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Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur
Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la
colonne est de 5 ml / min) :
MM tr (min)
Correction exercice 1 :
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire,
gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents
temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau),
selon la relation :
La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer
préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite :
Ici, on a tracé le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (V e).
Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).
On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH
à 7.
Question :
1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide
aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques).
Correction exercice 2 :
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique
-
substituée par des groupements sulfonate (-SO3 ) est chargée négativement et est donc une
résine échangeuse de cations.
Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme
anionique).
Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme
cationique).
Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur
la colonne.
A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne.
Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).
Questions :
1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants :
1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est
4,76).
2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme
(pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les
interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques).
Correction exercice 3 :
1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76,
7 et 9.
-4 -4
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10 .(A), on en déduit que (A) + 1,74 10 .(A) = 100
-4
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 1,74 10 )
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en déduit que (A) + (A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), on en déduit que (A) + 13378(A) = 100
Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements
carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH).
Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colonne.
Le cytochrome c et le lysozyme seront retenus.
CH2-CH3
/
-CH2-CH2- NH+
\
CH2-CH3
Questions :
2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5),
Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-
cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type
électrostatiques).
Correction exercice 4 :
1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux
pH : 2, 7, 9,4 et 12.
-6 -6
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), on en déduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100
-6
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10 )
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %
-3
À pH = 7 : = pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc : = 3,98 10
-3 -3
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), on en déduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100
-3
(A) est mis en facteur : (A) = 100 /(1 + 3,98 10 )
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), on en déduit que (A) + (A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), on en déduit que (A) + 398,1(A) = 100
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %
Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements
+
diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH ).
Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles :
tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on
ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4).
L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les
volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :
MM (Da) Ve (ml)
Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132
Questions :
2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM.
Correction exercice 6
-27
1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10 kg. La masse moléculaire d'u
composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abréviation de dalto
s'écrit avec un Dmajuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa
2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer
représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM)
f(Ve) pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline.
Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire
Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un log MM = 4,93, so
une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p
- 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances exclues (ici,
dextran).
- la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la catalase, ca
le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement inclus
dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à partir des points correspondant à
catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les volumes d'élution encadrent celui de la protéin
p).
Exercice 7 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au tot
20000 unités de cette enzyme
Questions
taux de
protéine (g) : activité (UE) : rendement :
purification :
Extrait brut 1000 20000
Chromato. d'exclusion 200 14000
Chromato. d'échange d'ions 15 4500
Chromato. d'affinité 0,5 3500
Correction exercice 7 :
- L'activité spécifique (AS) représente un nombre d'unités enzymatiques (UE) par gramme de
protéines (g) :
AS = (UE / g)
- Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une étape de
purification, sur l'AS mesurée à l'étape précédente :
- Le rendement correspond à un nombre d'UE mesuré après une étape de purification, sur un
nombre d'UE mesuré à l'étape précédente :
Connaissant ces définitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne
supplémentaire "AS" qui nous permettra de calculer le taux de purification :
taux de
protéine (g) : activité (UE) : AS : purification :
rendement :
- Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par
celle de départ. Ici, le taux global de purification est égal à 7000 / 20 = 350.
Conclusion : Suite aux différentes étapes de purification, on a pu récupérer 3500 unités, sur les
20000 que l'on avait au départ, soit 17,5 %. L'enzyme a été purifiée 350 fois.
Exercice 8 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est
soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un
tampon à pH = 6.
Question :
Correction exercice 8 :
Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à
une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon
à pH = 6.
Question : dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ?
Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été
réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés
se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine
échangeuse de cations, chargée négativement.
À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite
éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas
éluée.
Exercice 9 : Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM =
67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da).
Question :
1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort.
Correction exercice 9 :
Voici un diagramme d'élution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion séphadex G-100
(limite d'exclusion = 100000 Da), sur laquelle on aurait déposé un un mélange d'immunoglobulines G
(MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da).
Ici on a représenté la mesure de la densité optique (DO) de l'éluat en fonction du volume d'élution
(Ve).:
Les IgG présentent une masse moléculaire supérieure à la valeur de la limite d'exclusion de la colonne
(100000 Da). Elles seront donc éluées en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne
(Vm = Ve IgG)
L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus tard, avec
un Ve albumine qui est égal à Vm + Ve' albumine.
Exercice 10 : On veut réaliser la séparation de 5 acides aminés (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5
de résine sèche de polystyrène sulfoné que l'on dispose dans une colonne ouverte. La résine est lavée pa
une solution d'HCl (1 M) en excès. Après ce traitement, la résine est lavée à l'eau distillée. On fait alors passe
une solution de NaCl (2 M) en excès. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalité et est dosé par 11
ml de NaOH (1 M
Questions
1 - Commenter les opérations effectuées (écrire sommairement les équations mises en jeu) et en déduire
capacité de rétention de la résine
2 - Les 5 acides aminés à séparer sont solubilisés dans un tampon à pH = 3,8. A ce pH, quels sont le
composés qui seront retenus sur la résine
3 - Après avoir chargé la colonne par les 5 acides aminés préalablement solubilisés dans le tampon à pH 3,
l'élution est réalisée en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides aminés vont-ils êtr
élués
Nombre de résidus :
pKa peptide A peptide B peptide C
Arg 12 8 12 2
Lys 10 12 16 1
Glu + Asp 4,5 13 10 -
His 6 2 8 -
Cys 8 2 1 1
Questions
3 - On veut séparer ces trois composés par chromatographie échangeuse d'ions. Quel type de résine alle
vous choisir
4 - A pH = 4,5, ces composés sont-ils fixés sur la résine ? Comment éluer les produits fixés ? Quel sera l'ordr
d'élution des composés retenus ? A quel pH élue t'on le peptide C ? Conclusions ?
Exercice 12 : Le chromatogramme suivant représente le profil d'élution de trois acides aminé (1, 2 et 3) :
Questions
1 - Quel est le type de chromatographie utilisé ? Exposer son principe (une demi-page
2 - En vous aidant du tableau ci-dessous, déterminer quels peuvent être les acides aminés élués.
3 - Quelle technique chromatographique peut-on utiliser pour séparer deux acides aminés de même pHi ?
L'estérification des acides gras d'un corps gras naturel (un mélange de triglycérides) peut être réalisée e
incubant le corps gras avec du trifluorure de bore (catalyseur de la réaction) dans le méthanol (CH 3-OH
donneur des groupements méthyls), à 100°C durant 15 mi
Le chromatogramme ci-dessous représente le profil d'élution d'esters méthyliques d'acides gras saturés
insaturés repris dans l'hexane après injection en chromatographie en phase gazeuse. Le temps de rétentio
(tr) est indiqué en minutes, au-dessus de chaque pic :
tr : aire (%) :
8.98 30.783
17.16 15.976
19.00 29.293
22.90 14.636
29.32 8.761
Questions
1 - Quel est le principe de la chromatographie utilisée ? Il existe deux techniques pour une tel
chromatographie. Donnez en les principes en quelques lignes
2 - Le standard interne est ici l'acide stéarique (C18:0) qui présente un temps de rétention de 17,16 minutes.
l'aide du tableau ci-dessous, déterminer la nature des autres acides gras élués. Que représente le premier p
(tr : 1,7 min) ? Selon quel(s) critère(s) les acides gras sont-ils élués ?
rapport tr / tr C18:0
acide gras :
:
ac. laurique (C12:0) 0,12
ac. myristique (C14:0) 0,25
ac. palmitique (C16:0) 0,53
ac. stéarique (C18:0) 1
ac. oléique (C18:1 ; 9) 1,11
ac. linoléique (C18:2 ; 9, 12) 1,33
ac. linolénique (C18:3 ; 9, 12, 15) 1,71
ac. arachidique (C20:0) 1,88
ac. arachidonique (C20:4 ; 5, 8, 11, 14) 3,24
3 - Calculer la masse des différents produits dans l'échantillon, sachant que l'on a injecté 132 microgramme
d'esters méthyliques d'acides gras saturés et insaturés.
Exercice 14 : Un corps gras naturel constitué d'un mélange de triglycérides (TG), est soumis à l'action de
lipase pancréatique. Cette enzyme permet l'hydrolyse des acides gras en position 1 et 3 des TG, ce qui mène
des acides gras libres (AGL) et des 2-monoglycérides (2-MG), lorsque la réaction est totale. Les AGL ont é
purifiés à partir du lipolysat par chromatographie échangeuse d'anions. Cette chromatographie permet, outr
la fraction AGL, de purifier une seconde fraction constituée de glycérides neutres (GN). Différents échantillon
ont été analysés en chromatographie sur couche mince (gel de silice). Le mélange de solvant utilisé, d
polarités différentes, étant : éther de pétrole / éther diéthylique.
1 : Témoin Triglycérides (T
2 : Témoin 1, 2-Diglycérides et 1, 3-Diglycérides (D
3 : Témoin Monoglycérides (M
4 : Témoin Acides Gra
5 : Echantillon milieu de lipoly
6 : Echantillon Fraction Glycérides Neutres (GN) provenant de la chromatographie échangeuse d'anio
7 : Echantillon Fraction Acides Gras Libres (AGL) provenant de la chromatographie échangeuse d'anio
Questions
1 - Donner en quelques lignes le principe de la chromatographie sur couche mince utilisée. En fonction d
quel(s) critère(s) les différents composés vont-ils être séparés
Exercice 15 : Un corps gras naturel, constitué d'un mélange de triglycérides (TG) est analysé e
chromatographie sur couche mince. La plaque de gel de silice est uniformément imprégnée de nitrate d'argen
(AgNO3) puis mise à sécher 1 heure, avant d'effectuer les dépôts à analyser. Les sels d'argent sont en eff
capables de former une liaison non covalente et réversibles avec les chaînes carbonée insaturées (présentan
des doubles liaisons)
1 : Témoin tri-stéarin
2 : Témoin di-oléo-stéarin
3 : Echantillon du corps gra
La plaque est ensuite placée dans une cuve de chromatographie. Le solvant de migration est le chlorure d
méthylène.
On rappelle
Questions
Nous désirons étudier les protéines plasmatiques. Dans un premier temps, nous réalisons une
électrophorèse sur gel d’agarose à pH = 9 afin de séparer les différentes protéines.
1/ Sachant que les protéines plasmatiques ont un pH isoélectrique inférieur à 8,8, quelle est leur
charge ?
2/ En déduire le sens de migration des protéines.
3/ Dans ces conditions, l’albumine a la plus grande mobilité. Qu’en déduire sur la migration de
l’albumine par rapport aux autres protéines ?
4/ Une électrophorèse en veine liquide a permis de déterminer que dans ces mêmes conditions la
mobilité de l’albumine est de 10.10-7 m².s1.V-1 en valeur absolue. L’albumine sera supposée
sphérique et de rayon R = 10-10 m. Calculer la charge de l’albumine.
6/ Nous désirons déterminer la masse molaire de l’albumine. Pour cela, nous réalisons une
électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS. Les résultats sont donnés dans le
tableau ci-après.
6-3/ Déterminer la masse molaire de l’albumine sachant que sa distance de migration est
de 40,8 mm.
U = - 120 V
L = 15 cm.
Exercice 7 :
Nous réalisons une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. L’électrophorèse est réalisée en
présence de témoins de masse moléculaire traités, comme l’échantillon protéique à analyser, par
un mélange urée 8 M / SDS 1% / tampon pH = 8,6.
Figure 1 : Electrophorégramme des protéines dans les conditions urée 8 M / SDS 1% / tampon pH = 8,6.
Exercice 8 :
1) Peut-on en déduire si la charge nette portée par ce composé est positive ou négative ?
6) En supposant que le pHi du composé soit de 4, quel sera le signe de sa charge nette si on abaisse
le pH de l’électrolyte à 3 ?
XERCICE 1
L'isolement et les analyses préliminaire d'une
enzyme E ont révélés sa présence sous deux formes
E1 et E2 possédant respectivement les pHi 6,25 et
6,35.
Forme E1 Forme E2
Monomère pHi Monomère pHi
A1 6,3 A2 6,5
B1 6,3 B2 6,3
C1 6,1 C2 6,1
D1 6,3 D2 6,3
L'association des deux monomères de types B et C possède un pHi de 6,2
Trois électrophorèses bidimensionnelles (E2D) ont été réalisées sur l'enzyme E :
EXERCICE 2
QUESTION 1: L'étude biochimique approfondie d'une protéine a permis
d'élucider sa structure oligomérique comme étant une composition de deux
chaînes A (PM : 20 Kd chacune) et deux Chaînes B (PM : 40 Kd chacune) liées
par des liaisons faibles et des ponts dissulfure suivant le schéma ci-dessous :
QUESTION 2:
Afin d'étudier par voie de la protéomique les changements affectant des cellules
cancéreuses chez l'Homme, des auteurs ont procédé à la préparation
d'échantillons protéiques à partir de cellules saines et de cellules malades.
Le tampon de lyse utilisé dans cette étude est constitué d'une solution
contenant, entre autres, CHAPS (détergent non ionique) 4% (p/v) et Tris-HCl
(pH 7,8) 40 mM.
L'électrophorèse en première dimension est une isoélectrofocalisation sur un
gradient de pH 4,7-5,9 effectuée dans un tampon composé de l'urée 8 M, CHAPS
2% (p/v), Ampholyte 0,2% (p/v), Dithiothreitol (DTT) 3,7% (p/v) et le bleu de
Bomophénol 0,001% (p/v)
Avant la réalisation de l'électrophorèse SDS-PAGE (deuxième dimension), les
gels de la première électrophorèse ont subit l'équilibration dans deux tampons
de compositions suivante :
1er tampon d'équilibration (pH 7,0): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl 1,5
M, SDS 2% (p/v) et DTT 130 mM.
2ième tampon d'équilibration (pH 7,8): urée 6 M, Glycérol 20% (v/v), Tris-HCl
1,5 M, SDS 2% (p/v) et iodoacétamide 135 mM.
L'électrophorèse en SDS-PAGE a été réalisée sur un gradient 4-20% en
polyacrylamide dans un tampon de pH 8,3 contenant Tris 25 mM, Glycine 192
mM et SDS 0,1% (p/v).