PRÁCTICA Nº 03

ESTRUCTURA, MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

I. COMPETENCIAS:
 Reconoce la parte mecánica, óptica y de iluminación del microscopio compuesto.
 Manipula y cuida adecuadamente el microscopio compuesto durante su uso.
 Reconoce y valora la importancia de la utilización del microscopio compuesto en la realización de trabajos
de enseñanza e investigación en el campo de la Microbiología.

II. INTRODUCCIÓN.

Los organismos vivos pueden ser unicelulares o multicelulares. La mayoría de las células no son
visibles a simple vista. Para observar y estudiar las células y los tejidos, se usan diferentes tipos de
microscopios. El microscopio de disección, se utiliza para el estudio de objetos relativamente grandes, de
aproximadamente 0.05 a 20 milímetros. Los microscopios electrónicos, son utilizados para el estudio de
objetos muy pequeños, hasta menos de un nanómetro (1 nanometro = 0,000000001 metros. Es decir, es la
mil millonésima parte de un metro, o millonésima parte de un milímetro. 1 milímetro = 1.000.000 nanómetros).
El microscopio compuesto, se utiliza principalmente para el estudio de objetos de aproximadamente uno a
2000 micrómetros (µm), aunque se pueden ver cosas aún más pequeñas con el empleo de técnicas
especiales.
En el microscopio compuesto, la propiedad de hacer que las imágenes de las cosas se vean más
grandes se conoce como ampliación o magnificación, y la capacidad de distinguir detalles entre dos puntos
muy cercanos se conoce como poder de resolución o poder de separación. El poder de resolución
determina los límites prácticos a los que puede ser llevada la ampliación de la imagen. La resolución es más
importante que la ampliación, debido a que es indispensable observar con claridad los detalles finos.
II. MATERIALES Y MUESTRAS
MATERIAL INDIVIDUAL: (Bajo responsabilidad de los estudiantes)
• Un frasco vacío pequeño con gotero.
• Un frasco de vidrio ámbar reciclable (de jarabe que ya no uses)
• 5 Láminas y 5 laminillas
• Una caja de Fósforo
• Un marcador de tinta indeleble
• Gorro
• Mandil
• Guantes
• Mascarilla
PARTES PRINCIPALES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO
Sistema mecánico: Comprende los siguientes dispositivos
 Base: da soporte y estabilidad
 Columna o brazo: Sostiene los oculares y objetivos
 Platina: Superficie para colocar la lámina portaobjeto.
 Ajuste mecánico de la platina: Ajusta y mueve el porta objeto para su exploración
 Revólver: Anillo que gira sobre su eje, contiene los objetivos de diferentes aumentos
 Cabezal: Contiene los oculares
 Anillo de enfoque del ocular izquierdo: Se usa para compensar la diferencia de visión que existe entre
los dos ojos
 Ajuste de distancia interpupilar: Adapta la distancia lateral de los oculares según la distancia de los ojos
del observador

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 Tornillo macrométrico: Sirve para hacer ajustes gruesos, para subir y bajar la platina rápidamente; se
usa solamente con los objetivos de 4x y 10x
 Tornillo micrométrico: Sirve para hacer ajuste fino, para subir y bajar la platina muy lentamente; se usa
con todos los objetivos para perfeccionar el enfoque de la imagen
 Cordón eléctrico: Conecta el microscopio a la fuente de energía eléctrica
 Interruptor: Enciende y apaga la lámpara de luz.

Sistema óptico: Comprende los lentes oculares, los lentes objetivos y los
dispositivos de iluminación.

 Oculares: El microscopio binocular, tiene dos lentes

oculares; el aumento puede ser de 6x, 10x, 15x y 20x; para
determinar la magnificación de la imagen que se observa a
través del microscopio, multiplica la magnificación de los
oculares por la del objetivo en uso.
 Objetivos: Lentes principales del microscopio; son
parafocales, pues al cambiar de un objetivo a otro, la
imagen queda casi en foco y sólo es necesario un leve
ajuste; en este caso, hay tres objetivos:
- Rastreo: cuatro magnificaciones o 4x
- Baja potencia: 10x
- Alta potencia: 40x
- Objetivo de inmersión: son aquellos que usan
aceite de cedro entre la lente frontal y el objeto a
observar. Son los más poderosos y hacen que la
imagen de los objetos se vean 100 veces más
grandes
 Ajuste de iluminación: Se usa para controlar la
intensidad de iluminación
 Condensador: Lente que condensa la luz en el plano de la
laminilla
 Tornillo para ajuste del condensador: Sirve para subir
y bajar el condensador; para nuestro uso el
condensador debe estar un poco por debajo de su posición más alta
 Diafragma: Sirve para controlar el diámetro del cono de luz que llega al objetivo, no para controlar la
intensidad de iluminación; al disminuir la apertura del diafragma se aumenta el contraste y la
profundidad de foco, pero se disminuye la resolución; para lograr la mejor imagen posible es necesario
cambiar la apertura del diafragma al cambiar el objetivo
 Lámpara de iluminación: Proporciona la luz que llega al objeto por estudiar y el sistema óptico del
microscopio
 Filtro azul: Absorbe el exceso de luz roja y amarilla del iluminador para que la iluminación sea más similar
a la luz natural

MANEJO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el
microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si
la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe
hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo
en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

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 b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el
macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un
enfoque fino.
2. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un
poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la
imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El
objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de
contratiempos: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con
aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
3. Empleo del objetivo de inmersión:
a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va
a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.
d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite.
En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la
preparación es mínima, aun menor que con el de 40x.
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el
objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay
que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor
aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca
se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar
también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Al finalizar el trabajo, dejar el objetivo de menor aumento en posición de observación
2. Cuando no se utiliza el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se
ensucien y dañen las lentes.
3. Nunca tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con papel especial
de óptica.
4. Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpiar el aceite que queda en el objetivo con papeles
especiales para óptica. Al limpiar, se pasa el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el
aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-
acetona (7:3) o xilol.
5. No forzar los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y
condensador).
6. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para
prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del
mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.
7. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con
un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

III. MATERIALES Y MÉTODOS.

 Microscopio compuesto.
 Esquema del microscopio compuesto.

PROCEDIMIENTO
1. Mostrando el microscopio compuesto, el profesor señalará y explicará las partes fundamentales y la función
de cada una de las partes del instrumento mencionado.

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 2. Paralelamente los alumnos examinarán e identificarán las partes del microscopio señaladas por el profesor.
3. Escribir el nombre de las partes del microscopio en el dibujo que se muestra en la presente separata.

IV. RESULTADOS (escribe las partes del microscopio que hayas manipulado en
práctica).

Microscopio compuesto binocular

V. CONCLUSIONES: (escribir dos conclusiones)

VI. INVESTIGA :
1. Explique para que sirve los siguientes microscopios:

 Microscopio de contraste de fase.

 Microscopio de fluorescencia.
 Microscopio electrónico de barrido.

VII. REFERENCIAS
Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2aedición. Ed. Masson, Barcelona, 1999
- Forbes, B. A.- Sahm D. F. – Weissfeld A. S. Bailey y Scott, Diagnóstico Microbiológico, 11ª Edición. Editorial
Médico Panamericana. 2004.

COLORANTES Y COLORACIONES

I. COMPETENCIAS
 Interpretar el fundamento de las coloraciones en la práctica microbiológica bajo el soporte de la base
teórica y química de los procedimientos de tinción diferencial.
 Comprender la base biológica de la tinción de Gram.

Clasificación de los colorantes:

a) Sales colorantes:
Los colorantes más comúnmente usados son sales que pueden ser de tipo ácido o básico, términos
que no indican necesariamente su pH en solución, sino que una parte significativa de la molécula sea
aniónica o catiónica.

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 Los colorantes básicos consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro.
Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+).
Los colorantes ácidos tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado.
Ej: eosinato (-) de sodio (+).
Los colorantes se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si la célula no ha muerto, el
proceso de tinción la mata.
La célula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos, y ellos son los más usados en citología bacteriana.
Las bacterias son ricas en ácidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de grupos fosfatos.
Los colorantes básicos tiñen la célula bacteriana uniformemente, a menos que antes sea destruido el ARN
del citoplasma.
Los colorantes ácidos no tiñen la célula bacteriana, y por lo tanto, pueden usarse para impartir al fondo un
color de contraste (coloración negativa).

Desde el punto de vista práctico entonces, los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida,
como la cromatina nuclear de las células eucariotas y procariotas; los colorantes ácidos reaccionan con
sustancias básicas, como las estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas.
b) Colorantes liposolubles
Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usándose a menudo
para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.
En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas, con el
propósito de hacerlas visibles al microscopio óptico; uno de ellos es el ácido tánico que se emplea en la
coloración de flagelos y espiroquetas.

TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA

Una preparación coloreada exige la sucesión de tres pasos: preparación del extendido, fijación y coloración.
1.- Preparación del extendido
Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado.
Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende hasta
formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos.
Si el cultivo proviene de un medio sólido, se procede así de la siguiente manera:
 Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos.
 Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y luego se extiende la
suspensión bacteriana hasta formar una fina película sobre el portaobjetos sin tocar los bordes.
 Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el portaobjteto
al aire caliente de la llama del mechero.
2.- Fijación
Este segundo paso se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se
desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente.
La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los microorganismos
queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las bacterias.
Existen dos tipos de fijación: con calor (o método de Koch) y fijación química.
Método Koch
El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del mechero 3
veces seguidas, con la precaución de llevar el extendido hacia arriba. El inconveniente de este método es
que los microorganismos pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta excesivo. Después del
procedimiento, el portaobjetos debe notarse caliente pero no debe quemar cuando se coloca en la parte
posterior de la mano.
Fijación química
La coagulación del protoplasma microbiano con sustancias químicas es lo ideal pues las células no resultan
deformadas. Existen varios métodos:
- Se inunda el preparado con alcohol metílico, se deja actuar 3 minutos y se lava con agua. Es el más usado.
- Idem con formalina al 5 % (v/v).
- Se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y éter sulfúrico) y se deja
actuar hasta su evaporación completa.
3.- Coloración
En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de acuerdo al
método de tinción que se realice.
TIPOS DE TINCIONES
Para la observación microscópica existen diferentes tipos de coloraciones según las características
morfológicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y compuestas.
TINCIÓN SIMPLE
Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una
solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.

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 La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como ya
dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma
microbiano.
Técnica: La coloración consiste en cubrir el frotis, después de fijado, con la solución colorante y se deja
actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar.
 Con fucsina básica: se diluye 1/10 la solución de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se deja
actuar 30 a 60 segundos.
 Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solución de uso y se deja actuar 30 a 60 segundos.
 Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno alcalino de
Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.
El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se usa más concentrado y se deja
actuar durante más tiempo. También a la solución de azul de metileno de uso se le agrega un álcali (KOH)
como intensificante, que actúa haciendo más rápida e intensa la reacción de coloración. Generalmente como
intensificante se usa un álcali para un colorante básico y un ácido para un colorante ácido. Debido a que el
protoplasma bacteriano tiene una débil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que
en medios alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan más intensas.
En la coloración negativa los microorganismos quedan sin teñir y se colorea el medio que los rodea. Por lo
tanto, lo que se ve es el perfil de las células.
La sustancia usada para la tinción negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea a las células, tal como:
 Tinta china (suspensión de partículas de Carbono coloidal demasiado grandes como para penetrar en
la bacteria)
 Colorantes ácidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El más utilizado es la
nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por ser negro.
La coloración negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los microorganismos en
microscopía óptica, pero su máxima utilidad está en revelar estructuras como cápsulas tanto
bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas
que, por su pequeño diámetro transversal, resulta difícil ponerlas en evidencia.
Técnica: Método de Burri (con tinta china o nigrosina). Se coloca en un extremo del portaobjetos una gota de
tinta china o nigrosina y otra de la suspensión microbiana y se mezclan bien con el ansa. Luego, con otro
porta se apoya sobre la mezcla y se hace un extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el
espesor del frotis vadisminuyendo a medida que se extiende, con lo cual se conseguirá una zona donde el
contraste sea el adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersión.
TINCIÓN COMPUESTA (O DIFERENCIAL)
Aunque existen múltiples tipos de tinciones, aquí vamos a referirnos a los dos métodos de coloración
compuesta más comúnmente empleados en la práctica corriente del laboratorio de microbiología: la
tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten diferenciar las bacterias incluso
cuando tienen igual forma y tamaño, por esta razón es una “tinción diferencial”.
TINCIÓN DE GRAM
Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la más empleada en bacteriología.
Las etapas a seguir se detallan en la Tabla 1.
Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la grampositividad depende de la naturaleza y
composición química de la pared o parte de ella. Se han propuesto varias teorías para su explicación, pero la
más aceptada es la que sostiene que las bacterias gramnegativas son más permeables al alcohol debido a su
alto contenido en lípidos.
Cuando la bacteria se tiñe con el complejo colorante básico-mordiente, éste queda atrapado en las
bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza físico-
química de su pared. Por el contrario, en las gramnegativas es arrastrado debido a su alto contenido
lipídico.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES
Muestras: Muestras de saliva, sarro dentario.

Reactivos: Batería GRAM, colorante WRIGHT.

Equipos y materiales:
Mechero de alcohol, palitos mondadientes, portaobjetos, cubreobjetos, algodón, papel de lentes.

PROCEDIMIENTO:
1. Obtenga 1 portaobjeto limpio.
2. Prepare un frotis de cada uno de las muestras. Para preparar los frotis se sigue el siguiente procedimiento:
a. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca
cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda
retenida una mínima gota de agua, que es suficiente.

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 b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad de muestra
y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión
homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la muestra se toma de una muestra
líquida, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de
la suspensión bacteriana, que se toma con mondadientes, directamente sobre el portaobjetos.
c. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjetos a la
llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos
pues las células pueden deformarse o romperse.
3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fíjelos con calor.

TINCIÓN GRAM:
1. Tiña con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que actúe durante 1 minuto.
2. Lave suavemente con agua.
3. Inunde suavemente con el mordiente, LUGOL, y deje actuar durante 1 minuto.
4. Lave suavemente con agua.
5. Decolore con alcohol cetona. Nota: no sobredecolore, agregue el alcohol gota a gota hasta que este salga
casi claro, solo ligeramente azul.
6. Lave suavemente con agua.
7. Agregue la safranina para la tinción de contraste.
8. Lave suavemente con agua.
9. Seque la preparación.
10. Colóquelo al microscopio usando el objetivo 100X de inmersión de aceite.

III. RESULTADOS : Grafique todas los colorantes que ha apreciado en práctica y haga su
descripción de cada una:
Ejemplo
Lugol : (dibujo) descripción: color, composición química, usos.

IV. CONCLUSIONES. (escribir solo dos conclusiones)

V. INVESTIGA:

1. ¿Qué tipo de tinciones utiliza un médico patólogo en su laboratorio?

2. ¿Para qué se necesita el aceite de inmersión?

VI. REFERENCIAS
Manual Práctico de Microbiología. R. Díaz, y colaboradores, 2aedición. Ed. Masson, Barcelona, 1999
- Forbes, B. A.- Sahm D. F. – Weissfeld A. S. Bailey y Scott, Diagnóstico Microbiológico, 11ª Edición. Editorial
Médico Panamericana. 2004

VII. ANEXO.

Tabla 1 Etapas en la tinción de Gram

Pasos Método GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
Colorante básico Violeta de genciana (luego de 30 seg. Se tiñe de violeta Se tiñe de violeta
se lava con agua el
exceso de colorante)
Mordiente Lugol (pasado 1 min. se lava con agua Permanece violeta Permanece violeta
el exceso de lugol)
Decoloración Alcohol de 95% o Alcohol-acetona Permanece violeta Se decolora
(durante aprox. 30
seg. y luego lavar con agua para
eliminar el resto de disolvente)
Contraste Fucsina o Safranina (luego de 30 seg. Permanece violeta Se tiñe de rosa
se lava con agua el exceso de
colorante)
servar al Colocar sobre el frotis una gota de Violeta Rosa
microscopios aceite de inmersión.