Sunteți pe pagina 1din 42

Ce am invatat in cursul 1

 Biotehnologia – definitie
 Biotehnologia verde, rosie, alba

si albastra
Curs 2

Procese biotehnologice
Conceptul de proces biotehnologic

 Cerintele consumatorului → orienteaza


sectoarele economice.
 Consumatorul are nevoie de:

- un mediu prielnic, nepoluat;

- alimente sanatoase;

- venit corespunzator.


dezvoltarea unor activitati noi care sa
imbunatateasca viata oamenilor →
„biotehnologia”.
 Pana in anii ’70 conceptul de biotehnologie
este, putin folosit;
 “microbiologia industriala”, se refera la
utilizarea industriala a potentialului productiv al
culturilor de microorganisme.
 revolutia stiintifica din biologie a condus la
aparitia si evolutia ingineriei genetice - doua
mari etape:
- cea a biotehnologiei clasice (traditionale), ca
substitut, inlocuitor modern al microbiologiei
industriale si,
- biotehnologia moderna (noua biotehnologie),
care se bazeaza pe ingineria genetica.
 La dezvoltarea biotehnologiei moderne au mai
intervenit si alte sectoare de activitate ca:

 Ingineria biochimica, desprinsa din ingineria


chimica, se contureaza tot mai mult ca o
stiinta inginereasca de sine statatoare.
 Ingineria enzimatica conduce la dezvoltarea
industriilor alimentara, farmaceutica, textila,
energetica, extractiva etc., care utilizeaza
bioconversii si biotransformari in scopuri
preparative, asistate de enzime drept
catalizatori.
 Biologia cu toate domeniile ei:
- microbiologie

- biologie moleculara/celulara

- inginerie genetica

Chimie
Biochimie
- inginerie enzimatica

- inginerie a proteinelor

- inginerie a materialelor (biomateriale)

demonstreaza caracterul multi- si pluridisciplinar al


biotehnologiei ca stiinta.
 Biotehnologia:
- ultima revolutie tehnologica majora a
secolului;
- este strans legata de problemele de
maxim interes ale dezvoltarii umane:
diagnosticarea si vindecarea bolilor,
securitatea si siguranta alimentara si
protejarea mediului inconjurator;
- va deveni una dintre cele mai
importante arme de lupta impotriva
foametei, malnutritiei populatiei.
 Imbunatatirea rezistentei naturale (a
plantelor si a animalelor) fata de boli
sau stres va conduce la:
- reducerea utilizarii pesticidelor chimice
- reducerea utilizarii fertilizatorilor si
medicamentelor
- intensificarea implementarii practicilor
agronomice rentabile
- intensificarea metodelor de conservare
sau de reducere a eroziunii solului.
 Biotehnologia ofera:
- noi cai de protejare si imbunatatire
ambientala, prin metode de
bioremediere a aerului, solului si apelor
poluate, a deseurilor;
- dezvoltarea unor procese si produse
industriale mai curate (biocataliza).
Biocataliza sursa Carmen Boeriu, Wageningen UR, prezentare Workshop Diaspora

Protein
engineering,
over-expression,
CD, fermentation,
DSP
Principalele domenii biotehnologice sunt:
Biotehnologia plantelor - reproducere si propagare,
modificari genetice, ameliorare a conditiilor de
crestere si a unor proprietati, protectia plantelor,
biodiversitate, ecologie etc..

Biotehnologia animala - reproducere, productie,


ameliorare a cresterii si dezvoltarii, ameliorare si
modificare ale unor caracteristici de productie,
acvacultura, biodiversitate etc..

Biotehnologia mediului - degradare/transformare a


poluantilor, tratare si bioremediere ale solurilor,
bioepurare a apelor reziduale, recuperare si
biotransformare ale unor produse secundare din ape
reziduale etc..
 Biotehnologie industriala
- obtinerea de produse terapeutice, nutrienti,
produse de diagnostic, produse alimentare si
bauturi;
- imbunatatire a calitatii hartiei, a produselor
textile si din piele;
- obtinere de produse chimice si formule de
detergenti de ultima generatie.
 Obtinerea proteinelor reprezintă
principala categorie de produse
terapeutice:
- chirurgia;
- tratarea traumatismelor (refacerea
ţesuturilor);
- boli cronice degenerative;
- boli infecţioase, microbiene şi virale;
- boli ereditare, terapia anticanceroasă.
 Din 1982, au fost lansate în producţie
peste 95 de proteine sau peptide
terapeutice, alte sute fiind în curs de
dezvoltare şi testare.
 peptide scurte (cu mai puţin de 30 de
aminoacizi) pot fi sintetizate chimic,
celelalte sunt produse de celule vii (în
general, recombinante exprimând
proteine umane) de bacterii, fungi,
insecte sau mamifere, obtinute prin
biosinteză în condiţii de sterilitate.
 Costurile mari de capital necesare extinderii
capacităţilor de producţie au determinat
trecerea la producţia de proteine cu animale
transgenice (ex. vaci, capre) sau plante
transgenice, eliminând riscul contaminării
virale, existent la celulele de mamifere.
 L-aminoacizii pot fi obţinuţi, industrial, din
hidrolizate proteice (ex. L-cisteină din hidrolizat
de păr), dar în urma unor procese laborioase şi
poluante; sinteza chimică e o altă cale de
producere a aminoacizilor, dar în formă
racemică (ex. D,L-metionină).
 În prezent, majoritatea aminoacizilor se
produce prin biosinteză cu bacterii sau enzime,
cu avantajul obţinerii selective numai a
izomerului asimilabil L-.
 Începută cu acidul L-glutamic, biosinteza
microbiană de Corynebacterium glutamicum a
realizat, cu mutanţi ai acestei bacterii, alţi
aminoacizi importanţi, ca L-lizină şi L-treonină.
1. În prezent, utilizând tehnica RMN cu 13C, s-a
reuşit descifrarea căilor metabolice ale
biosintezei bacteriene, cunoscând, astfel,
punctele cheie asupra cărora s-ar interveni
prin recombinare genetică, supraexprimând
genele relevante (inginerie metabolică).

1. Dezvoltarea în ultimii ani a metodelor de


secvenţiere completă a genomului bacterian a
permis cunoaşterea genomului
Corynebacterium glutamicum.

2. Tehnologia cip-ADN poate conduce, prin


transcripţie şi marcare fluorescentă, la
identificarea genelor active şi a mecanismelor
de reglare a metabolismului.
4. Cercetarea proteomică prin gel-
electroforeză şi spectrometrie de masa, permite
analiza diferitelor enzime necesare biosintezei
aminoacizilor si produse de bacterii în condiţii
variate.
- separare şi caracterizare a proteinelor
celulare, chiar
la concentraţii infime → cunoaşterea tintelor
terapeutice
si drug-design-ul- sau proiectarea structurilor
selectiv
active.
 Biotehnologia medicala si genetica cuprind:
- Genomica - activităţi de secvenţiere a genomului
uman şi a altor organisme procariote sau
eucariote; provocarea - stabilirea funcţiei genelor,
ca precondiţie a identificării ţintelor terapeutice
potenţiale.

În acest sens, apar:


1. genomica de tip comparativ, identificând căile
metabolice şi funcţiile esenţiale în organismul viu,
genele lor comune, cărora le corespund zone de
reglare ca potenţiale ţinte terapeutice;

2. secvenţierea genică a organismelor patogene,


permiţând identificarea ţintelor pentru
medicamentele care le pot combate virulenţa şi
caracterul patogen;
3. sisteme model de analiză genomică, ca
drojdii, produşi de exprimare ai unor
gene umane putând deveni ţinte ale
medicamentelor;
4. studiul interacţiunilor între proteine şi
între acestea şi ADN, furnizând
mecanisme de reglare ca posibile ţinte
terapeutice;
5. identificarea mutaţiilor genetice
asociate bolilor, produşii generaţi fiind,
de asemenea, ţinte potenţiale.
 Informatica in biotehnologie, bioinformatica, la
interfaţa dintre biologie şi informatică
- prelucrarea computerizată a informaţiilor
permiţând, înaintea screening-ului, modelarea şi
simularea în scopul predicţiei şi selecţiei.
 screening-ul noilor medicamente potenţiale: s-a
ajuns la aşa-numitele sisteme de screening cu debit
înalt sau ultraînalt, (high throughput screening –
HTS sau UHTS), utilizând biodeterminări
corespunzătoare acestor mari viteze de testare:
bazate pe interacţiune ligand-receptor sau sisteme
celulare, ex. celule animale pentru secvenţe genice
omoloage.
 principii de detecţie (cu semnale electrice, de
scintilaţie, luminiscenţă, fluorescenţă ş. a.)
adecvate robotizării şi automatizării, care permit
funcţionarea independentă de comandă umană
timp de 24 ore.
 prin biochimia şi chimia combinatorie se
obtine creşterea numărului de structuri
propuse şi sintetizate pornind de la structuri
bloc conducătoare în urma screening-ului,
sintetizând şi separând un număr mare de
derivaţi prin metode automatizate.
 Tehnologia informaţiei se aplică la realizarea
unor “biblioteci” de asemenea structuri, care
permit interpretarea şi selecţia celor ce
candidează la studiul chimic.
 dezvoltarea proceselor cu membrane semipermeabile,
înlocuind separările convenţionale, avantaje:
- utilizarea unor temperaturi scăzute (energo-
economice, menajează bioprodusele, în general
termolabile);
- recuperarea substanţelor valoroase, care însoţesc
produsul principal;
- separarea înalt - selectiva a produselor;
- caracterul modular, descentralizat al funcţionării
instalaţiilor.

Studiu mai individualizat referitor la tipul de membrane


si condiţiile adecvate unui anumit proces, în comparaţie
cu tehnicile clasice de separare, având un caracter mai
universal şi o verificare mai îndelungată în practică.
 Domeniile de aplicaţii ale acestei tehnici
moderne includ:
- biosinteza în bioreactoare cu celule imobilizate
pe membrane;
- procesarea down-stream (in flux continuu) a
mediilor după biosinteză;
- obţinerea unor formulări cu eliberare
controlată a substanţei active imobilizate pe
membrane;
- obţinerea de emulsii la nivel de nanoparticule;
- sterilizarea la rece a mediilor şi produselor;
- purificarea apelor uzate.
Procese de biosinteza
 biosinteza de compusi noi = procesul de crestere al
microorganismelor pornind de la substantele
nutritive din mediu.
 Celula = factor biochimic microscopic.
 Nutrienti: azotul, carbonul, oxigenul etc.→ sunt
introdusi in celula si transformati printr-o serie de
reactii.
 Activitatile metabolice din interiorul celulei sunt
reglate atat in interiorul cat si din exteriorul celulei.
 Activitatea biologica a celulei este extrem de
sensibila la mediul la care este expusa.
 La reglarea complexa care apare in interiorul celulei
este foarte important sa se inteleaga cum afecteaza
factorii de mediu si nutritionali metabolismul
celular.
 Activitatea normala a microorganismelor este
conditionata de existenta unui anumit raport intre
volumul celulei si suprafata ei.
 In timpul cresterii celulei, raportul suprafata/volum se
modifica deoarece suprafata creste cu o ratie
patratica iar volumul cu o ratie volumica, ceea ce
conduce la o micsorare relativa a suprafetei.
 Pe masura ce dimensiunile celulei cresc se produce o
alterare a echilibrului biologic al celulei deoarece
concentratia unor compusi scade iar altii se
acumuleaza in cantitate mai mare, ingreunand astfel
circulatia substantelor prin difuziune in ambele
sensuri. Din aceasta cauza apare diviziunea celulara ca
o forma de reglare automata a activitatii celulare.
 Multiplicarea procariotelor (celulelor
bacteriene) se realizeaza prin doua cai:
- diviziunea simpla, direct sau binara =
multiplicarea generala
- inmugurirea sau ramificarea (exceptionala)
fiind prezenta la un numar redus de bacterii. In
timpul unei biosinteze industriale, reactiile
biochimice care se produc au la baza:
Mediu de cultura(substrat) +O2+inocul =
CO2+NH2+biomasa noua+alti produsi finali
Corelatii intre numarul de celule si
biomasa celulara
Grupe de mo Nr. celule Masa, g

Drojdii 2x10(13) 2,9


Mucegaiuri
Superioare 10(8) – 4x10(8) 1-5
Bacterii 2x10(10) 0,02
Virusuri 10(11) 0,0005
Medii de cultura
Un mediu de cultura = amestec de substante care
asigura toate componentele necesare pentru
metabolismul celulei, si anume:
- surse de carbon;
- azot;
- substante minerale;
- factori de crestere;
- substantele dizolvate - la o concentratie a
corespunzatoare presiunii osmotice celulare;
- cu valori de pH si rH optime cresterii si multiplicarii
microoranismelor de cultivat.
 Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea si
conservarea microorganismelor sau pentru
obtinerea prin cultivare a produselor de biosinteza
microbiana. Mediile pot fi procurate de la firme
producatoare sau pot fi preparate in laborator.
 Mediile de cultura pot fi generale sau
selective. Cele generale sunt folosite pentru
cultura tuturor bacteriilor, drojdiilor sau
mucegaiurilor. Mediile selective sunt special
pregatite de a inhiba anumite
microorganisme si a favoriza pe cele care se
doresc a fi studiate.
 Cultura = crestere controlata a unui
microorganism.
 Cultura microorganismelor este utilizata pentru
a creste numarul de celule care se doreste a fi
studiate.
 Microorganismele sunt adaugate in mediul de
cultura care contine nutrienti pentru crestere.
 Cultura este incubata una sau mai multe zile, la
temperatura optima a fiecarui organism. In
multe cazuri microorganismele sunt crescute pe
placi cu agar. Microorganismele se multiplica
formand colonii. O colonie creste in locul in
care o singura celula a fost innoculata. O
colonie este ca o clona. Ea poate fi pura daca
nu exista in jurul ei alte tipuri de
microorganisme in colonii care o pot
contamina.
 culturile lichide - microorganisme anaerobe. Prezenta
celulelor de microorganisme este evidentiata prin
aparitia unei tulbureli a lichidului, care se intensifica in
timp ce cantitatea de masa celulara creste.

 culturi pe medii solide se obtin prin adaugarea in


mediile lichide a unor agenti de solidificare ca: agar-
agar (geloza), un poliglucid obtinut din alge ale
genului Gelidium avand in stuctura molecule de
galactoza si acid D-galacturonic legate prin legaturi
1,2 si 1,3 glicozidice. In stare purificata se prezinta sub
forma de pulbere sau fibre la care se adauga 0,5 pana
la 2% mediu lichid. Se solubilizeaza la temperatura de
fierbere si gelifica la temperatura de 42-45ºC.
 Un alt agent de solidificare este gelatina, de natura
proteica, extrasa din tesuturi colagenice. Se
foloseste in cantitate de 12-15%. Se fluidifica la
temperaturi mai mari de 35ºC si gelifica lent sub
temperatura de 30-35ºC.
 Cultivarea microorganismelor necesita tehnici si
materiale sterile.
 Sterilizarea este un proces de eliminarea a tuturor
microorganismelor. Sterilizarea se poate face prin
incalzire in cuptoare, etuve, autoclave etc. De
asemenea pentru sterilizare se pot folosi filtre
microbiologice, care sunt in general scumpe si
substante chimice (dezinfectanti, antiseptici,
antibiotice) care impreuna cu sterilizarea prin
incalzire sunt cele mai folosite.
 Si radiatiile pot fi agenti de sterilizare. Nivele ridicate
de radiatii pot omora microorganismele prin
distrugerea materialului genetic (ADN si ARN).
 Cand microorganismele cultivate cresc pe
medii de cultura trebuie sa se ia masuri
preventive ca alte microorganisme sa nu le
infecteze. Multe dintre micoroganismele
cultivate, care se doresc a fi studiate, au
nevoie de aer, dar odata cu aerul pot intra si
alte micoorganisme.
 Din cauza acestor cerinte ale
microorganismelor, mediile de cultura sunt
diferite. Se cunosc a fi folosite medii de
cultura generale, selective, de diferentiere,
de imbogatire. O alta clasificare poate fi
facuta in, sintetice sau naturale.
 Mediile de cultura generale utilizate frecvent sunt: bulionul de
carne lichid sau gelozat (BCA), mediul triptona-extract de
drojdie-glucoza-agar (TEGA) pentru cultivarea bacteriilor si
mustul de malt – agar (MMA) pentru cultivrea drojdiilor si
mucegaiurilor.
 Mediile de cultura generale pot fi definite cand in compozitia
lor intra substante chimice pure, precis dozate conform retetei
si medii complexe in care intra compusi naturali cu o compozitie
variabila (ex. soia su drojdiile).
 Medii de cultura selective sunt medii definite sau complexe, cu o
compozitie chimica definita care permit dezvoltarea unui numar
restrans de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii
contin pe langa substante nutritive si inhibitori ai altor
microorganisme insotitoare din microbiota din care se face
izolarea culturii care se doreste a fi selectionata.
 De exemplu, multe bacterii gram negative nu pot
creste la concentratii mari de sare. in timp ce
bacteriile gram pozitive pot. Mediile cu continut
mare de sare selecteza bacteriile gram pozitive
de cele gram negative.
 Medii de cultura de diferentiere permit
separarea speciilor in functie de anumite
caractere biochimice atunci cand acestea au fost
selectate dintr-o microbiota eterogena. De
exemplu, mediu de agar cu sange de oaie poate fi
intrebuintat pentru a diferentia specii din cadrul
genului Streptococcus. Toate speciile cresc pe
acest tip de mediu, dar coloniile lor arata diferit.
Selectarea si diferentierea mai multor
specii de Bacillus
 Medii de cultura de diferentiere si selective pot
selecta anumite microorganisme si in acelasi
timp diferentia diferite tipuri de bacterii. De
exemplu, pot selecta bacteriile gram negative si a
le alege pe cele care fermenteaza lactoza, in
scopul producerii de acid lactic. Acidul produs
prin fermentatie coloreaza indicatorul de pH in
rosu-portocaliu, deci coloniile cu aceasta culoare
sunt identificate ca cele care fermenteaza
lactoza.
 Medii de imbogatire, fortifiate sunt destinate
microorganismelor pretentioase din punct de vedere
nutritiv si care se afla in numar redus in produsul
analizat din punct de vedere micorbiologic.
 Pentru a le evidentia, se fac treceri din produsul
alimentar in mediul de imbogatire, steril si se asigura
inmultirea celulelor izolate. De aici se face transferul
pe medii de diferentiere iar rezultatul se exprima prin
absenta sau prezenta lor. De exemplu la
determinarea bacteriilor din genul Salmonella,
normele microbiologice stabilesc absenta lor in 25
grame de produs.
 Mediile naturale sunt foarte folosite deoarece
reproduc conditiile ambientale in care se dezvolta
microorganismele. Ele pot fi sucuri sau piureuri de
fructe sau legume, mustul de malt, infuzii de plante,
lapte, sange, zerul, carnea, bulionul de carne, ficat,
oua.
 Medii fermentative sunt medii de cultura industriale.
In compozitia lor intra ca surse de carbon melasa,
zaharoza, saruri minerale, fainuri, cereale boabe, zer,
amidon etc. Ca sursa de azot in aceste medii pot fi
folosite fainuri proteice de soia, sulfatul de amoniu,
uree si ingrasamant complex. Pentru imbogatirea in
saruri minerale se folosesc: fosfati, sulfati, cloruri.
 Nu toate microorganismele pot fi crescute in
cultura.
 Sunt multe bacterii, fungi, virusuri sau protozoare
din mediul inconjurator care nu pot fi cultivate in
laborator. Acestea trebuie observate direct la
microscop. Ne referim aici in special la unele
microorganisme patogene si la cele care se dezvolta
in interiorul organismului animal sau uman (visuri si
protozoare).
MEDII DE CULTURA

Mediile de cultura folosite in laboratorul de microbiologie reprezinta substrate


pentru cresterea, dezvoltarea, inmultirea si mentinerea microorganismelor. Mediile de
cultura pot fi lichide sau solide, pot fi preparate din reactivi ind ividuali sau se pot obtine
prin rehidratarea unei pulberi (medii deshidratate), care contine toti ingredientii necesari
cresterii microorganismelor prezente in alimente. Dupa scopul utilizarii, mediile se pot
imparti in medii simple sau de izolare si medii speciale (medii de imbogatire, medii
elective, medii selective, medii diferentiale, medii de conservare sau de mentinere).

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA

Cantarirea ingredientelor sau a mediului deshidratat (mediu complet)

I
Dizolvarea si omogenizarea pulberii prin incalzire pana la fierbere

I
Corectarea pH-ului, in functie de specia care urmeaza a fi cultivata

I
Repartizarea mediului in baloane de sticla, eprubete sterile cu dop

I
Sterilizare la 1200C, 30 min

I
Depozitare la 40C