Capitolul 3 PROTEINE

Proteinele sunt componenţi celulari foarte importanţi formaţi din

aminoacizi legaţi între ei prin legãturi peptidice (amidice). Ele reprezintã mai
mult de jumãtate din greutatea celulei vii uscate.
Proteinele joacã un rol biologic esenţial pentru reacţiile chimice
metabolice, enzimele fiind catalizatori biologici indispensabili pentru existenţa
celulei vii.
Pentru prima datã în 1839 G.J. Mulder a izolat albuminele, iar
J.J. Berzelius i-a propus sã le denumeascã proteine, termen ce derivã din
cuvântul grecesc “protos” care înseamnã primul. Acest nume a fost foarte
potrivit deoarece proteinele joacã un rol primordial în celula vie :
- sunt catalizatori biologici ( enzime);
- imunoglobulinele asigurã capacitatea de apãrare a celulei contra
infecţiilor bacteriene şi virale;
- printre substanţele cu rol de reglare se gãsesc şi hormoni cu structurã
peptidicã: insulina, vasopresina, oxitocina;
- proteinele ajutã la transferul unor molecule prin membranele intra-
celulare şi celulare;
- citoscheletul este format din proteine;
- contracţiile musculare au loc cu participarea unor ansambluri proteice.

3.1 AMINOACIZI NATURALI

Prin hidroliza proteinelor, în condiţii bine controlate, au fost obtinuţi 20

de aminoacizi diferiţi, numiţi aminoacizi naturali.
In naturã existã peste 150 de aminoacizi, dar proteinele sunt formate din
numai 20 -aminoacizi (care fac parte din seria L).
Primul aminoacid izolat dintr-un hidrolizat proteic a fost glicina
(glicocolul) (1820):

H3N+-CH2-COO-

Aminoacizii din proteine au urmãtoarea formulã generalã:

COO -
+
H3N C H
R
unde R este catena lateralã.
3.1.1 Clasificarea aminoacizilor

28
In funcţie de structura chimicã, aminoacizii se împart în şase grupe:

a) Aminoacizi monocarboxilici

+ + +
H3NCHCOO - H3NCHCOO- H3NCHCOO-
H CH3 CH(CH3)2
glicina alanina valina
Gly, G Ala, A Val, V*

+ - + - + -
H3NCHCOO H3NCHCOO H3NCHCOO
CH2CH(CH3)2 CH3CH2CHCH3 CH2C6H5

leucina izoleucina fenilalanina

Leu, L* Ile,I* Phe, F*

b) Aminoacizi dicarboxilici

+ +
H3NCHCOO- H3NCHCOO-
CH2COOH CH2CH2COOH

acidul asparagic sau aspartic acidul glutamic

Asp, D Glu, E

H3+NCHCOO- H3+NCHCOO-
CH2CONH2 CH2CH2CONH2
asparagina glutamina
Asn, N Gln, Q

c) Hidroxiaminoacizi

+ _ + _
H3NCHCOO H3NCHCOO- HO CH2 CHCOO-
CH2OH CH3CHOH +NH3
serina treonina tirozina
Ser, S Tre, T* Tyr, Y*

d) Tioaminoacizi
+
H3NCHCOO-
29
CH3SCH2CH2
 +
H3NCHCOO-
CH2SH

cisteina metionina
Cys, C* Met, M*

e) Diaminoacizi

+ +
H3NCHCOO - H3NCHCOO - NH
(CH2)4NH2 (CH2)3NH C NH2
lizina arginina
Lys, K* Arg, R

f) Aminoacizi heterociclici

+
+
H3NCHCOO- H3NCHCOO-
H CH2
N COO- CH2
H
HN N N
H
prolina histidina triptofanul
Pro,P His, H* Trp, W*

In celula vie prin modificãri translaţionale, prolina şi cisteina se

transformã în cistinã şi 4-hidroxiprolinã:

+ +
H3NCHCOO - H3NCHCOO -
HO
H
CH2S SCH2 N COO-
H
cistina 4-hidroxiprolina
Cys - S - S - Cys Hypro

Aminoacizii naturali care nu pot fi sintetizaţi de organismul viu sunt notaţi

cu asterisc “*” şi se numesc esenţiali. Ei trebuie introduşi în organism prin
alimentaţie.
În afarã de aminoacizii prezentaţi mai sus, în proteine mai existã şi alţi
aminoacizi: 5-hidroxi-lizina din colagen, desmozina din elastinã,etc.
În materia vie existã aminoacizi care nu sunt prezenţi în proteine:
homoserina, homocisteina, ornitina, citrulina; D-alanina şi acidul D-glutamic

30
(în pereţii celulari bacterieni), acidul -aminobutiric (neuro-transmiţãtor),
tiroxina (hormon tiroidian), etc.
De asemenea, sunt cunoscuţi aminoacizi cu acţiune toxicã pentru
formele de viaţã: acidul djencolic şi -cianoalanina:
_ _ _
OOCCHCH2SCH2SCH2CHCOO NC CH2CH COO
H3N+ + NH3 +NH3

acidul djencolic -cianoalanina

3.1.2 Proprietãţile aminoacizilor naturali

3.1.2.1 Stereochimia aminoacizilor naturali

Aminoacizii din proteine sunt - aminoacizi şi fac parte din seria L.

In afarã de prolinã şi glicocol, ei au formula generalã:

COO -
+
H3N C H
R

Pentru determinarea stereochimiei unui aminoacid, termenul de referinţã

este L-serina, care are configuraţia S, conform configuraţiei absolute CIP
(Cahn-Ingold-Prelog), asemãnãtoare cu configuraţia L-glicerinaldehidei,
termenul de referinţã pentru monozaharide:
_
COO CHO
+
H3N C H HO C H
CH2OH CH2OH
L- serina L- glicerinaldehida

În seria aminoacizilor încadrarea în seria D sau L se face considerând

configuraţia atomului de carbon vecin grupei mai oxidate (carboxilul), în timp
ce în seria monozaharidelor se considerã configuraţia atomului de carbon cel
mai depãrtat de gruparea oxidatã (carbonil).
In cazul unui aminoacid cu doi atomi de carbon chirali, existã doi
racemici, deci patru stereoizomeri optici.

Exemplu: treonina: L- şi D- treonina (forma treo),

L- şi D-alotreonina (forma eritro):

31
 _ _ _ _
COO COO- COO- COO-
+ + + +
H3N C H H C NH3 H3N C H H C NH3
H C OH HO C H HO C H H C OH
CH3 CH3 CH3 CH3
L-treonina D-treonina L- alotreonina D-alotreonina
(natural)
forma treo forma eritro

Determinarea configuraţiei aminoacizilor s-a fãcut prin reacţii chimice

urmãrindu-se înrudirea cu un compus sau aminoacid cu structura cunoscutã.
În Figura 3.1 se observã relaţia între L-serinã şi L-alaninã, L-cisteinã şi
L–asparaginã:
COO
+ C
H3N H
_ _
COO COO
CH3
+ + C
H3N C H + HCl H3N H L(+) alanina
_
CH2OH CH2Cl COO
L(-) serina +
H3N C H

CH2SH
NH3
L(-) cisteina

_ _
COO COO
+ C NaOBr + C
H3N H H3N H

CH2NH2 CH2CONH2
L(-) asparagina
Figura 3.1: Influenţa reacţiilor chimice asupra activitãţii optice

Ca şi în cazul monozaharidelor, nu toţi aminoacizii din seria L

deplaseazã planul luminii polarizate spre stânga (nu sunt levogiri).
Astfel urmãtorii aminoacizi: alanina, valina, izoleucina, acidul glutamic,
glutamina, arginina, lizina, izolaţi din proteine, sunt dextrogiri.

3.1.2.2 Starea de agregare

32
 Aminoacizii sunt compuşi solizi, amfionici, cu puncte de topire foarte
ridicate (peste 200oC).

3.1.2.3 Spectre de absorbţie

Aminoacizii aromatici (tirozina, triptofanul, fenilalanina) absorb în

ultraviolet la  = 280 nm.
Aceastã proprietate permite dozarea conţinutului proteic al unei soluţii.

3.1.2.4 Solubilitate

Aminoacizii sunt compuşi solubili în apã şi în solvenţi polari.

Tirozina, fenilalanina şi triptofanul sunt solubili în soluţie alcalinã.
Proprietãţile aminoacizilor naturali sunt determinate de structura
catenelor laterale R.
In funcţie de comportarea faţã de apã, aminoacizii sunt:

- hidrofobi (nepolari) - cu catene R hidrofobe: alanina, valina, leucina,

izoleucina, metionina, triptofanul, fenilalanina, prolina, cisteina, glicina;
- hidrofili (polari)
- cu catene R neutre : asparagina, glutamina, serina, treonina, tirozina;
- cu catene R bazice ( încãrcate pozitiv la pH = 7): lizina, arginina,
histidina;
- cu catene R acide ( încãrcate negativ la pH = 7): acidul aspartic
(asparagic), acidul glutamic.

În soluţii apoase neutre, aminoacizii prezintã momente de dipol mari

datoritã existenţei amfionului:
+
NH3 - CHR- COO -
În soluţie puternic acidã, aminoacizii se gãsesc sub formã de cation:
+
NH3 - CHR – COOH
In soluţie puternic bazicã se aflã sub formã de anion:

NH2 - CHR - COO-

3.1.2.5 Punctul izoelectric

Existã o valoare a pH-ului, numitã punct izoelectric, (pI), la care

concentraţia formei cationice este egalã cu cea a formei anionice, forma
amfionicã fiind predominantã.
La punctul izoelectric solubilitatea aminoacidului este minimã, iar
migrarea ionilor în cursul electrolizei unei soluţii apoase de aminoacid
înceteazã.
33
 Cationul unui aminoacid, conform teoriei Brönsted, este un acid bibazic
şi prezintã douã trepte de ionizare:
+ K1 + _ +
NH3CHRCOOH + H2O NH3CHRCOO + H3O

+ _ K2 _ +
NH3CHRCOO + H2O NH2CHRCOO + H3O

Expresiile pentru cele douã constante de aciditate se pot scrie, conform

legii maselor, considerând soluţia suficient de diluatã pentru a înlocui
activitãţile cu concentraţiile speciilor ionice. Variaţia concentraţiei apei este
neglijatã:

[+NH3 CHR COO- ] [H3O+] [NH2 CHR COO- ] [H3O+]

Ka1 = ----------------------------------- ; Ka2 = ---------------------------------
[+NH3 CHR COOH] [+NH3 CHR COO- ]

Prin logaritmare şi înlocuind: - log[H3O+] = pH, - log Ka1= pKa1,

-log Ka2 = pKa2 , se obţine :

[+NH3 CHR COO- ]

pKa1 = pH - log ----------------------------
[+NH3 CHR COOH]

[NH2 CHR COO- ]

pKa2 = pH - log -------------------------
[+NH3 CHR COO- ]
Dacã se titreazã o soluţie acidã a unui aminoacid cu hidroxid de sodiu
pânã la semineutralizare (primul punct de echivalenţã, pH = pK a1) când
jumãtate din forma cationicã a fost transformatã în cea amfionicã:

[+NH3CHRCOOH] = [+NH3CHRCOO- ]

Cu exces de bazã restul formei cationice este transformat în forma

amfionicã (pI), apoi se atinge al doilea punct de echivalenţã, când jumãtate din
forma amfionicã este transformatã în forma anionicã ( pH = pK a2) şi prin
continuarea titrãrii restul formei amfionice este transformatã total în forma
anionicã.
In Figura 3.2 este prezentatã curba de titrare a unei soluţii 0,1M de
clorhidrat de alaninã cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1M:

34
 Figura 3.2: Curba de titrare obţinutã la titrarea unei soluţii 0.1M de
clorhidrat de alaninã cu o soluţie 0.1M de hidroxid de sodiu

Expresia punctului izoelectric pentru aminoacizii monocarboxilici şi

monabazici se poate determina din expresiile pKa-urilor:

[+NH3 CHR COO- ] [H3O+]

[+NH3 CHR COOH] = -----------------------------------
Ka1

[+NH3 - CHR- COO- ] Ka2

[NH2 CHR COO- ] = -------------------------------
[H3O+]
Se egaleazã cele două expresii (condiţia punctului izoelectric) şi se
obţine:
[H3O+]2 = Ka1 Ka2 de unde rezultã [H3O+] = (Ka1 Ka2)1/2

Dupã logaritmare şi înmulţire cu (-1) se obţine:

pI = 1/2 ( pKa1 + pKa2)

În Tabelul 3.1 sunt prezentate valori pKa şi pI pentru câţiva aminoacizi
naturali:

Tabelul 3.1: Valori pKa şi pI ale unor aminoacizi

Aminoacid pKa1 pKa2 pKa3 pI

(-COOH) (- +NH3) (catena
laterală,R)
glicocol 2,35 9,78 - 6,1
alanina 2,35 9,87 - 6,1
leucina 2,33 9,74 - 6,0
triptofan 2,46 9,48 - 5,9
acid aspartic 1,99 9,90 3,9 (COOH) 3
35
tirozina 2,20 9,21 10,46 (OH) 5,7
arginina 1,82 8,99 12,48 10,8
(guanidina)
lizina 2,16 9,06 10,5 (+NH3) 9,7
histidina 1,80 9,33 6,04 7,6
(imidazol)

Valorile din tabelul de mai sus permit calculul raportului

[acceptor de protoni] / [donor de protoni] din legea Henderson- Hasselbalch.
Analizând Tabelul 3.1 se constatã cã:

- grupa -COOH este un acid mai puternic decât acizii alifatici

corespunzatori (acidul acetic are pKa = 4,6); acest fapt se datoreşte prezenţei
grupei amino protonate din poziţia ;
- grupa -+NH3 este un acid tare (baza slabã) în raport cu grupele amino
din aminele alifatice corespunzãtoare;
- aminoacizii naturali nu au capacitate de tamponare în jurul pH-ului
fiziologic (pH = 7) cu excepţia histidinei;
- grupele SH şi OH sunt foarte slab acide;
- grupa amino din poziţia  din lizinã este bazã puternic.

O metodã de dozare a aminoacizilor des utilizatã este titrarea cu soluţie

de NaOH a unei soluţii de aminoacid în care s-a adãugat formol 40% (soluţie
de formaldehidã în apã).
Formaldehida în exces se combinã uşor cu grupele amino libere din
aminoacid, iar protonii eliberaţi se titreazã cu soluţie de NaOH pânã la
pH = 8 (viraj fenolftaleinã):
+
NH3 CHR COO- + 2 CH2O + H2O (HOCH2)2NCHRCOO- + H3O+
Aminele terţiare formate sunt baze mai slabe decât cele primare, au pK
mai jos şi aminoacizii pot fi neutralizaţi cu baza la pH mai scãzut (pH = 8) faţã
de cazul când nu se introduce formaldehidã (pH = 11-12).
In Figura 3.3 este prezentatã curba de titrare a alaninei în prezenţa
formaldehidei:

36
 Figura 3.3 Curba (punctatã) de titrare a unei soluţii de alaninã în
prezenţa formaldehidei
Sörensen a introdus aceastã metodã deoarece soluţiile de aminoacizi
sunt soluţii tampon, neputând fi titrate prin metode acidimetrice şi alcalimetrice
curente.

3.1.2.6 Reacţia de recunoaştere a aminoacizilor

Aminoacizii reacţionează cu ninhidrina ( hidrat de tricetohidrindan) cu

formarea unui compus colorat albastru-violet, cu excepţia prolinei şi hidroxi-
prolinei, care formeazã un compus galben.
O schemã de mecanism pentru aceastã reacţie este prezentatã în
Figura 3.4 (pag.39).

3.1.2.7 Reacţia de dozare a aminoacizilor

Aminoacizii reacţioneazã cu acid azotos şi pun în libertate azot

molecular, care se mãsoarã volumetric, putându-se determina cantitatea de
aminoacid care a reacţionat.
Cu aceastã metodã se dozeazã grupele amino libere din peptide sau
proteine (metoda van Slyke):

HCl
RCHCOOH + HONO RCHCOOH + N2
NH2 OH

3.1.2.8 Reacţiile biochimice ale aminoacizilor

Transformãrile biochimice ale aminoacizilor vor fi detaliate în partea a

doua a cursului (Catabolismul aminoacizilor):

a)Decarboxilarea

37
 Prin decarboxilare aminoacizii formeazã amine biogene caracterizate
prin acţiune biologicã foarte importantã:

Exemplu: - histamina, se formeazã prin decarboxilarea histidinei

(stimuleazã secreţia gastricã, este vasodilatator şi regleazã tonusul muscular)
şi este implicatã în reacţiile alergice ale organismului.
- putresceina şi cadaverina, formate prin decarboxilarea
ornitinei şi lizinei, sunt toxice.

38
 CO CO
-- -NH3
C(OH)2 + R CH COO CH OH
-CO2
CO CO
NH3
hidrat de triceto + forma redusa
hidrindan
+ R CH O

CO CO
CH OH + NH3 CH NH2
CO CO

O
C
O C
C
O
forma oxidata

CO CO
CH N C
CO CO

NH3

- +
O NH4 O
C C
C N C
C C
O O

max = 570 nm
purpura lui Ruhemann

Figura 3.4: Mecanism propus pentru reacţia de recunoaştere a

aminoacizilor cu ninhidrinã

b) Transaminarea
39
 Transaminarea este reacţia de transfer a grupei amino de la un
aminoacid la un -cetoacid în prezenţa unei aminotransferaze conform
urmãtoarei ecuaţii globale:

-aminoacid1 + -cetoacid2 -cetoacid1 + -aminoacid2

Prin transaminare se biosintetizeazã aminoacizi specifici fiecãrei celule

vii în concentraţia necesarã şi la momentul adecvat.

c) Dezaminarea oxidativã aminoacizilor conduce la -cetoacizi şi

amoniac. Existã aminoacidoxidaze specifice atât pentru L- aminoacizi, cât şi
pentru D-aminoacizi:
_ _ _
COO COO COO
+ L-aminoacidoxidaza + + H2O
H3N C H H2N C O C
+
_ NH
R 4
R R
FMN FMNH2

unde FMN este flavinmononucleotida (vezi Vitamine şi coenzime, Partea

a II-a).

3.1.2.9 Analiza amestecurilor de aminoacizi

Hidrolizatele proteice acide conţin aminoacizii componenţi şi se obţin

prin încãlzirea unei soluţii apoase de proteinã (într-o fiolã de sticlã închisã) la
105oC, în prezenţã de HCl 6N, timp de 24 ore.
Deşi prin hidroliza acidã se distruge triptofanul, iar glutamina şi arginina
sunt hidrolizate la acizii corespunzãtori, în practicã se preferã acest tip de
hidrolizã deoarece reacţia în mediu bazic sau enzimatic prezintã mai multe
inconveniente.
Amestecul de aminoacizi astfel obţinut se poate analiza cu metode
cromatografice:

a) Cromatografia bidimensionalã pe hârtie

Pe o hârtie de filtru se depune într-un colţ amestecul de aminoacizi

obţinut la hidrolizã. Se developeazã cu un solvent organic saturat cu apã
realizând o cromatogramã monodimensionalã, unde se observã o separare a
aminoacizilor componenţi. Dupã uscarea hârtiei se developeazã, în direcţie

40
perpendicularã faţã de prima, într-un alt solvent. Astfel se obţine cromato-
gramã bidimensionalã:

Prin pulverizare cu o soluţie de ninhidrinã se pune în evidenţã locul

fiecărui aminoacid (patã albastru-violet).
Prin mãsurarea spectrofotometricã a acestor pete se poate face
determinarea cantitativã a aminoacizilor componenţi. Pentru o asemenea
determinare sunt suficiente 0.2 – 0.4 g de proteinã.
Un amestec de aminoacizi obţinut prin hidroliza lânii a fost separat prin
aceastã metodã utilizând ca solvenţi colidina şi apoi fenolul.
S-au construit aparate automate de separare cromatograficã a
aminoacizilor, iar dozarea acestora se face spectrofotometric.

b) Cromatografia prin schimb de ioni

Aceastã metodã se bazeazã pe deosebirile proprietãţilor acido-bazice

ale aminoacizilor şi se pot separa amestecurile de aminoacizi în trei grupe:

* aminoacizi acizi, reţinuţi pe rãşini schimbãtoare de anioni, care sunt

de obicei compuşi poliaminaţi:

Rãşina-NH3+OH- + RCOO- Rãşina NH3+ RCOO-

* aminoacizi bazici, reţinuţi pe rãşini schimbãtoare de cationi (rãşini

polisulfonate sau policarboxilice):

Rãşina-SO3- Na+ + RNH3+ Rãşina-SO3- RNH3+

* aminoacizi neutri, nu sunt reţinuţi de rãşini schimbãtoare de ioni.

Astfel s-a reuşit fracţionarea completã a amestecurilor de aminoacizi cu

ajutorul polistirenului sulfonat la un pH scãzut, unde toţi aminoacizii sunt sub
formã de cationi, puternic reţinuţi în partea superioarã a coloanei.
Eluarea cu modificarea progresivã a pH-ului conduce la izolarea
aminoacizilor componenţi care se desorb de pe coloanã în funcţie de
capacitatea de ionizare.

41
 c) Cromatografia în strat subţire

Este o metodã de separare prin cromatografia de lichide, asemănătoare

cu cromatografia pe hârtie. In locul hârtiei se folosesc plăci de sticlă ( staniu
sau material plastic) pe care este depus un strat uniform de fază staţionară:
silicagel, aluminã, etc.
Se depune un spot din soluţia de aminoacizi care urmează a fi separatã
şi se developeazã cu un amestec de eluare adecvat.
Aminoacizii vor migra mai repede sau mai încet în funcţie de
proprietãţile acido-bazice care determinã fixarea şi reţinerea pe faza
staţionarã.

d) Cromatografia în fazã gazoasã

Este o metodã de separare completã a aminoacizilor dupã ce au fost

efectuate modificãri structurale care sã-i facã volatili:
- metilarea funcţiilor amino, fenolice sau alcoolice;
- esterificarea grupelor carboxil.
Separarea se face cu ajutorul unor coloane capilare ( cu diametrul 0.1 mm şi
peste 2 metri lungime), la temperaturi între 100 – 200o C, utilizând faze
staţionare lichide.
Aminoacizii se repartizeazã între o fazã staţionarã lichidã şi o fazã
mobilã gazoasã cu viteze diferite, care depind de polaritatea lor.
Prin aceastã metodã se pot separa cantitãţi foarte mici de aminoacizi
(de ordinul picomolilor , 10-12 moli).

e) Cromatografia de adsorbţie

Aceastã metodã se bazeazã pe principiul adsorbţiei de tip lichid-solid

(cromatografie de lichide sub presiune) de înaltã rezoluţie şi de înaltã
performanţã (HPLC).

f) Cromatografia de repartiţie în contracurent

Aceastã metodã cromatograficã utilizeazã ca fazã staţionarã amidon sau

silicagel hidratat, iar faza mobilã este un lichid nemiscibil cu solvenţii în care
se aflã amestecul de aminoacizi care urmeazã a fi separat.
Cu acest procedeu s-au separat 99% din aminoacizii rezultaţi la hidroliza
albuminei din serul de bovine şi din lactoglobulinã

42