Sunteți pe pagina 1din 6

Examenul coproparazitologic, facil si util atat pentru proprietari cat si pentru clinicieni

Autor articol: Dr. Andra Branzea


Examenul coproparazitologic în medicina veterinara este, în momentul de fata, un examen la îndemâna
oricărui clinician, foarte util, care nu necesita resurse extinse.
Examenul coproparazitologic la canide și felide vizează în principal depistarea trofozoitilor sau a
chisturilor unor protozoare, a oochisturilor de coccidii și helminti, dar și a formelor larvare a unor
nematode. Dintre helminti, cestodele prezintă o particularitate, și anume aceea ca în fecale se elimina
proglotele ovigere, deci depistarea oncosferelor de cestode are loc rar, doar în cazul ruperii proglotelor
în intestin și, în consecință, eliberarea oncosferelor.
Prima parte a procesului o reprezinta recoltarea fecalelor, aceasta putând fi efectuata, după caz, de către
proprietar sau de către clinician. Recoltarea este recomandat sa fie făcută de către medicul veterinar
prin tușeu rectal. Dacă este efectuata de către proprietar, este ideal ca proba sa nu fie contaminata cu sol
deoarece poate conduce la rezultate neconclusive, multe larve de nematode realizându-și maturarea
libere pe sol.
Luând în considerare faptul ca oochisturile se dezvolta rapid, făcând astfel destul de grea identificarea
lor ulterioara, proba de fecale trebuie prelucrata în maxim 30 de minute de la prelevare.
In experienta noastră, cele mai rapide și utile metode sunt în număr de trei și sunt alese în funcție de
suspiciunea medicului veterinar curant. Cele trei metode utilizate sunt: examinarea microscopica
directă a fecalelor, metoda flotației și metoda Baermann.
Examinarea microscopică directă a fecalelor este cea mai la îndemână și se realizează prin etalarea
fecalelor pe o lama microscopica, urmată de adăugarea a câteva picături de ser fiziologic călduț și
soluție Lugol urmare de acoperirea cu o lamelă. Această metodă este specifică pentru evidențierea
trofozoitilor de Giardia spp. și Trichomonas spp. iar în cazul infestațiilor masive putem depista
oochisturi de helminti și chisturi de protozoare.
Metoda flotației este cea mai utilizată, depistând atât oochisturile de helminti cat și chisturile de
protozoare, practic cele mai întâlnite cazuri. Principiul metodei de flotație îl reprezintă amestecarea
fecalelor cu lichide având o greutate specifică mai mare, care lăsate în repaus sau centrifugate duc la
separarea detritusurilor pe fundul vasului de oochisturile care vor pluti la suprafața soluției.
Oochisturile sunt astfel recuperate împreună cu o picătură de soluție și examinate la microscop.
Nematodele și cestodele au o greutate specifica cuprinsa intre 1.10 și 1.15 și vor flota în soluțiile cu o
greutate specifica mai mare, precum soluția de ZnSO4 (1.18) sau soluția de sucroza (1.27).
Trematodele în schimb, au o greutate specifica mai mare (1.30-1.35) și nu vor flota în soluții uzuale, de
aceea pentru depistarea lor se prefera metoda sedimentării.
Metoda Baermann este specifică depistării formelor larvare a strongililor pulmonari și a strongiloizilor.
Aceasta utilizează aparatul cu același nume în care fecalele suspendate într-o fașă de tifon vor fi expuse
în apa calda peste noapte, timp în care larvele migrează către fundul vasului de unde sunt recuperate și
examinate.
Cele mai frecvente descoperiri ale examenului coproparazitologic efectuat în clinica noastră sunt
oochisturile de nematode precum Toxocara canis, Toxocara cati, Ancylostoma spp si Uncinaria spp.,
urmate de larve de nematode.
Medicul clinician care efectuează acest examen trebuie sa aibă în vedere anumite aspecte la momentul
emiterii buletinului de analize și implicit al diagnosticului. Coroborând anamneza, examinarea clinica
împreună cu examinarea probei putem evita situațiile în care avem rezultate fals negative sau fals
pozitive.
Rezultate fals negative pot apărea în cazul eliminării intermitente a oochisturilor (Isospora spp. și
Giardia spp), eliminării unui număr mic de oochisturi chiar dacă animalul prezintă semne clinice (se
vor folosi metode de concentrare), alegerea incorectă a soluției de flotație pentru specia parazitară
respectivă (soluția cu sucroză distorsionează chisturile de Giardia spp.) sau neluarea în considerare a
unor particularități de specie (Toxoplasma spp. elimina oochisturi o singură dată timp de 14 zile iar
cestodele elimină proglote ovigere nu oncosfere).
Rezultatele fals pozitive implică în același timp situațiile în care pot fi făcute erori de diagnostic.
Aspectul cel mai important pentru medicul care realizează acest examen îl reprezintă cunoașterea
situațiilor cu care se poate confrunta la examinarea microscopica a probei. De exemplu, chisturile
speciilor Neospora, Besnoitia si Hammondia sunt asemănătoare cu cele ale Toxoplasma spp., iar
Besnoitia spp. și Hammondia spp. pot da un sindrom diareic dar de cele mai multe ori nu au implicații
clinice, carnivorele fiind doar gazde definitive și rezervoare.
Similaritatea ouălor de Capillaria spp și Trichuris vulpis de asemenea poate conduce la erori de
diagnostic. Alte aspecte de luat în considerare sunt acele descoperiri normale într-o proba de fecale:
prezenta detritusurilor de materiale fecale, a resturilor vegetale inclusiv polenul (similar cu anumite
oochisturi) și spini vegetali (asemănători cu larve de nematode), prezenta unor oochisturi de nematode
ce parazitează rozătoarele sau anelidele (rame) și nu în ultimul rand flora bacteriana incluzând fungi
(asemănătoare ca formă cu oochisturile de coccidii).
Transmiterea speciilor parazitare la carnivore este influențată de activitatea și comportamentul uman,
de rezervoarele domestice (carnivorele fără stăpân), de aceea examenul coproparazitologic ar trebui sa
devină parte obligatorie a consultului periodic al animalului, minimizând astfel portajul și de asemenea
riscul zoonotic.

Diagnosticul de laborator in parazitoze


In medicina veterinara, a avea mijloace biologice de diagnostic care sa fie usor de executat, sa fie
reproductibile, sensibile, precoce si specifice, constituie o necesitate de prim ordin.
In general, metodele specifice de diagnostic de laborator in parazitoze, se clasifica asfel:
•metode directe, care constau in identificarea si izolarea parazitului;
•metode indirecte, care cuprind reactiile serologice si alergice.
I. METODE DIRECTE
1. Examene coproparazitologice
Metoda Willis
Tehnica: 3-5g fecale se mojareaza cu o solutie suprasaturata de NaCl, amestecul se strecoara intr-un
pahar Willis astfel incat sa formeze la deschiderea paharului un menisc convex, si se aseaza lama. Se
lasa in repaus 20-30 minute apoi se aplica lamela pe lama si se examineaza la microscop cu obiectiv
10, 20.
Indicatii: concentrarea sporochisturilor, oochisturilor, chisturilor de sporozoare, oncosferelor, oualor de
nematode (1).
Metoda Willis modificata
Tehnica: In primul timp se efectueaza metoda Willis. In timpul al doilea, se indeparteaza 2/3 din
supernatant, iar peste sediment se aduga apa de robinet si se omogenizeaza. Lichidul se trece in tuburi
de centrifuga si se centrifugheaza la 1500 rpm timp de 2-3 minute. Se indeparteaza supernatantul si sin
sediment se fac preparate intre lama si lamela.
Indicatii: Se depisteaza in plus fata de metoda Willis formatiunile parazitare grele – oua de trematode,
unele oncosfere, oua de acantocefali.
Metoda sedimentarii active
Tehnica: Se mojareaza 3-5g fecale cu apa de robinet apoi suspensia se strecoara in tuburi de centrifuga.
Se centrifugheaza la 1500 rpm timp de 2-3 minute. Se indeparteaza supernatantul si din sediment se fac
preparate intre lama si lamela. Se examineaza la microscop cu obiectiv 10.
Indicatii: oua de trematode, oncosfere, oua de acantocefali.
Metoda McMaster
Principiu: Elementele parazitare dispersate intr-o solutie suprasaturata de NaCl, floteaza pe suprafata
camerelor de numarat, unde vor fi numarate si exprimate per gram de fecale (OPG).
Tehnica: In cilindrul cotat se introduce solutie suprasaturata de NaCl pana la prima cotatie a paharelului
McMaster, apoi cu o pensa se adauga fecalele, pana cand nivelul lichidului ajunge la cotatia a doua (~
2g). Se toarna continutul intr-un mojar, se mojareaza si se strecoara intr-un pahar. Se omogenizeaza
bine, apoi cu o pipeta se etaleaza doua camere ale lamei McMaster, astfel incat sa fie umplute complet
si sa nu contina bule de aer. Pentru flotarea elementelor parazitare, lamele se aseaza pe o suprafata
orizontala, unde se mentin circa 5 minute, dupa care se trece la efectuarea numararii le microscop.
Numararea elementelor parazitare se face separat pentru fiecare specie, urmarind liniatura retelei
existente pe fiecare camera. Numarul de oua se inmulteste cu 50 si se obtine cifra OPG.
Indicatii: Aprecierea intensitatii infestatiilor cu oua usoare de nematode, oochisturi, chisturi de
balantidium.
Metoda Henrikson
Tehnica: Se intinde frotiul din fecale sau amprente din intestin, se usuca la temperatura camerei. Se
fixeaza frotiul in alcool metilic 96% timp de 2-5 minute, se coloreaza cu carbol fuxina 20-30 minute, se
spala cu apa de robinet, diferentiere cu SO2H4 (concentratie 0,25-10%), timp de 20-60 secunde,
spalare cu apa de robinet, recolorare cu verde malachit 5%, spalare, uscare. Se examineaza frotiurile cu
obiectiv 100, cu ulei de imersie.
Indicatii: Identificarea lui Cryptosporidium spp. Criptosporidiile sunt de 3-6 microni rosii, pe fundalul
verde al frotiului.
Metoda Blagg
Tehnica: Se mojareaza 1g fecale cu 3 ml solutie fixatoare (alcool absolut, formol 38%, glicerina, apa
distilata). Se filtreaza intr-un tub de centrifuga peste care se adauga 1 ml eter etilic, se omogenizeaza.
Se centrifugheaza 1 minut la 1500 rpm. Din sediment se adauga o picatura pe o lama peste care se
adauga o picatura de solutie Lügol.
Indicatii: Identificarea flagelatozelor digestive din genul Giardia.
2. Metode larvohelmintoscopice
Metoda Baermann
Tehnica: Se toarna apa usor incazita in aparatul Baermann (sita, palnie, furtun, clema Morh) peste
proba de fecale (5-10g), astfel incat sa acopere complet masa de fecale. Se lasa in repaus 24 ore,
interval in care larvele se desprind din masa de fecale si sedimneteaza. Recoltarea se face pe o lama
recuperand primele 2-3 picaturi. Examinarea se poate face fara a aplica lamela daca lichidul este clar
sau cu lamela daca lichidul contine reziduri. Se examineaza ci obiectiv 10.
Indicatii: strongilatoze pulmonare la rumegatoare si carnivore.
Metoda Vajda
Este o metoda ce se preteaza la examenul coproscopic, la speciile de animale ce elimina crotine: oi,
capre, iepuri.
Tehnica: Se aseaza intr-o sticla de ceasornic 3-5 crotine, peste care se aduga apa calduta pana ce le
acopera. Se lasa in repaus 15-20 minute, apoi cu o pensa se indeparteaza cu grija crotinele. Se
examineaza continutul direct din sticla de ceasornic cu obiectiv 10.
Indicatii: In diagnosticul nematodozelor pulmonare (dictiocauloza, protostrongilatoza, mulerioza).
3. Examenul parazitologic al sangelui – se face cu scopul evidentierii parazitilor extracelulari (in
plasma) sau intracelulari (intraeritrocitari).
Examenul sangelui in stare proaspata
Se poate face in doua moduri: in picatura strivita sau in picatura suspendata.
Indicatii: Ambele metode sunt recomandate pentru examinarea parazitilor extracelulari (mobili) si mai
exact pentru Trypanosoma la cabaline sau Dirofilaria la canide, cabaline, bovine.
Examenul sangelui in frotiuri fixate si colorate May-Grunwald-Giemsa
Indicatii: pentru evidentierea parazitilor intracelulari (ex. Babesia, Theilleria) sau a celor extracelulari
(ex. Leschmania, Toxoplasma, Microfilaria, Trypanosoma).
Coloratia May-Grunwald-Giemsa: colorare cu solutie May-Grunwald, 3 minute, cu numar cunoscut de
picaturi; se aduga apa distilata neutra, 1 minut, cu acelasi numar de picaturi, apoi se indeparteaza. Se
introduce frotiul in baie Giemsa timp de 20-30 minute. Frotiul se spala sub jet de apa redus, se usuca si
se examineaza cu obiectiv de imersie (2).
4. Examenul direct între lama şi lamela, se practica cu precadere in infectia experimentala, pentru
controlul densitatii parazitilor din lichidul ascitic, sau pentru controlul prezentei chisturilor de la nivelul
tesutului muscular sau al tesutului nervos.
In mod obisnuit, din diverse produse patologice ca sange, sediment din LCR, lichid din camera
anterioara a ochiului, saliva, secretii oculare, punctat hepatic, splenic, muscular, ganglionar, sau din
substanta cerebrala se pot efectua urmatoarele metode:
5. Frotiu sau/si amprenta de organe (se coloreaza May-Grunwald-Giemsa);
6. Sectiuni histologice (se coloreaza May-Grunwald-Giemsa);
6. Sectiuni histologice (se coloreaza May-Grunwald-Giemsa);
7. Inoculare intraperitoneala la soarece.
Metodele directe prezinta aceleasi avantaje ca si cele indirecte, la care se mai adauga dificultatile legate
de timpul destul de lung pana la obtinerea unui rezultat (in cazul inocularii la animal), posibilitatile de
confuzie cu alti germeni asemanatori, ca si faptul ca se pot obtine rezultate fals negative in cazurile in
care parazitii sunt in numar mic in tesutul prelevat pentru examinare sau inoculare.
Pentru diagnosticul in viata s-au imaginat metode de imbogatire din preparatele bioptice.
Se recurge in mod frecvent la izolarea parazitului la soareci. In acest caz este necesar a se avea in
vedere posibilitatea unei infectii spontane inaparente a animalului si de aceea este indicat a se asigura
inainte de inoculare ca animalul este indemn, prin efectuarea unei reactii serologice.
8. Reactia de polimerizare in lant (P.C.R. - polymerase chain reaction).
Diagnosticul molecular consta in evidentierea prin tehnica PCR a ADN-ului parazitar, utilizandu-se ca
primeri secvente de ADN specifice. Metoda a fost folosita cu succes pe sange periferic, lichid
cefalorahidian, lichid amniotic, tesut cerebral, corp vitros, umoare apoasa, lavaj bronhoalveolar si
urina (3).
Metodele de extragere a ADN-ului se bazeaza mai ales pe o fragilizare fizica sau chimica a peretelui
formatiunii parazitare. Tratamentele fizice sunt in general sonicarea, alternanta inghet-dezghet si
agitarea cu perle de sticla. Tratamentele chimice constau in incubarea oochisturilor in solutii enzimatice
(proteinaza K sau medii conventionale pentru dechistarea sporozoitilor) sau cu compusi care perturba
integritatea peretilor (hipoclorit de sodiu, cetiltrimetil amoniu bromid). Aceasta prima etapa,
obligatorie, este urmata printr-un timp de extractie si de purificare a ADN-ului prin metode clasice.
II. METODE INDIRECTE
1. Imunoflorescenta indirecta (I.F.I.).
Reactia de imunoflorescenta indirecta consta in decelarea anticorpilor anti-parazitul cercetat prin
vizualizarea complexelor antigen-anticorp, cu ajutorul unei anti-imunoglobuline de specie cuplata cu o
substanta fluorescenta (FITC), atunci cand serul de cercetat este pus in contact cu antigenul.
Principiul metodei: Varianta indirecta a imunofluorescentei are ca si principiu cuplarea anticorpului
marcat fluorescent (antiimunoglobulina de specie) cu anticorpul specific fata de antigen, si vizualizarea
efectului fluorescent la microscopul prevazut cu lampa cu ultraviolete.
Interpretarea rezultatelor: lamele se citesc la microscopul prevazut cu lampa UV; se considera pozitive
probele in care toti tachizoitii sunt fluorescenti pe toata suprafata lor si nu doar in zonele apicale; se
considera ca reactii dubioase acele situatii in care polurile apicale ale tachizoitilor prezinta fluorescenta,
aceasta lipsind insa in restul invelisului tachizoidal si reactii negative in absenta fluorescentei (Fig 1).
Fig. 1 - Imunoflorescenta indirecta - interpretarea rezultatelor
2. Testul de Aglutinare modificat (M.A.T.)
Metoda MAT permite identificarea anticorpilor specifici de tipul IgG anti-parazitul de cercetat in serul
tuturor speciilor de animale, intrucat nu presupune utilizarea unor anticorpi specifici marcati enzimatic.
Interpretarea rezultatelor: citirea se face la o susa de lumina (transluminator) pe camp intunecat. Vor fi
considerate pozitive acele probe si dilutii la care antigenul este depus pe fundul godeului sub aspect
umbeliform si ocupa cel putin 50% din fundul godeului; probele in care antigenul a sedimentat intr-un
singur punct sub forma unui buton sunt considerate negative (Fig. 2).
Fig. 2 - Interpretarea rezultatelor M.A.T.
3. Metoda imunoenzimatica ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Aceasta metoda poate fi definita ca o succesiune de reactii antigen-anticorp, ultima dintre acestea fiind
relevata printr-o reactie enzimatica cu schimbarea culorii unui cromogen. Metoda furnizeaza
combinatia unica de sensibilitate, specificitate si aplicabilitate practica pentru detectia unor antigene
sau a anticorpilor.
Este utilizata in doua aplicatii majore: pentru detectia/confirmarea unui agent patogen sau pentru
detectia/evaluarea statusului imun umoral (prezenta anticorpilor, titrul acestora). Dar aplicabilitatea
tehnicii ELISA nu se opreste aici, ea fiind utila in diverse situatii cum ar fii testarea postinfectioasa,
postvaccinala sau dupa expunerea la un agent patogen.
In functie de complexitatea variantei tehnice (utilizarea de anticorpi monoclonali, anticorpi de captura,
antigene recombinate, combinare cu tehnicii legate de acizii nucleici – hibridizare cu sonde de
competitie, amplificare prin PCR etc), exista teste tip ELISA destinate evaluarii imunitatii mediate
celular, dar acestea au o utilizare mai restransa.
Majoritatea truselor ELISA disponibile comercial si utilizate in laboratoarele de diagnostic sunt
destinate evaluarii imunitatii umorale, iar in cadrul acesteia cel mai frecvent pentru detectia
imunoglobulinelor din clasa IgG (anticorpi serici, anticorpi maternali, anticorpi din galbenusul de ou).
Metoda ELISA cunoaste mai multe variante tehnice:
• ELISA – varianta directa
Are ca scop identificarea/detectia antigenului sau anticorpului.
Antigenul legat la placa recunoaste si fixeaza anticorpul cuplat cu enzima care descompune substratul
specific,oxidând cromogenul care se coloreaza. Intensitatea acesteia se masoara la un spectrofotometru,
la o lungime de unda adecvata cromogenului si se exprima in unitati densitate optica (DO).
Aceasta varianta se utilizeaza ca test de control pentru antigenul de captusire (daca se foloseste un
conjugat standardizat) sau pentru controlul conjugatului (daca se foloseste un antigen de captusire
standard). Anticorpul legat la placa recunoaste si fixeaza anticorpul cuplat cu enzima, restul,
desfasurându-se la fel. Aceasta varianta se foloseste pentru controlul conjugatului imunoenzimatic.
•ELISA – varianta indirecta
Este una dintre cele mai utilizate variante tehnice si are ca scop identificarea/detectia anticorpilor.
Antigenul legat la placa (antigen de captura) recunoaste si fixeaza anticorpii din proba de cercetat.
Acestia, la rândul lor, recunosc si fixeaza anticorpii anti-anticorpi cuplati cu enzima (conjugatul
imunoenzimatic) care descompune substratul specific producând oxidarea unui cromogen ce isi
schimba culoarea. Intensitatea acesteia se masoara la un spectrofotometru, la o lungime de unda
adecvata cromogenului si se exprima in DO. În acest caz, exista o relatie directa intre cantitatea de
anticorpi din proba si valoarea DO
•ELISA – varianta Sandwich (captura de antigen)
Are ca scop identificarea/detectia antigenelor.
Anticorpul legat la placa (anticorp de captura) recunoaste si fixeaza antigenul din proba de cercetat.
Acesta, la randul lui, recunoaste si fixeaza un al doilea anticorp anti-antigen (preparat pe alta specie)
cuplat cu enzima (conjugatul imunoenzimatic) care descompune substratul specific producand oxidarea
unui cromogen ce isi va schimba culoarea.
La fel ca si in cazul metodelor precedente se citesc densitatile optice, valoarea lor având o relatie
directa cu cantitatea antigenului din proba.
•ELISA – varianta Dublu-sandwich (captura de complex antigen-anticorp)
Scopul acestei variante este detectia/identificarea antigenelor.
Anticorpul legat la placa recunoaste si fixeaza antigenul din proba de cercetat. Acesta recunoaste si
fixeaza un al doilea anticorp anti-antigen (preparat pe alta specie) care la rândul lui reactioneaza cu
anticorpul anti al doilea anticorp cuplat cu enzima (conjugat imunoenzimatic). Prin descompunerea
substratului specific se produce oxidarea unui cromogen ce isi schimba culoarea.
Citirea si interpretarea rezultatelor se face identic, mentinandu-se relatia directa intre cantitatea de
antigen din proba si valoarea DO.
•ELISA de competitie
Scopul tehnicii este identificarea/cuantificarea antigenelor/anticorpilor.
Antigenul/anticorpul de testat intra in competitie cu un antigen/anticorp de referinta pentru
recunoasterea si fixarea la reagentul de captura
Se pot distinge trei modele:
•Pentru detectia anticorpilor cu antigen de referinta, in care anticorpul de captura si cel din proba de
testat intra in competitie pentru legarea unui antigen de referi
•Pentru detectia anticorpului, in care anticorpul din serul de cercetat intra in competitie cu anticorpi
de referinta pentru legarea la antigenul de captura;
•Pentru detectia antigenului, in care antigenul de testat intra in competitie cu un antigen de referinta
pentru legarea la anticorpul de captura;
Interpretarea rezultatelor prin ELISA de competitie se realizeaza diferit fata de variantele tehnice
enuntate anterior. Intrucat conjugatul recunoaste numai reagentul de referinta, legarea reagentului de
testat la cel de captura opreste dezvoltarea reactiei imunoenzimatice propriu-zise. Aceasta inseamna ca
valorile DO vor fi mici la probele pozitive si mari la cele negative, deci semnalul inregistrat de
spectrofotometru va fi invers proportional cu concentratia antticorpilor/antigenelor din proba de
cercetat.
Aceasta tehnica se foloseste in diagnosticul bolilor infectioase si parazitare, precum si pentru detectia
de micotoxine, vitamine, hormoni, substante dopante (4).

Referinte
1.Cozma V., Gherman C., Mircean V., Magdaş C., Mihalca A., 2010. Ghid de diagnostic
parazitologic veterinar. Edit. Risoprint, Cluj Napoca pp.93-94.
2.Cozma V., Negrea O., Gherman C., 2001. Diagnosticul bolilor parazitare la animale. Edit.
Risoprint, Cluj-Napoca
3.Dumètre A., Dardé M. L., 2005. Immunomagnetic separation of Toxoplasma gondii oocysts using
a monoclonal antibody directed against the oocyst wall. J. Microbiol. Meth., 61, 209-217
4.Ştirbu C., Daneş M., Samarineanu M., 2009. ELISA, Informaţii pentru utilizatori
5.Protocolale de lucru din diverse kit-uri comerciale