis es definida por WHO (World Health Organization) y PAHO

(Pan American Health Organization) como “la condición de portar al parásito

Entamoeba histolytica con o sin manifestaciones clínicas” (OMS, 1997).

La amibiasis es la segunda causa de muerte por enfermedades parasitarias en

el mundo (Stanley, 2003). Ésta es un importante problema en países en vía de

desarrollo y es responsable de aproximadamente de 40 000 a 100 000 muertes a

nivel mundial (Bharti et al ,2002; Long et al, 2007).

Este protozoario parásito tiene una distribución cosmopolita con mayor

prevalencia en los países en vías de desarrollo en donde imperan condiciones de

sanidad deficientes e inadecuadas; la mayoría de las infecciones son

asintomáticas y puede aparecer meses o años después de haber sido expuesto

(Pritt y Clark, 2008). En México, un estudio gubernamental reportó en el año

2003, 4 556 casos causados por infecciones intestinales (Paniagua et al, 2007).

Para el tratamiento de la amibiasis la droga de elección es el metronidazol y sus

derivados imidazoles, sin embargo; E. histolytica ha desarrollado un mecanismo

de resistencia a esta droga sistémica (Wassmann et al, 1999), Así mismo; se han

reportado cepas de E. histolytica que presentan multidrogorresistencia

(Orozco et al, 2002); por otra parte, Samarawickream, et al., 2007, reporta que

esta droga es mutagénica, carcinogénica y neurotóxica (en bacterias, hamsters y

gatos respectivamente).

Poco se ha estudiado sobre los efectos de los extractos de las plantas contra E.

histolytica. Las investigaciones serias comienzan desde 1990, con el extracto

acuoso de la planta Punica granatum L y el efecto de sus alcaloides y taninos.

xxviii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Estos extractos y compuestos se usaron a concentraciones de 1 a 1,000µg/mL e

inhibieron el crecimiento de E. histolytica y E. invadens (Segura et al., 1990).

Después no fue hasta 1995, cuando se estudió el efecto del extracto etanólico

de Boerhavia difusa, Berberis aristata, Tinospora cordifolia, Terminalia

chebula y Zingiber officinale (usadas en la India) contra E. histolytica

demostrando que solamente los extractos de T. cordifolia y B. aristata inhibieron

el crecimiento de este protozoario in vitro (Sohni et al., 1990).

4.4 Plantas en estudio

4.4.1 Illicium anisatum

La clasificación taxonómica de Illicium anisatum, según Hook, F. es la


siguiente:

Reino: Plantae

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Austrobaileyales
Familia: Illiciaceae
Género: Illicium
Especie: anisatum

Nombre binomial: Illicium anisatum

Fuente: www.wikipedia.org

Fig.1 I. anisatum (Anís estrellado japonés o badiana de Japón)

I. anisatum, comúnmente conocido como el anís estrellado japonés, es un

árbol pequeño con hojas anchas, miden 7.5 cm de largo, que algunas veces son

puntiagudas. Las flores son de color amarillo verdoso; sobre cortos soportes, los

pétalos son abundantes, angostos y extendidos, definitivamente no son

comestibles han sido reportados como altamente tóxico, sin embargo ha sido

utilizada quemándola como incienso en Japón, donde es conocido como

Shikimi.

xxx
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

I. anisatum es una planta considerada tóxica la cual se encuentra en la lista de

plantas de uso restringido según la orden SCO/190/2004 (MSC, 2004)

I. anisatum es nativo de Japón. Es similar a Illicium verum, pero su fruto es

más pequeño y más débil en su aroma, por lo que se dice que es más parecido a

la de cardamomo que a anís .

Además de contener un aceite esencial similar en algunos componentes al

presente I. verum aunque en menor cantidad, en sus frutos y semillas se ha

detectado la presencia de lactonas sesquiterpénicas (anisatina, neoanisatina,

pseudoanisatina y sus derivados) con un elevado potencial neurotóxico y una

toxicidad digestiva. Morfológicamente los frutos de esta especie tóxica son muy

similares a los de “badiana de China” motivo por el cual se hace necesario en

ocasiones, recurrir a técnicas sofisticadas para su identificación.

A pesar de que es tóxico y por lo tanto inadecuado para el uso interno, se

utiliza para el tratamiento de algunos problemas de la piel en la medicina

tradicional china, en inciensos.

Anís estrellado japonés contiene anisatin , shikimin y sikimitoxin , lo que causa

una inflamación severa de los riñones , vías urinarias y del aparato digestivo.

Otros compuestos presentes en las especies tóxicas de Illicium se safrol y

eugenol , que no están presentes en I. verum y se utilizan como una gran

herramienta de información para identificar su adulteración .

Es de gran relevancia las consecuencia cuando se utiliza I. verum adulterado

con I. anisatum ya que el uso elevado de esta especie puede provocar efectos

adversos aún más graves ya que estos frutos contienen anisatinas y

xxxi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

neoanisatinas, antagonistas no competitivos de los receptores A del ácido

gammaaminobutírico (GABA), reconocidas como el veneno más potente de

origen vegetal (Kakemoto et al.,1999).

4.4.2 Pimpinella anisum

La clasificación taxonómica de Pimpinella anisum, es la siguiente:

Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Apiales
Familia: Apiaceae
Género: Pimpinella
Especie: anisum
Nombre binomial: Pimpinella anisum

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

A B

Fig .2 Imagen foliar de Pimpinella anisum (anís verde ) (a) e imagen de la


semilla (b).

P.anisum es una planta con flores de la familia Apiaceae, nativa de la India y

el suroeste de Asia. Se trata de una planta anual que puede alcanzar hasta un

metro de altura. Las hojas en la base de la planta son simples, de 2-5 cm de largo

y lobuladas superficialmente, mientras que las hojas en los tallos son plumosas

pinnadas, divididas en numerosos folíolos. Las flores son blancas de 3 mm

diámetro, se produce en umbelas densas. El fruto es un esquizocarpo seco, que

mide 3-5 mm de largo, la floración se produce de junio a agosto y las flores

emanan un aroma dulce, se recolectan los frutos para extraer las semillas

El anís verde o P.anisum junto con otras plantas medicinales carminativas

tales como el hinojo, la menta, el comino, resulta muy eficaz para reducir la

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

hinchazón del vientre, evitar las flatulencias y eliminar las náuseas y el mal

aliento.

Originario del mediterráneo oriental, según algunos autores fue introducido

en España por los árabes en la Edad Media. Actualmente se cultiva en todos los

países de clima templado, siendo nuestro país uno de los principales productores.

P.anisum es una de las más antiguas plantas utilizadas en la industria

alimentaria, perfumería y medicina, se ha utilizado como estimulante digestivo,

antiparasitaria y antifúngica (Soliman 2002) y antipirético (Afifi et al., 1994).

Además, la planta y, especialmente, el aceite esencial de la fruta se han utilizado

para el tratamiento de algunas enfermedades como la epilepsia y convulsiones

(Avicena 1988, Abdul-Ghani et al., 1987). Además para el estreñimiento

(Chicouri 2000) y tiene una actividad como un relajante muscular (Albuquerque

et al., 1995). Recientemente, se ha informado de que este aceite se ha utilizado

como un sustituto de los antibióticos en pollos (Mehmet et al., 2005). Hay pocos

informes sobre los estudios de actividad antibacteriana de P. anisum (Singh et

al., 2002 y Tabanca et al., 2003).

Recientemente, A. Akhtar et al., en 2008, demostraron la actividad

bactericida del extracto de metanol de las semillas de P.anisum sobre

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli y Klebsiella

pneumoniae.

El principal principio activo que le confiere sus propiedades carminativas es

un aceite esencial rico en anetol. También contiene otras sustancias tales como

ácidos grasos, flavonoides (de acción antioxidante y antiinflamatoria), hidratos

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

de carbono o glúcidos, esteroles, proteínas y cumarinas. Por su particular

composición, es aperitivo y tiene la propiedad de mejorar las digestiones, reducir

la formación de gases y favorecer su expulsión, así como eliminar las náuseas y

el mal aliento. Por ello se recomienda principalmente en caso de inapetencia,

digestiones difíciles, flatulencia, gases y espasmos intestinales. Así mismo, en

infusión, es muy utilizado en problemas digestivos de lactantes.

4.4.3 Illicium verum

La clasificación taxonómica de I. verum, según Hook, F. es la siguiente:


Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Austrobaileyales o Illiciales
Familia: Illiciaceae
Género: Illicium
Especie: I. verum
Nombre binomial: Illicium verum

Fuente: www.wikipedia.org

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig. 3 Illicium verum (Anís estrellado, anís estrellado chino, badiana o badiana
de China)

I.verum también conocido como anís estrella, badián de la China o badiana es

originario de los bosques tropicales del sudeste asiático (sur de China y norte de

Vietnam), se cultiva en China, Filipinas y Jamaica. La vida media del árbol es

de 80-100 años. Es un árbol pequeño de 3-5 m de altura y una longitud de 5-10

cm, es perennifolio, con corteza blanca y hojas lanceoladas enteras. Flores

amarillo- rosados, pueden tener hasta 30 pétalos. Las flores producen un fruto en

forma de estrella. Los frutos son de color oscuro, miden cerca de 2 cm de

diámetro y parecen estrella formadas de ocho carpelos careniformes de 1 a 1.5

cm de longitud que al madurar abren. Cada carpelo contiene una semilla suave,

xxxvi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

café y brillosa. El pericarpio es marrón y está arrugado por debajo florece en

primavera, cuando comienzan las primeras lluvias (Barceloux, 2008).

De la recolección con fines medicinales interesan los frutos y los folículos;

una vez recogidos, se ponen a secar rápidamente a la sombra o en el secadero a

temperaturas no demasiado elevadas. La parte que se utiliza es la semilla. El

motivo de su nombre deriva de la característica forma estrella que poseen sus

frutos y hojas (Chaves, 2006).

Se usa como condimento para aromatizar salsas curry, en confitería, chicles,

caramelos, tabaco, licorería, preparación de farmacéuticos y para la conservación

de encurtidos. También en perfumería y jabones. El fruto se mastica para

perfumar el aliento y ayuda a la digestión (Minakshi DEL, 2002).

Entre sus principios activos se encuentra el aceite esencial (8-9%), anetol (80-

90%), monoterpenos: limoneno (5%), linalol, estragol, fenchona, pineno,

felandreno, anisaldehído, monoterpenoles, tetona anísica, flavonoides, rutina,

glucósidos de kanferol y ácidos orgánicos: ácidos quínico y siquínico. También

contiene taninos catéquicos, lignanos, lactonas sesquiterpénicas (trazas),

veranisatinas, sales minerales (4-5%) y resina. El fruto desecado contiene al

menos 70 mg/kg de aceite esencial (ki Sung, et. Al, 1998). El aceite esencial de I

verum es un líquido color amarillo pálido. El estragol y el anetol son los dos

principales componentes responsables de su actividad antimicrobiana (DEM, et

al, 2001).

Entre los efectos del anís se describe como un eupéptico (anetol), carminativo

(aceite esencial), antiespasmódico (aceite esencial), expectorante de acción

directa sobre las células secretoras de la mucosa respiratoria (aceite esencial),

xxxvii
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estrogénico (aceite esencial), galactagogo (aceite esencial), pediculicida en uso

tópico, especialmente activo frente al Pediculus vestimenta (anetol), (Verguese,

1998). En un estudio realizado sobre el extracto alcohólico de I.verum se

encontró que, éste posee la capacidad de inhibir el crecimiento de E.coli, B.

subtilis y S. cerevisiae (De M, et al., 2001).

I.verum en infusión es usado frecuentemente para el tratamiento del cólico y

como tranquilizante en lactantes. Normalmente se utiliza en infusión al 0.25-1%.

Además sirve contra meteorismo, espasmos gastrointestinales, gastritis,

enterocolitis, gastralgias y enteralgias, bronquitis, asma, oligomenorreas,

síndrome climatérico y pediculosis en uso tópico. Es muy útil también en los

casos de digestiones pesadas, fermentación intestinal y flatulencia. Por su acción

ligeramente antiespasmódica, alivia los espasmos de las vísceras huecas

(estómago, vesícula biliar, intestino y útero). Es recomendado para personas con

problemas y dificultades respiratorias, además es uno de los ingredientes básicos

en los medicamentos “Tamiflu” para la gripe aviar (Cernuda, 2005).

Las contradicciones se hacen presentes en personas con hipersensibilidad al

anetol, en pacientes con gastritis, úlceras gastroduodenales, síndrome del

intestino irritable, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedades del

hígado, epilepsia, Parkinson u otras enfermedades neurológicas. Las mujeres

embarazadas y en período de lactancia deben evitar el uso interno del aceite

esencial de anís estrella. También en los síndromes que cursen con

hiperestrogenia, y en los tratamientos estrogénicos. No es recomendable su uso

en lactantes como tradicionalmente se ha utilizado. Su administración en altas

dosis en los lactantes se ha relacionado con la aparición de crisis convulsivas y

somnolencia (Cernuda, 2005).

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Entre los efectos tóxicos, se menciona que el aceite esencial puede producir

efectos tóxicos sobre el sistema nervioso central, a pequeñas dosis ejerce una

acción estimulante de los centros nerviosos respiratorios y de la función

digestiva, pero a dosis altas actúa como estupefaciente. El anetol, el componente

que ingerido a dosis elevadas puede tener efectos tóxicos sobre el sistema

nervioso provocando delirios y convulsiones (Hernández, et al. 2010).

Existe una importante contradicción acerca de su consumo. Mientras en

Europa se convirtió en el llamado “oro asiático”, buscando por miles de personas

ante la amenaza de la gripe aviar; utilizado para fabricar el Tamiflu, que es el

único medicamento recomendado por la Organización Mundial de la Salud. En

México al anís estrella, lleva más de seis años prohibida, en un principio, se

creía que el anís estrella era muy beneficioso y se le daba a los niños pequeños e

incluso recién nacidos, pero recientes estudios determinan que en grandes

cantidades, puede resultar mortal; por eso se retiró del mercado en 2001, sin

embargo el anís estrella se continuó vendiendo en herbolarios de manera

totalmente legal (Cernuda, 2005).

El motivo de su prohibición en México, fue que se descubrió que la forma en

que se administraba la infusión de anís estrella era tóxica en cantidades

considerables, llegando a provocar la muerte cuando se administraba por mucho

tiempo (Madrigal, et al., 2010).

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5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Colecta e Identificación del material vegetal de estudio

Se adquirieron las tres especies de plantas en el Estado de Nuevo León:

Pimpinella anisum, Illicium anisatum e Illicium verum en el Mercado Juárez de

la Cd. de Monterrey. Se identificaron en el Departamento de Botánica de la

Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

5.2 Extracción Soxhlet

La extracción Soxhlet es un método de extracción líquido-sólido

frecuentemente utilizado para llevar a cabo la extracción de metabolitos de

plantas. Este consta de un matraz colector, una cámara de extracción y un

condensador (Fig. 4). Su principal ventaja

es que se trata de un proceso continuo, dado

que el solvente deja continuamente el matraz

xl
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

con vapor y es condensado en la cámara de extracción para extraer el material

vegetal en forma constante, antes de volver el matraz colector mediante el

sistema de sifón. El método es práctico sin embargo presenta desventaja ya que

requiere calentar el solvente a su punto de ebullición, y puede causar daño a

compuestos termolábiles además de formación de artefactos (Seidel, 2006).

5.2.1 Obtención de los extractos de las plantas en estudio

La obtención de los extractos se procedió teniendo el material vegetal seco, se

pesaron 60 g de cada planta y posteriormente se realizó la extracción en un

Soxhlet con 700 mL de metanol (MeOH) y posteriormente hexano a 60° C

durante 7 h. El extracto se filtró y se concentró en vacío a 45°C. Los extractos

obtenidos se evaporaron hasta sequedad con presión reducida en un rotavapor

(Yamato modelo RE200), los extractos metanólico y hexánico se secaron a

temperatura ambiente y se pesaron para calcular el porcentaje de la extracción.

El extracto se almacenó a 40°C hasta el momento de ser empleado (Fig. 5).

Fig. 5 Diagrama de obtención de los extractos

xli
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

5.3 Pruebas para determinar la actividad antibacteriana de los extractos

Con los extractos obtenidos se procedió a evaluar la actividad biológica sobre

los micoorganismos mencionados en la Tabla I. El método empleado para la

prueba microbiológica fue por difusión en placa con papel filtro y para evaluar la

actividad de los extractos secos se prepararon a una concentración de 40 mg/mL

y se esterilizaron por filtración con membranas de 0.22 µm (Koneman et al.,

1989).

Tabla I

Microorganismos Utilizados

Bacterias

Bacillus subtilis
Salmonella sp
Klebsiella pneumoniae
Bacillus cereus
Escherichia coli
Staphilococcus aureus
Salmonella typhi

xlii
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5.3.1 Activación de las bacterias

Se utilizó el medio líquido C. Rivas (Titulo de la Patente No 252592 MPI

MX/07/11/2007) 8.5 g en 100 mL de agua destilada, ajustado a pH 7.0. Para la

preparación del medio se utilizaron tubos de ensayo de borosilicato de 13x100

mm, conteniendo 5 mL de medio, se esterilizaron a 15 Lb/15 min,

posteriormente se inoculó cada cepa transfiriendo una asada a cada tubo

previamente identificado, posteriormente se incubaron de 12-18 h a 37°C.

5.3.2 Cultivo de bacterias

Se utilizó el medio sólido C. Rivas; 8.5g de medio en 100 mL de agua

destilada, se esterilizó y se adicionó sobre cajas Petri en porciones de 20 mL,

que se utilizaron en las pruebas de inhibición in vitro.

5.3.3 Determinación de la actividad antimicrobiana

El método de difusión en placa se realizó colocando en un disco de papel filtro

Whatman No. 1 previamente impregnado con 10 µL de cada uno de los

extractos obtenidos a una concentración de 40 mg/mL, este disco se colocó

sobre una placa con medio sólido C. Rivas, previamente inoculada con 100 µL

de una suspensión bacteriana de 1x106 UFC (tubo uno de la escala de Mc

Farland) o una asada con las diferentes cepas, se depositó también en un disco

10 µL del solvente utilizado para disolver el extracto como control negativo. Se

incubó a 37°C por 24 h, después de este período se midieron los halos de

inhibición en mm para cada una de la pruebas (Fig. 6).


xliii
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Fig.6 Determinación de la actividad antimicrobiana

5.4 Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los


extractos
que muestran actividad biológica

Con la ayuda de una microplaca se agregaron 100µl de medio líquido C. Rivas y

se añadieron 100µL de cada una de los extractos partiendo de la concentración

inicial de 1600 µg/mL y se realizaron microdiluciones seriadas. Una vez

efectuadas estas, se adicionaron 100 µL de la suspensión bacteriana a una

concentración de 1x106 UFC (tubo uno de la escala de Mc Farland).

Posteriormente la microplaca se incubó por 24 h a 37°C, y se determinó la

concentración mínima inhibitoria (CMI) de la fracción aplicando 40µL de una

solución de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrasolium bromuro

(MTT) a una concentración de 2.5 mg/mL a cada pozo e incubando por 4 h a

37°C, y posteriormente se observó la viabilidad microbiana de color púrpura de

las diluciones probadas.

xliv
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5.5 Identificación de las fracciones con actividad bacteriana

5.5.1 Cromatografía en capa delgada de los extractos con concentración

mínima inhibitoria relevante para la separación de fracciones

La cromatografía en capa delgada es una técnica cualitativa que permite

constatar la pureza de los componentes del extracto separado mediante la

cromatografía en columna. Consiste en una placa de vidrio con una fase

estacionaria de sílica-gel, la cual está mezclada con sulfato de calcio

como fraguante. La mezcla a separar, esta disuelta en una pequeña

cantidad de solvente, se coloca mediante un capilar en uno de los

extremos de la cromatoplaca. Ésta se introduce a continuación en una

cámara cromatográfica la cual contiene una cierta cantidad de la fase

móvil o eluente (Fig. 7). El eluente sube por capilaridad a través de la

cromatoplaca lográndose la separación de los componentes de la mezcla

en base al equilibrio (Dzido y Tuzimski, 2008) entre la adsorción de los

componentes sobre la sílica y la solución de los mismos en el eluente. Ya

terminado el proceso de separación, la cromatoplaca se revela mediante

una lámpara de luz (254 nm) o utilizando una cámara de yodo, con

ambos métodos se observan manchas representando a los diferentes

compuestos distribuidos a lo largo de la cromatoplaca. Se utilizaron

cromatoplacas “Merck” (Silica gel 60 F254, 5x10 cm, 250 µm de grosor

de capa) y los extractos y fracciones analizadas se colocaron utilizando

un capilar de vidrio.

xlv
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Fig.7 Cromatográfia en capa fina

5.5.2 Identificación de fracciones activas

Se utilizó la técnica de Hambuger modificada por Verástegui et al en

1998; se seleccionaron las cromatoplacas en las cuales las fracciones

mostraron una mayor separación. En una caja Petri se expuso el

cromatograma con luz ultravioleta por una hora para esterilizar y sobre

él se colocó una tira de medio sólido C.Rivas de 1x6cm x 0.3 mm de

espesor. Posteriormente se añadió sobre la tira de agar 150µl de la

dilución 1x106 UFC. Las condiciones de humedad se mantuvieron

colocando dentro de una caja Petri un algodón con agua destilada

estéril. Se utilizó como control de crecimiento un cuadro de agar

inoculado con el mismo microorganismo pero separado del

cromatograma. Las cajas se incubaron a 37°C por 24-48 h. La zona de

inhibición de los microorganismos en la tira de agar se midió y se

correlacionó con el registro previo de las fracciones separadas

cromatográficamente.

xlvi
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5.6 Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50) sobre E.


histolytica HM1-IMSS, bajo condiciones axénicas in vitro

5.6.1 Cinética de crecimiento

Se utilizó medio PT modificado, adicionado con 10 % de suero de bovino

adulto y 1 % de antibiótico (mezcla de Penicilina / Estreptomicina). Para la

cinética de crecimiento la cepa de E. histolytica HM1-IMSS crecida en

medio PT se inoculó a 1x104 cel/mL en tubos de vidrio con tapón de rosca

de 16x125 mm con 5.55 mL de medio PT adicionado. Se incubó a 37°C y

cada 24 h se contó el número de células durante nueve días. Para realizar

el conteo los tubos se colocaron en agua-hielo por 10 min para despegar

las células adheridas al vidrio, este se agitó suavemente por inversión (15

veces) y se procedió a determinar el número de cel/mL empleando una

cámara de Neubauer.

Los bioensayos se realizaron en la fase logarítmica del crecimiento de las

células, E. histolytica HM1-IMSS fue propagada en cultivo axénico a 37

°C en medio PT modificado suplementado con el 10 % de suero de bovino

adulto y 1 % de antibiótico (mezcla de Penicilina / Estreptomicina).

5.6.2 Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50)

Se empleó E.histolytica cepa HM1-IMSS. Se realizaron resiembras

xlvii
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sucesivas de 1x104 cel/m el medio PT modificado en tubos con tapón de

rosca de 16x125 mm, se adicionó 1% antibiótico (mezcla de Penicilina /

Estreptomicina) y 10 % de suero de bovino adulto, posteriormente se

incubó a 37 °C por 96 h. Los tubos se colocaron en agua-hielo por 10 min

para despegar las células adheridas al tubo, este se agitó suavemente por

inversión (15 veces) y se procedió a determinar el número de cel/mL

empleando una cámara de Neubauer.

De las amibas suspendidas en medio PT modificado incubadas por 96 h a


4
37°C se tomó 1x10 cel/mL y se transfirieron a tubos con 5 mL de medio

PT modificado, se probaron cinco concentraciones de cada extracto

metanólicos y hexánicos respectivamente sobre I. anisatum, P.anisum e

I.verum (0.025, 0.050, 0.1, 1.0, 3.0 mg/mL) totalmente independientes y se

incubaron por 96 h a 37 °C. A las 96 h los tubos se colocaron en agua-

hielo por 10 min para despegar las células adheridas al tubo, este se agitó

suavemente por inversión (15 veces) y se procedió a determinar el número

de cel/mL empleando una cámara de Neubauer. Se realizó el análisis

Probit para determinar la IC50 de los extractos probados (Fig. 8).

xlviii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.8. Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50) sobre

E. histolytica.

xlix
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

5.6.3 Evaluación de la actividad antiamibiana de las fracciones del extracto


metanólico de P. anisum.

Se realizaron resiembras sucesivas de E. histolytica a 1x104 cel/m el medio

PT modificado en tubos con tapón de rosca de 13x100 mm, se adicionó

1% antibiótico (mezcla de Penicilina / Estreptomicina) y 10 % de suero de

bovino adulto, posteriormente se incubó a 37 °C por 96 h. Los tubos se

colocaron en agua-hielo por 10 min para despegar las células adheridas al

tubo, este se agitó suavemente por inversión (15 veces) y se procedió a

determinar el número de cel/mL empleando una cámara de Neubauer.

4
A partir de la cepa de E. histolytica se tomó 1x10 cel/mL y se

transfirieron a tubos con 5 mL de medio PT modificado, se colocaron las

fracciones 1, 2 y 7 a la dosis de 0.15 mg/mL de la fracción 1, de la fracción

2 se evaluaron 0.1 mg/mL y para la fracción siete se evaluó la

concentración de 0.47 mg/mL y se incubaron por 96 h a 37 °C. A las 96 h

los tubos se colocaron en agua-hielo por 10 min para despegar las células

adheridas al tubo, este se agitó suavemente por inversión (15 veces) y se

procedió a determinar el número de cel/mL empleando una cámara de

Neubauer.

5.7 Identificación parcial de los componentes de los extractos

l
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

5.7.1 Identificación de grupos funcionales

A cada uno de los extractos se les realizaron las siguientes pruebas con la

finalidad de identificar sus componentes químicos, cada una de éstas

pruebas fueron realizadas en placas de porcelana con varios pozos, cada

pozo fue utilizado para una prueba en específico, los procedimientos se

describen en la Tabla II.

Tabla II

Procedimiento para realizar las pruebas de identificación química


(Domínguez, X.A 1973)

Prueba Procedimiento
Determinación de:
colorida de:
Se disolvieron 1-2 mg de la muestra en 1
mL de agua, acetona o metanol y se
agregó gota a gota la solución de KMnO4
Insaturaciones KMnO4 al 2% en agua. La prueba es positiva si se
observa decoloración o formación de un
precipitado café (dióxido de magnesio)
en menos de 1 min.

De 1 a 10 mg de la muestra se disuelven
en etanol, se añadirá una solución
2,4- saturada de 2-4-dinitrofenilhidracina en
Grupo Carbonilo Dinitrofenilhi HCl 6N; la formación de un precipitado
dracina color amarillo o naranja indica la
presencia del grupo carbonilo.

Se disuelven de 1-2 mg de la muestra en


1 mL de agua o etanol y después se
Oxhidrilos fenólicos añaden unas gotas de cloruro de fierro al
(taninos vegetales) FeCl3 12.5% en agua. La aparición de un
precipitado rojo, azul-violeta o verde es
considerada positiva.

Se mezcla 1 mL de anhídrido acético y 1


mL de cloroformo, se enfriarán a 0°C y
Esteroles y Liebermann- se les añade una gota de ácido sulfúrico.
triterpenos Burchard Se añade, gota a gota, este reactivo a la
muestra, o su solución clorofórmica. Si
observamos formación de colores azul,

li
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

verde, rojo, anaranjado, etc., y estos


cambian con el tiempo, la prueba será
positiva. El orden y el tiempo de
aparición (0, 1, 5, 20, 60 min) tiene cierto
valor diagnóstico; así, si se observa una
coloración amarilla después de 15 min
corresponderá a C-14-metilo y una
variación -7 insaturación. La prueba es
positiva con esteroles que contienen 2
enlaces dobles conjugados que los
pueden formar por una o dos
deshidrataciones con isomerización.

Similar a la de Liebermann-Burchard, la
muestra (1 a 2 mg) en contacto con 1 mL
Salkowski de ácido sulfúrico, se desarrollarán
colores amarillos o rojo para esteroles y
metilesteroles.

A 1-2 mg de muestra se le agrega gota a


gota, el reactivo Molish (alfa-naftol al 1%
en etanol), luego 1 mL de ácido sulfúrico
Molish por las paredes. La prueba es positiva si
se observa la formación de un anillo
coloreado en la interfase de color
púrpura.

Se disolverán 1-2 mg de muestra en


Carbohidratos NaOH al 10%; si aparece una coloración
Cumarinas amarilla que desaparece al acidular se
considerará positiva.

Se disuelven de 1-2 mg de muestra en


solución alcohólica de NaOH al 10%. Un
color amarillo o anaranjado que se pierde
Lactonas o desaparece al adicionar unas gotas de
HCl indica la presencia de un anillo
lactónico.

A 2-3 mg de muestra se le agregan 3-4


gotas de la solución mezcla, siendo
positiva si se torna un color naranja a
Sesquiterpenlactonas Baljet roja oscuro. La solución mezcla 1:1
consiste de una solución A que contiene
ácido pícrico al 1% en etanol y una B con
NaOH al 10%.

Una pequeña cantidad de muestra se


disolverá en H2SO4 y se observa
Flavonoides H2SO4 coloración amarilla para flavonoles;
naranja-guinda para flavonas; rojo-
azuloso para chalconas y rojo-púrpura
lii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

para quinonas.

Se disuelve una porción del residuo con


HCl 2N en propanol-1, durante 15 a 30
Leucoantocia
min. La aparición lenta de una coloración
ninas
roja o violeta se considera positiva.

Modificación de Munier y Machelobuf.


Se realizaron 2 soluciones. Para preparar
la solución A se disuelven en 0.85 g de
nitrato de bismuto en una mezcla de 10
mL de ácido acético glacial y 40 mL de
agua. La solución B se preparó
disolviendo 8 g de KI (yoduro de potasio)
Alcaloides Dragendorff en 20 mL de agua. El reactivo se prepara
mezclando 5 mL de la solución A, 4 mL
de la solución B y 100 mL de agua. El
reactivo es estable por un año y la prueba
es positiva para alcaloides al dar la placa
coloración rojo o naranja persistentes por
24 h (Pérez y Cepeda, 2000).

Una porción del residuo se disolverá con


agua en un tubo de ensayo y luego se
agitará vigorosamente durante 3-5
Agitación minutos. La formación de espuma con
apariencia de panal de abeja, estable por
30 min, se considera prueba positiva.

La sal se preparo al 10% en agua. Se


disuelve de 1-2 mg de la muestra
disuelta en agua o en etanol y se le
agregan de 2-3 gotas de ácido sulfúrico
Bicarbonato concentrado. Se agita ligeramente,
de sodio posteriormente se adicionará de 2-3 gotas
Saponinas
de bicarbonato de sodio. Si existe
presencia de saponinas aparecerán
burbujas y tendrán una permanencia por
más de 1 min.

Se disuelven de 1-2 mg de la muestra en


1 mL de cloroformo luego se añadirá 1
mL de ácido sulfúrico. La prueba será
Salkowski positiva si se observa la aparición de
color rojo.

Ácido Se preparo una mezcla de 1 mL de ácido


Aromaticidad sulfúrico- sulfúrico concentrado con una gota de
formaldehído formaldehido. Se agrega de 1-5 mg de la

liii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

muestra disuelta en disolvente no


aromático, se añaden unas gotas de la
mezcla anterior y si aparece un color
rojo-violeta, la prueba será positiva
(Treviño, 2001).

5.8 Análisis Estadísticos

Análisis Probit: Este método se basa en la cuantificación de la vulnerabilidad

de los individuos ante efectos físicos de una magnitud determinada que se

suponen conocidos. El método consiste en la aplicación de correlaciones

estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre la población u

otros elementos vulnerables para los distintos niveles o dosis de los estímulos.

La respuesta de una población ante un fenómeno físico se distribuye según

una ley log-normal. El modelo es aplicable solo para aquellos fenómenos de


liv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

los que se dispone de la “ecuación Probit”. El resultado es una curva, grafica

del análisis Probit curva dosis respuesta (Mercado, 1998).

El valor de la variable se determina por la expresión:

Y=K1+K2LnV

Donde V es la variable física representativa del estimulo y K1 y K2 son unas

constantes ( Ferrán, 2001).

5.9 Análisis Espectroscópico

5.9.1 Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (ERMN)

La técnica de espectroscopia de RMN se ha desarrollado como la

herramienta más importante para la determinación de estructuras de

productos naturales aislados de plantas. Básicamente, se trata de otra

forma de espectroscopía de absorción, dado que bajo la influencia de un

campo magnético un compuesto orgánico puede absorber radiación

electromagnética de la región de microondas (60-600 MHz) como

frecuencias gobernadas por el entorno químico de los átomos de hidrógeno

o de carbono 13 presentes en la molécula (Macomber, 1998; Silverstein et

lv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

al., 2005; Mitchell y Costisella, 2007). Los espectros de RMN se obtienen

normalmente en soluciones del 2 al 30%, en un disolvente aprótico

(normalmente cloroformo deuterado, tetracloruro de carbono o sulfóxido

de dimetilo) y un pequeño porcentaje del estándar de referencia

tetrametilsilano. Se requieren alrededor de 10 mg de muestra para un

espectro de alta calidad (Jacobsen, 2007). Para este trabajo de

investigación los espectros de RMN fueron obtenidos con un instrumento

Bruker DPX (1H, 300 ó 400 MHz; 13C, 100 ó 125 MHz).

5.9.2 Espectrometría de masas (EM)

El concepto de espectrometría de masas es relativamente simple: el

compuesto es ionizado mediante el impacto de electrones de electrones y los

iones producidos son separados en base a su relación masa/carga (m/z)

(Silverstein et al.,2005; Vogler y Setzer, 2006). Ésta técnica es la segunda

más importante en la caracterización de productos naturales después de

RMN, debido a su gran sensibilidad y mediante al análisis del espectro

puede obtenerse la fórmula molecular del compuesto, sin embargo la

interpretación es más compleja si la comparamos con RMN y la

información de conectividad solo puede obtenerse indirectamente a través

lvi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

de revisión cuidadosa de los fragmentos graficados en el espectro (Gross,

2004 y Field et al., 2008).

6. RESULTADOS

6.1 Extractos vegetales

6.1.1 Obtención de extractos metanólicos y hexánicos

En la Tabla III se muestra el rendimiento porcentual de las plantas

utilizadas, observando que la de mayor rendimiento fue la de I.anisatum de

31.26% correspondiente al extracto metanólico y de 28.3% al extracto

hexánico, siendo P.anisum el de menor rendimiento con un 12.13% en el

extracto metanólico.

Tabla III
Rendimiento de los extractos y parte utilizada de las plantas

Rendimiento del extracto

lvii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Parte utilizada (%)


Especie vegetal
Hexánico Metanólico
I. verum fruto 15.5 14.47

I. anisatum fruto 28.3 31.26

P. anisum fruto 14.5 12.13

6.1.2 Identificación parcial del compuesto presentes en los extractos hexánicos y


metanólicos de P. anisum, I. verum e I. anisatum.

En la Tabla IV, se muestran los resultados de las pruebas fitoquímicas para

grupos funcionales y metabolitos secundarios de los extractos metanólicos y

hexánicos de P. anisum, I. verum e I. anisatum. Los seis extractos presentan

oxídrilos fenólicos, flavonoides, alcaloides y aromaticidad en todos los

extractos.

Tabla IV

lviii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Grupos funcionales de los extractos metánolicos y hexánicos de I.anisatum,


P.anisum e I.verum

Al hacer el análisis comparativo de los metabolitos presentes en los diversos

extractos tanto metanólico como hexánico, se observa que el extracto metanólico de

P. anisum presentó once de los doce metabolitos secundarios, pero el extracto

hexánico de I. verum presentó los doce metabolitos secundarios que conforman la

gama de las pruebas fitoquímicas. Sin embargo, haciendo una comparativa entre los

seis extractos, observamos que sólo estos presentan cumarinas.

6.2 Actividad bactericida de los extractos de las plantas en estudio

En la Tabla V, se muestra los resultados de la actividad antibacteriana de los

extractos metanólicos de P.anisum, I. anisatum e I.verum. Sólo se observó

actividad antibacteriana del extracto metanólico de P. anisum sobre Salmonella

sp. y sobre K. pneumoniae sólo presentó actividad inhibitoria el extracto

metanólico de I. verum¸ sin embargo sobre Escherichia coli sí se observó


lix
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

actividad antibacteriana por parte del extracto metanólico tanto de P. anisum, I.

anisatum e I. verum; sobre S. thyphi tanto P. anisum e I. anisatum presentaron

actividad antibacteriana, siendo más evidente la actividad antibacteriana por

parte del extracto metanólico de I. anisatum. Sin embargo no se observó

actividad biológica sobre B.subtilis, B.cereus y S. aureus.

Tabla V
Actividad antibacteriana de los extractos metanólicos de las plantas en estudio
sobre bacterias patógenas.

Microorganismo P. anisum I.anisatum I.verum Control (-)


Bacillus cereus ---- ---- ---- ----
Bacillus subtilis ---- ---- ---- ----
Escherichia coli +++ ++ ++ ----
Klebsiella pneumoniae ---- ---- ++ ----
Salmonella sp ++ ---- ---- ----
Salmonella typhi + ++ ---- ----
Staphylococcus aureus ---- ---- ---- ----
+ inhibición de 0-5 mm, ++ inhibición de 5-10 mm, +++ inhibición de 10-20 mm.

En la Tabla VI se presentan los resultados de la actividad biológica de los

extractos hexánicos de P. anisum, I. anisatum e I.verum. Los extractos de

I.anisatum e I. verum presentaron actividad antibacteriana sobre Salmonella sp. y

S.typhi, sobre K. pneumonia sólo el extracto de I.verum presentó actividad

antibacteriana, los extractos de P.anisum e I.verum presentaron actividad

antibacteriana sobre B. cereus presentando mayor actividad antibacteriana el

extracto de P. anisum. E. coli sólo fue inhibido su crecimiento por el extracto de

I. anisatum. Los extractos de P. anisum, I. anisatum e I.verum no presentaron

actividad antibacteriana sobre B. subtilis y S. aureus.

Tabla VI
Actividad antibacteriana de los extractos hexánicos sobre bacterias patógenas.
lx
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Microorganismo P. anisum I. anisatum I. verum Control (-)


(hexano)
Bacillus cereus ++ ---- + ----
Bacillus subtilis ---- ---- ---- ----
Escherichia coli, ---- ++ ---- ----
Klebsiella pneumoniae ---- ---- ++ ----
Salmonella sp ---- ++ ++ ----
Salmonella typhi ---- ++ + ----
Staphylococcus aureus ---- ---- ---- ----
+ inhibición de 0-5 mm, ++inhibición de 5-10 mm, +++inhibición de 10-20 mm.

6.3 Actividad amebicida de los extractos metanólicos y hexánicos de P. anisum,


I. anisatum e I.verum sobre Entamoeba histolytica.

6.3.1 Cinética de crecimiento de E. histolytica

En la figura 9 se muestra el comportamiento de la cinética de crecimiento

de E.histolytica HM1-IMSS, durante las primeras 24 h se observa una fase

de adaptación, seguida de la fase logarítmica la cual se prolongó por 96 h,

obteniendo un rendimiento máximo de aproximadamente 280,000 cel/mL,

enseguida se observa una ligera fase de adaptación y seguido de un

descenso celular paulatino.

lxi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.9 Cinética de crecimiento de E. histolytica HM1-IMSS

propagada en condiciones axénicas in vitro.

6.3.2 Determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50)

Los resultados correspondiente al CI50 de los extractos metanólico y

hexánico de P. anisum, I. verum e I. anisatum sobre E. histolytica

HM1-IMSS se muestran en la Tabla VI y Fig. 10. En la Tabla VII se

observa que el valor CI50 menor lo presentó el extracto metanólico de P.

anisum, y el valor mayor lo presentó el extracto metanólico de I. verum.

Sin embargo el valor CI50 del extracto hexánico de P.anisum no fue

posible determinarlo, debido a la presencia de turbidez en diferentes

concentraciones.

Tabla VII

CI50 de los extractos metanólico y


hexánicos de las plantas en estudio
CI50
Especie (mg/mL)

lxii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

vegetal Extracto Metanólico Extracto Hexánico

P. anisum 0.034 ------

I. verum 0.157 0.082

I. anisatum 0.152 0.112

En la Fig 10, se observa que el valor CI50 del extracto metanólico de P.

anisum presenta diferencia significativa con respecto a los extractos

metanólicos y hexánicos tanto de I. verum e I. anisatum. Los resultados

de la CI50 tanto del extracto metanólico de I. verum como de I. anisatum

no presentan diferencia significativa entre sí; los resultados de la CI50

obtenido de los extractos hexánicos tanto de I. verum e I. anisatum sí se

observa diferencia significativa entre estos.

0.18

0.16

0.14

0.12
Valor CI50

0.1
Ext. metanólico
0.08 Ext. hexánico
0.06

0.04

0.02

0
P. anisum I. verum I. anisatum

Fig. 10. CI50 de los extractos metanólico y hexánicode P. anisum, I. verum e I.


anisatum sobre el cultivo axénico in vitr de E. histolytica HM1-
IMSS.

lxiii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

La ecuación del análisis PROBIT para los extractos metanólicos de P. anisum,

I. verum e I. anisatum se muestran en la Figura 11, 12 y 13 respectivamente.

Por otra parte, la ecuación del análisis PROBIT para los extractos hexánicos de

I. verum e I. anisatum se muestran en la Figura 14 y 15 respectivamente.

Fig.11 Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto metanólico


de P. anisum sobre E. histolytica HM1-IMSS.

lxiv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.12 Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto metanólico de


I.verum sobre E. histolytica HM1-IMSS.

Fig.13 Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto metanólico de


I.anisatum sobre E. histolytica HM1-IMSS.

lxv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.14 Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto hexánico de


I.anisatum sobre E. histolytica HM1-IMSS.

Fig.15 Concentración Inhibitoria Media (CI50) del extracto hexánico de I. verum


sobre Entamoeba histolytica HM1-IMSS.

lxvi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

6.4 Separación de fracciones por cromatografía del extracto metanólico de


P. anisum

Por medio de cromatrografía en capa delgada se obtuvieron las fracciones,

cuyos Rf, se muestran en la Tabla VIII, en estos extractos se observaron siete

fracciones, sin embargo fueron tres las fracciones elegidas (fracción 1, 2 y 7)

Rf 0.24, 0.30, 0.93, se obtuvieron para evaluar su actividad antibacteriana y

antiamibiana.

Tabla VIII
Fracciones obtenidas de el extracto metanólico de P. anisum

Fracción Rf.

1 0.24

2 0.30

3 0.34

4 0.38

5 0.42

6 0.45

7 0.93

lxvii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

6.5 Evaluación de la fracción del extracto metanólico de P. anisum

6.5.1 Evaluación de la actividad antibacteriana de las fracciones 1, 2 y 7 del


extracto metanólico de P.anisum.

Fue evaluada la actividad antibacteriana sobre Salmonella sp, B. cereus, E.

coli, de las fracciones 1, 2 y 7 del extracto metanólico de P.anisum. Las

fracciones 1 y 2 no presentaron actividad antibacteriana sobre las bacterias

antes mencionadas, sin embargo la fracción siete sí mostró actividad

antibacteriana sobre E. coli, obteniendo una CMI de 45.5 mg. (Fig.16).

De acuerdo a estos resultados, la fracción 7 fue seleccionada para realizarle

análisis espectroscópicos y proponer su estructura.

Fig.16 Determinación de CMI de la fracción siete del extracto metanólico


de P.anisum con actividad sobre E. coli

lxviii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

6.5.2 Evaluación de la actividad antimibiana de las fracciones 1,2 y 7 del


extracto metanólico de P.anisum.

Al graficar los valores correspondientes a la inhibición de los cultivos de E.


histolytica HM1-IMSS cultivadas en presencia de las fracciones 1, 2 y 7 del
extracto metanólico de P. anisum, se muestran en la Fig. 17.

90

80

70
Porciento de Inhibición

60

50

40

30

20

10

0
F1 [0.15 F2[0.1 F7[.47 MIX
mg/mL] mg/mL] mg/mL]
Concentraciones

Fig.17 Actividad antimibiana de las fracciones del extracto


metanólico de P.anisum.

En esta figura se observa, que la fracción 1 no presenta actividad

antiamibiana, la fracción 2 presentó una inhibición del 38% y la fracción siete

presentó una inhibición porcentual del 75%. Entre los valores porcentuales

de inhibición de la fracción 2 y 7, sí se observa diferencia significativa.

De acuerdo a estos resultados, la fracción 7 fue seleccionada para realizarle

análisis espectroscópicos y proponer su estructura.

6.6 Análisis espectroscópico del compuesto obtenido de la fracción siete del


extracto metanólico de P. anisum

lxix
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

6.6.1 Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (ERM)

En la Fig. 18 se muestra el análisis de la fracción siete del extracto

metanólico de P. anisum. Se utilizó la técnica de Resonancia Magnética

Nuclear 1H y 13C.

Fig.18 Espectro de 1H-RMN(499 MHz) General del Compuesto obtenido

de la fracción siete del extracto metanólico de P. anisum

En la Fig. 19, y tabla IX se observa el análisis de la fracción siete del extracto

metanólico de P. anisum realizada al espectro de 1H-RMN primero se

descartaron las señales debidas a los restos del solvente (MeOH), se puede

observar un grupo de señales entre 0.90 y 1.79 ppm los cuales son

identificados en el grupo de alifáticos, observamos también las señales entre

2.0 y 4.8 ppm los cuales pertenecen a dobles enlaces y las señales presentes

de 4.8 y 8.0 ppm nos confirman que tenemos un compuesto aromático.

lxx
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.19 Espectro de 1H-RMN(499 MHz) General del Compuesto obtenido


de fracción (Rf 0.93)del extracto de P. anisum.

Fig.20 Ampliación del Espectro de 1H-RMN del compuesto obtenido

de la fracción siete del extracto metanmólico de P. anisum

Tabla IX
Datos espectroscópicos de 1H-RMN del compuesto 1-benzopirilio
Señal  Integración Multiplicidad
A 0.903 6.41 M
B 0.96 2.7 m
C 1.29 12.04 s
D 1.339 s
7.98
E 1.388 s

lxxi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

F 1.61 m
G 1.79 1.08 d
H 1.91 0.95 s
I 2.07 2.05 m
J 2.173 1.08 t
K 2.325 1.39 d
L 2.48 s
M 2.71 s
N 2.82 s
O 3.013 0.71 s
P 3.66 3.83 m
Q 3.895 3.26 s
R 4.631 1.33 m
S 4.93 s
T 5.353 0.79 m
U 6.25 0.9 d
V 6.93 m
1.97
W 6.95 d
X 7.54 1 d
Y 7.89 1.07 d

También se realizaron experimentos de RMN bidimensionales para correlacionar las

diferentes señales y de ésta manera revisar las interacciones de los hidrógenos dentro

de la estructura. En la Fig. 21 y en la Tabla X se observa el espectro que corresponde

al análisis COSY (Correlación Spectroscopy).

lxxii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.21 Espectro COSY del Compuesto obtenido de la fracción siete del

extracto metanólico de P anisum

Tabla X
Correlación del espectro COSY del compuesto obtenido de la fracción siete del

extracto metanólico de P.anisum

Señal Correlación
A C
B
C A
D F
E
F D, J

lxxiii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

G
H
I
J F
K
L
M S
N
O
P Q
Q P
R
S M
T
U Y
V
W X
X W
Y U

6.6.2 Espectroscopía de Masas

En la Fig. 22 se observa la imagen obtenida al espectro de masas general de la

fracción siete del extracto metanólico de P. anisum.

Fig.22 Espectro de Masas General del Compuesto obtenido

lxxiv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

de la fracción siete del extracto metanólico de


P. anisum

La estructura compuesta para la fracción siete del extracto metanólico de P. anisum

es 1- benzopirilio (C11H11O2) y se observa en la Fig. 23, ver anexos.

Fig.23 Estructura propuesta para la fracción siete


del extracto metanólico de P. anisum.

7. DISCUSIÓN

En esta investigación las plantas utilizadas fueron seleccionadas debido a su uso

frecuente en la medicina popular, a estudios etnofarmacológicos y a su amplia

distribución en nuestro país México. En este trabajo uno de los objetivos fue

obtener los extractos metanólicos y hexánicos de P. anisum, I. verum e I.

anisatum, de acuerdo a los resultados obtenidos observamos que el mejor

rendimiento se obtuvo en la especie de I. anisatum con 28.3% correspondiente al

extracto hexánico y 31.26% de rendimiento para el extracto metanólico, siendo

estos rendimientos superiores en aproximadamente 50% en comparación a los

lxxv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

rendimintos obtenidos en las especies de P. anisum y I. verum (Tabla III). Siendo

I. anisatum la especie que nos permite obtener mayor rendimiento de extractos.

El rendimiento de los extractos metanólicos y hexánicos de los extractos

obtenidos observamos un buen rendimiento esto lo podríamos a que el método de

extracción Soxhlet es un eficaz método que permite obtener altos rendimientos

de los estractos comparado con métodos de extracción como la agitación

constante, especialmente para compuestos fenólicos (Lock, 1994; Tsantila et al.,

2007).

Con respecto a la determinación de la actividad antibacteriana de los extractos

metanólicos y hexánicos de P. anisum, I. verum e I. anistum, observamos E. coli

fue susceptible a los extractos metanólicos de las 3 especies estudiadas, pero se

observó mayor actividad antibacteriana al emplear el extracto metanólico de P.

anisum, esta inhibición se determinó al observar mayores halos de inhibición

(Tabla IV); con respecto a los extractos hexánicos de las 3 especies vegetales de

estudio, observamos que el cultivo de E. coli sólo es susceptible al extracto de I.

anisatum (Tabla V). En tanto que los cultivos de B. subtilis y S. aureus no fueron

inhibidos por ninguno de los dos extractos. En el caso de B. cereus sólo se

observó inhibición con el extracto hexánico de I. verum y P. anisum siendo más

pronunciada la inhibición con este último estracto. De M, et al; 2001, mencionan

que el extracto alcoholico de I. verum mostró una significativa inhibición sobre

los cultivos de E. coli y B. subtilis, nuestros resultados coinciden con este autor en

cuanto a la inhibición del cultivo de E. coli , sin embargo el autor antes

mencionado señala inhibición del cultivo de B. subtilis, pero en nuestro estudio no

observamos inhibición. La inhibición observada sobre los diversos cultivos

bacterianos por parte de los extractos de I. verum (K. pneumoniae, E. coli,

lxxvi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Salmonella sp, B. cereus y S.typhi) puede ser atribuida al anetol. Lo cual coincide

con lo observado por De M, et al; 1998.

El autor Akhtar A, et al; 2008, reportó que el extracto metanólico de P. anisum

actividad antibacteriana o inhibitoria sobre E. coli, S. pyogenes, S. aureus y K.

pneumoniae, dicha inhibición se observa principalmente en los cultivos de E. coli,

los resultados obtenidos en este trabajo concuerdan con los de dicho autor, ya que

en la tabla IV se observa la mayor inhibición sobre E. coli se obtuvo con el

extracto metanólico de P. anisum, sin embargo, en este trabajo no se logró

observar la inhibición de S. aureus y K. pneumoniae; la actividad inhibitoria que

exhibe el extracto.

En la literatura se ha indicado que la actividad antimicrobiana de los aceites

escenciales y extractos vegetales es debida a diferentes metabolitos secundarios

presentes en ellos incluyendo: triterpenoides, flavonoides, fenoles, alcaloides,

cumarinas, taninos y esteroles (Cottiglia F, 2001; Wanjala C.C., 2002; Takahashi,

2004; Mesa A.C., 2004 y Kiskó 2005), algunos de los cuales están presentes en

los extractos metanólicos y hexánicos evaluados y por lo tanto el efecto

antibacteriano podría ser atribuible a algún o algunos de los metabolitos presentes

en estos extractos (Guiamet P. 2009).

En la Tabla III, se muestran los resultados del análisis fitoquímico de los extractos

metanólicos y hexánicos de P. anisum, I. verum e I. anisatum, todos los extractos

analizados fueron positivos para: flavonoides, alcaloides, aromaticidad, oxidrilos

fenólicos, sin embargo sólo se logró determinar la presencia de cumarinas en el

lxxvii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

extracto metanólico de P. anisum y en el extracto hexánico de I. verum, cotejando

los resultados de la actividad antibacteriana y los resultados del análisis

fitoquímico, observamos que justamente los extractos mencionados de P. anisum

e I. verum son quienes presentaron mayor actividad antibacteriana considerando el

número de cultivos sobre los cuales actuaron, P. anisum inhibió 3 cultivos de

Salmonella sp., E. coli y S. typhi, en tanto que el extracto hexánico de I. verum

inhibió 4 cultivos de Salmonella sp., K. pneumoniae, B. cereus y S. typhi.

Con respecto a los resultados obtenidos en la evaluación de los extractos

metanólicos y hexánicos de P. anisum, I. anisatum e I. verum sobre el cultivo

axénico in vitro de E.histolytica, se observó que el extracto metanólico de P.

anisum presentó la CI50 más baja (0.034 mg/mL) con respecto a los resultados de

CI50 obtenidos de los extractos de las especies antes mencionadas (ver Tabla VI y

Fig 10). En tanto que el extracto metanólico de I. verum presentó la CI50 mayor

con respecto a los extractos ya mencionados, obteniendo un valor de 0.157

mg/mL, de acuerdo a estos resultados el extracto metanólico de P. anisum

presenta 4.6 veces mayor potencial amebicida que el extracto metanólico de I.

verum.

Tanto los valores de CI50 sobre los cultivos de E. histolytica de los extractos

metanólicos de I. verum y de I. anisatum no presentan diferencia significativa

entre sí, sin embargo los extractos hexánicos de ambas especies sí presentan

diferencia significativa. Pero el resultado de CI50 del extracto metanólico de P.

anisum presenta diferencia significativa con respecto a todos los extractos antes

lxxviii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

mencionados. Sin embargo al extracto hexánico no fue posible determinarle el

valor de CI50 sobre el cultivo de E. histolytica debido a que al colocar el extracto

en el cultivo de las amibas, dicho extracto se tornaba espeso.

De acuerdo a los resultados observados, E. histolytica es sensible principalmente

al extracto metanólico de P. anisum, nuevamente esta actividad amebicida podría

ser atribuída a la presencia de cumarinas (Nikhil B et al; 2012 y Iqbal P.F et al;

2009) o bien a la simbiosis de diferentes metabolitos secundarios producidos por

P. anisum.

Las cumarinas son un grupo muy amplio de compuestos fenólicos que tienen en

común una estructura química de 2H-1-benzopiran-2-ona. Las cumarinas son

derivadas del metabolismo de fenilalanina, por ciclización de la cadena lateral del

ácido cinámico a o-cumárico (Gonzalez-Ronquillo, et al., 2011).

Los productos naturales son considerados como fuente con un gran potencial para

la búsqueda de nuevas drogas para el tratamiento de enfermedades que afectan a

los países en vías de desarrollo. En este trabajo, se evaluaron los extractos

hexánicos y metanólicos de P. anisum, I. verum e I. anisatum para evaluar su

potencial antiamibiano, y se determinó la CI50, sin embargo en la literatura no se

encontró referencia alguna al respecto, por lo cual se podría considerar que este

estudio representa el primero en su tipo, al evaluar los extractos metanólicos y

hexánicos de las especies antes mencionadas, sin embargo existen múltiples

trabajos en los cuales se ha realizado el análisis de extractos de plantas sobre el

cultivo de E. histolytica (Bharti N, et al; 2006, Rani D 2011).

lxxix
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

De acuerdo al análisis de la actividad biológica del extracto metanólico de P.

anisum este extracto se separó y se obtuvieron 3 fracciones (fracción 1, 2 y 7) las

cuales fueron analizadas sobre cultivos de bacterias (E. coli, Salmonella sp. y

Bacillus cereus) y sobre cultivos de E.histolytica. De acuerdo a los resultados

obtenidos, sólo la fracción 7 presentó actividad bactericida sobre E. coli (Fig. 16),

y con respecto a la actividad antiamibiana sobre E. histolytica también la fracción

7 a la dosis de 0.47mg/mL presentó aproximadamente 75% de inhibición (Fig.

17). De acuerdo a los resultados obtenidos se decidió someter la fracción 7 a los

siguientes análisis: resonancia magnética nuclear 1H y 13C, análisis de correlación

espectroscópica (COSY), y enseguida al análisis de espectroscopía de masas, de

acuerdo a estos análisis en la fracción 7 se encuentra una molécula identificada

como 1-benzopirilio.

Al hacer el análisis global de los resultados obtenidos de la actividad biológica de

los extractos hexánicos y metanólicos de P. anisum, I, verum e I. anisatum, a

través de diversas técnicas, se deduce que la molécula responsable de la actividad

bactericida y amebicida de la fracción 7 del extracto metanólico de P. anisum,

corresponde a la presencia de la molécula de 1-benzopirilio, la cual también ha

sido reportada por Lu Y, et al; 2002 la cual fue identificada en un extracto de la

semilla de la grosella negra, este autor también identifica a esta molécula como un

pyranodelphinin D, la cual pertenece al grupo de las pyranoanthocyaninas.

lxxx
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Estos resultados estimulan a continuar con el aislamiento de compuestos de estas

especies y así conocer la estructura química de dichos compuestos aislados y que

permitan conocerlos y así detectar su mecanismos de acción y su uso adecuado

avalado científicamente.

8. CONCLUSIONES

 De los extractos obtenidos el porcentaje de rendimiento de las plantas

en estudio, el mayor rendimiento fue la de I.anisatum de 31.26%

correspondiente al extracto metanólico y de 28.3% al extracto

hexánico, siendo P.anisum el de menor rendimiento con un 12.13%

en el extracto metanólico.
<

 Los extractos tanto metanólicos como hexánicos de las especies de

anís P.anisum, I.verum y I.anisatum, aun no siendo compuestos puros

presentaron actividad inhibitoria sobre el crecimiento axénico in vitro

de E. histolytica.

lxxxi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

 El extracto metanólico de P.anisum presentó la CI50 más baja, la

cual fue de 0.034 mlg/ml sobre cultivos axénicos in vitro de E.

histolytica, seguido por el extracto hexánico de I.verum con un CI50

de .082 mg/ml

 El extracto metanólico de fruto I.verum, I.anisatum, P.anisum

presentaron capacidad de inhibición sobre E.coli

 El extracto hexánico de fruto I.verum, I.anisatum, presentaron

capacidad de inhibición sobre S. typhi y Salmonella sp.

 Se identificó la presencia de oxídrilos fenólicos, flavonoides,

alcaloides, en todos los extractos de I. anisum, I.verum y I. anisatum

 De los estudios espectroscópicos de resonancia magnética nuclear y

espectroscopía de masas de la fracción 7 del extracto metanólico de

P.anisum, se propone la estructura 1-benzopirilio (C11H11O2)

lxxxii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

9. LITERATURA CONSULTADA

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ANEXOS

Se analizaron los espectros de 13C-RMN de la fracción 7 del extracto de P. anisum.

como se muestra a continuación:

xci
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Fig.23 Espectro 13CNMR del Compuesto obtenido de la fracción 7 Rf 0.93 del


extracto de P. anisum

xcii
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Fig.24 Espectro DEPT90 del Compuesto obtenido de fracción 7 Rf 0.93 del


extracto de P. anisum

Fig.25 Espectro DEPT135 del Compuesto obtenido de la fracción 7 del extracto de


P. anisum.

Tabla X. Datos Espectroscópicos 13C-RMN del Compuesto obtenido de la fracción


7 del extracto de P. anisum

xciii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Señal  DEPT 90 DEPT 135


1 56.58 (0) (+) CH3
2 101.84 (+) CH (+) CH
3 113.5 (+) CH (+) CH
4 114.03 (+) CH (+) CH
5 114.16 (0) (0) Cq
6 123.72 (0) (0) Cq
7 130.6 (+) CH (+) CH
8 145.97 (+) CH (+) CH
9 160.52 (0) (0) Cq
10 164.88 (0) (0) Cq
11 165.13 (0) (0) Cq
12 169.73 (0) (0) Cq
13 174.34 (0) (0) Cq
14 178.93 (0) (0) Cq

HMQC

1
Señal DEPT 90 DEPT 135 JC-H
1 (0) (+) CH3 Q
2 (+) CH (+) CH V
3 (+) CH (+) CH U
4 (+) CH (+) CH W
5 (0) (0) Cq
6 (0) (0) Cq
7 (+) CH (+) CH X
8 (+) CH (+) CH Y
9 (0) (0) Cq
10 (0) (0) Cq
11 (0) (0) Cq
12 (0) (0) Cq
13 (0) (0) Cq
14 (0) (0) Cq

xciv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

10. APÉNDICE

xcv
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

10.1 RESUMEN CURRICULAR

Yadira Quiñones Gutiérrez

Candidato para el Grado de

Doctor en Ciencias con Acentuación en

Química de Productos Naturales

Tesis: ANÁLISIS DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS DE ESPECIES MEXICANAS DE


ANÍS Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA SOBRE
MICROORGANISMOS PATÓGENOS.

Campo de Estudio: Ciencias Biológicas

Datos Personales: Nacida en Poza Rica, Veracruz el día 25 de Noviembre de 1974.

Educación: Egresado de la Universidad Autónoma de Nuevo León, grado obtenido Químico


Bacteriólogo Parasitólogo 2000.Doctorado en Ciencias con Acentuación en Química de

xcvi
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Productos Naturales 2012, becado por CONACyT No. 204368.

Experiencia Profesional: Maestra de Ética, sociedad y profesión, Métodos alternos


de Solución de Controversias.(2001-2012)

Número de Publicaciones: 1

10.2 ARTÍCULO

Dear Dr. Quiñones,

We are pleased to inform you that your manuscript has been accepted for publication in the
African Journal of Biotechnology. There are some corrections which we will make before the
proof is sent to you.For further enquiries on the publication of your Manuscript, please send
a mail to ajbproof.acadjourn@gmail.com.

Best regards,

Dr. N. John Tonukari

Editor, African Journal of Biotechnology

E-mail: ajb@acadjournals.org

http://www.academicjournals.org/AJB

ISSN 1684-5315

xcvii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

IN VITRO STUDY OF ANTIAMOEBIC ACTIVITY OF METHANOL EXTRACT OF

FRUIT OF Pimpinella anisum ON TROPHOZOITES OF Entamoeba

histolytica HM1-IMSS

Quiñones-Gutiérrez Y., Verde-Star, M.J., Rivas-Morales C., Oranday-Cárdenas A,

Mercado-Hernández R., Chávez-Montes A., Barrón- González M.P.

ABSTRACT

The aniseed plant Pimpinella anisum (Saunf - Hindi) is one of the most ancient
medicinal plants used by the man. Currently, this plant has several uses in food
industry as spice, whereas in the pharmacopoeia is used as expectorant in digestive
disturbances, as mild diuretic, and as insect repellent in external use. In this paper
was evaluated the biological activity of methanolic extract of Pimpinella anisum on in
vitro growth of Entamoeba histolytica HM1-IMSS under axenic conditions. We
observed that the growth inhibition of E. histolytica was at CI50=0.034 µg/mL. Results
confirmed the antiamoebic activity of the methanolic extract of P. anisum.

Key word : Pimpinella anisum, Entamoeba histolytica, antiamoebic activity

Corresponding author: Quiñones Gutiérrez Y.

xcviii
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

INTRODUCTION

Among parasitic infections, amoebiasis ranks third worldwide among lethal infection,
after malaria and schistosomiasis (Walsh, 1988; Petri and Mann, 1993). Amoebiasis
is caused by Entamoeba histolytica, a protozoan parasite of humans and the
causative agent of intestinal amoebiasis. This disease is a major health problem in
developing countries (Stanley, 2003). Amoebiasis is acquired by ingestion of the E.
histolytica cyst in contaminated food or water (Botero and Restrepo, 2003).
Although it is asymptomatic in 90% of cases, about 50 million people are estimated
to suffer from symptoms associated to amoebiasis, such as hemorrhagic colitis and
amoebic liver abscess (Ravdin, 1995). These infections result in 50 000-100 000
deaths annually. Amoebiasis contributes to the prevalence of gastrointestinal
disease and is defined by the World Health Organization and the Pan American
Health Organization as the presence of the parasite with or without clinical
manifestations (WHO, 1997).

The Dauphin de France was the first known patient with amoebiasis treated by an
extract of the root of ipecacuana plant, and little progress was made during the next
200 years (Laserre, 1979). Many drugs have been used for the treatment of
amoebiasis, mainly nitroimidazole derivatives of such as emetine, metronidazole,
and ornidazole. In 1966, Powell et al, reported the success of metronidazole in the
treatment of amoebic dysentery and liver abscess. Metronidazole and imidazole
derivatives are the drugs of choice for the treatment of amoebiasis; however, E.
histolytica has developed resistance mechanisms to these drugs (Samarawickream
et al., 2007; Wassmann et al, 1999; Orozco et al., 2002). In addition, there have
been reports that these drugs could induce mutagenic (Legator et al, 1975),
carcinogenic (Chacko y Bhide 1986) and neurotoxic activity (Olson et al. 2005).

In addition to nutrients, vegetables and fruits may contain several phytochemicals


that prevent certain diseases. The classic concept of nutrition has been expanded to
include functional nutrition or nutraceuticals, which refers to the potential of certain
foods to promote and improve health by reducing the risk for disease (Vaclavik et al,
2008).

xcix
Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

Pimpinella anisum is one of the oldest plants used in food industry, perfumery and
medicine. P. anisum has been used as digestive stimulant, antiparasitic and
antifungal (Soliman 2002) and antipyretic agent (Afifi et al., 1994). In addition, the
plant and especially the essential oil of fruit have been used for the treatment of
some diseases including epilepsy and seizures (Avicenna, 1988; Abdul-Ghani et al.,
1987); as well for constipation (Chicouri, 2000), and has proven activity as a muscle
relaxant (Albuquerque et al., 1995).

Recently, it has been reported that this oil has been used as a substitute for
antibiotics in chickens (Mehmet et al., 2005). Nevertheless, there are few reports on
antibacterial activity studies of P. anisum (Singh et al., 2002 and Tabanca et al.,
2003).

Recently, Akhtar et al. (2008) demonstrated the P. anisum bactericidal activity after
testing the methanolic extract from seeds against Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.

In developing countries, medicinal plants are popular because of their products are
safe and widely available at low cost. Some compounds extracted from medicinal
plants already play an important role against infectious disease, per e.g. the quinine
extracted from Cinchona sp., and the artemisinin from Artemisia annua. Both
compounds are effective against malaria. Considering their therapeutic potential, it
is important to obtain information from the exact doses to become effective.
Therefore, the aim of this study is to evaluate the antiamoebic activity of methanolic
extract from P. anisum in vitro under axenic conditions on Entamoeba histolytica
HM1-IMSS and identified antiamoebic components present in methanolic extract of
P. anisum.

Material and Methods

-Vegetal material and preparation of methanol extracts. Fruits collection: The fruits
of Pimpinella anisum were purchased from the local market. The material was
identified as P. anisum by the Department of Botany, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León.

-Extraction: The methanolic extract of P. anisum was obtained by taking100g


samples of fruit and individually processed in a Soxhlet unit with methanol (MeOH)
at 60°C for 7 h. The extract was then filtered and concentrated in vacuum at 45°C.
Methanol extract was dried under room temperature and weighed to calculate the
extractability percentage. The extract was stored at 40°C until further use.

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Tesis Doctorado Yadira Quiñones Gutiérrez 2012

-Antiamoebic activity of the P. anisum methanolic extract: Trophozoites of


Entamoeba histolytica strain HM1:IMSS at a density of 1x104 trophozoites per mL
were added to TYI-S-33 medium (Diamond, L.S., 1978), containing 1%
penicillin/streptomycin and 10% heat inactivated bovine serum. E. histolytica
trophozoites were then incubated in 13X100mm screw-cap tubes (PYREX®) at
37°C for 72 h. Tubes were then placed in iced water for 10 min to detach cells
adhering to the base of the tube and were inverted 15 times and then cell density
was determined by using a hemocytometer (Neubauer, Hausser Scientific). When
the culture of E. histolytica was grown logarithmically, trophozoites were harvested
and suspended in 50  μL phosphate-buffered saline, pH 7.4 (PBS) at 1×104
trophozoites per mL. These suspensions were inoculated separately in 1  mL
screw-capped borosilicate vials (Bellco, Vineland, NJ, USA) containing 1 mL of TYI-
S-33 medium (Diamond L.S., 1978), vials were added containing 50  μL of various
concentrations of the P. anisum methanolic extract (0.1, 1.0, 3.0 y 5.0 mg per mL)
and incubated for 6 d at 37°C. The solutions were sterilized by filtration through a
0.22 µm pore–size membrane (MercK Millipore). A control containing 50  μL of
DMSO was included in each assay. Preliminary test with DMSO were performed to
ensure that no trophozoite inhibition occurred at the concentrations used. After that,
cell density was determined by using a hemocytometer (Barrón et al., 2008). The
positive controls contained metronidazole (0.124 µg/mL) instead of methanolic
extract. Bioassays were done by triplicate. Fifty percent inhibitory concentration was
determined by using the Probit test.

The inhibitory effect of the P. anisum methanolic extract was estimated as the
decreased percentage of trophozoite number with respect to nontreated cultures.
Corresponding averages and standard deviations (SD) were plotted. The fifty
percent inhibitory concentration (IC50) of the P. anisum methanolic extract was
expressed as the concentration that produced a 50% decrease of trophozoite
concentration in each of the three protozoa species. Each determination was
performed three times, in triplicate. The effect of metronidazole was expressed as a
diminution percentage with respect to nontreated controls.

-Statistical analysis: SPSS software, version 10.0 (SPSS, Inc.), was used for
statistical analysis.

Phytochemical tests: Conventional chemical tests were used to identify functional


groups in the methanolic extract (Domínguez, 1973).

RESULTS AND DISCUSSION

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The yield of the methanolic extraction process for each 100 g of P. anisum fruit was
12.13% wt/wt. Methanolic extract from P. anisum showed E. histolytica trophozoites
growth inhibition when tested by in vitro culture under axenic conditions. Resultas
showed a dose-reponse behavior, were inhibition rate were significantly different
extract doses. At a rate of 0.1 mg/mL, the inhibition ranged 68%, 74% it inhibited the
dose of 1 mg/mL, at the dose of 3 mg/mL was 87% and at 5 mg/mL was 99.18%
(Fig. 1).

The inhibition concentration analysis showed that methanolic extract had an IC50 of
0.0345 mg/mL on in vitro growth of E. histolytica trophozoites (Fig. 2), whereas
metronidazole had an IC50 of 0.1442µg/mL. Values were expressed as the mean +
standard error (n=9). The Probit value was expressed relative to the metronidazole
effect.

Analysis of the P. anisum methanolic extract using silica gel chromatography


showed three fractions. The inhibition rate of each fraction was separately
evaluated. Results showed that regardless the fraction tested, all presented the
highest inhibition growth at 0.47 mg/mL (74% inhibition). In order to identify the
compound (s) present in each fraction The third fraction was analyzed by mass
spectrometry, showing a lead compound with a molecular weight of 175, an
aromatic ring, double bonds and a methyl group (methoxy), obtaining as the
structure of 1-benzopyrylium as responsible for the antiamoebic activity. 1-
Benzopyrylium is a widely distributed molecule within plants, and it is partially
present as anthocyanins flavones.

All together, results provide evidence of E. histolytica trophozoites growth inhibition


by methanol extract of P. anisum fruits. In addition, one aout of three fractions
obtained from the methanolic extract was positively identified as 1-benzopyrylium.
We believe that this support new evidence of metabolites derived from plants with
antiamoebic activity. The methanolic extract of P. anisum has a great popular
worldwide as it is used as food which is an advantage in terms of popular
acceptance for use.

Other species, such as Anisatum ilicium is similar in morphology and chemical


composition to Illicium verum. In I. verum has been identified the veranisatinas A, B
and C, which present low-power neurotoxic, while in I. anisatum has been detected
the presence of anisatin and neoanisatin, the most toxic therapeutic compounds
against pathogenic microorganisms to man, with anti-inflammatory and antifungal
activities. It has also been reported that the aqueous extract of the fruit of I. verum
has antibacterial activity against Bacillus subtilis, as well as antiviral activity against
herpes virus-type 2, influenza virus, smallpox virus and poliovirus II. The essential
oil obtained from the fruit is active against B. subtilis, Escherichia coli and

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Pseudomonas aeruginosa, as well has been reported antifungal activity against


Candida albicans and seed essential oil has activity against Candida lipolytica
(Argueta 1994).

Methanolic extract of P. anisum, as well as three of their fractions, could be


evaluated on the process of encystment of Entamoeba histolytica and biological
activity on other pathogens of man.

CONCLUSION

Methanolic extract of fruit of Pimpinella anisum shows growth inhibition activity


against Entamoeba histolytica trophozoites strain HM1:IMSS under axenic
conditions in vitro.

ACKNOWLEDGMENTS: This work was supported by CONACYT no.204368.

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