TECNICAS DE DIAGilósTco cIToGENEilco

Materialdidástico: Modulo 2 - Clase 9

1. INTRODUCCIÓN A [A CITOGENÉTICA
La citogenética es el campo de Ia genética que comprende
el estudio de Ia estructura,
funcién y comportamiento de los cromosomas. Es
una ciencia relativamente joven cuyo
comienzo se atribuye a mediados del sigloXX

1.1,- Breve hfstoria de la Citogenéüca

Para tener una idea de la evolución que ha experimentado

Ia citogenética, a continuación
se indica de manera brele alSunas fechas decisivas en Ia Historia de esta ciencia:
r 1956: Debido a Ia ocurrencia de una serendipia, el investipdor
foehintijo
descubrió Ia estructura del material genético *n hu*unos:
46 cromosomas, Este
hecho se comproM:al añadir agua a una suspensión
de células humanas, lo que
permila Ia rotura de los nricleos y el contaje de los
cromosomas.
¡ l9s7z ETAPA DE BLANC}. En esta época los estudios citogenéticos
se basaban en
el contaie de cromosomas de un solo color al microscopio
sobre un fondo blanco.
De esta manera se descubrieron anomalías cromosómicas
como el sfndrome de
Down [47 cromosomas), de Edwards, de Patau, Turner,
Klinefelter, mosaicismos,
etc.

o l97o: ETAPA DEL BLANC? Y NEGRü Marina Seabright

descubrió que añadiendo
tripsina se digerfan parcialmente las protefnas y 1*
.rnr"guían patrones de
bandeado "claros" y "oscuros", cada cromosoma tenfa un bandeado
especffico lo
que permitla no sólo el contaje de los mismos
sino la distinción entre ellos,
t 1977: ETAPA DEL GN§: añadiendo acidicolina a los
cultivos, se promovla Ia
visualizacién de loi cromosomas en
,."*.*ü
obteniéndose bandas o§curas, claras e intermedias por
retrasando su división
lo
resolución pudiendo ver anomalías más pequeñas ¡ue se aumentaba Ia
aeni¿o Jl alargamiento de Ios
cromosomas.

¡ 1995; ETAnA frN colaR: visualización de los cromosomas

en color gracias a que
pueden teñirse aumentando aún más
Ia resolución y Ia nitidez de su estructura
para ver diferencias, ganancias y/o pérdidas
de material genético, ya es una etapa
de citogenética molecular.

r 2010: cIToGENoMIa; se realizan análisis citogenéticos

de carioüpo sin necesidad
de ver Ios cromosomas sino que tos estudios se basan
en análisls moleculares,
realizando una caracterización más "fina" del
material genético en estudio. EI
cariotipo en este caso se realiza sobre DNA obtenido
de un .,pool,, de células (no
célula a célula) por lo que se pierde un poco el punto
de vista en términos de
diversidad. Hay que tener en cuenta que los humanos
somos ,,mosaicos,, debido
precisamente a esa variabilidad genética.

Actualmente no se ha logrado automatizar la citogenética

debido a la variabilidad
biológica existente' cada cromosoma posee su propio
'tódigo de barras,, y al haber tanta

Certificado de Genética Médica ZOlq-ZOfS

Página 1
7
TEcNrcAs DE Dncilósnco ctrocENÉrco
Material dittádb: Modulo 2 * Clase 9

diversidad, es algo que no se puede r¡nificár 1l aunque existen cariotipadores

semiautomáticos, Ios estudios citogenéticos necesitan de pERS0NAS.

Ahora somos capaces de hacer citogenética de interfase ya que los cromosomas tienen sus
teffitorios cromosómicos. No se ven los cromosomas como en metafase, pero sl donde
esÉn los crornosomas: se pueden distinguir zonas activas e inactivas gracias a los rlltimos
avances en tecnologfa citogenética.

Los arrays de CGH suponen la forma más refinada de la citogenética, pero aún asl se siguen
necesitando personas que interpreten Ios resultados que se obtengan. Con esh
metodologfa se gana en especificidad pero se pierde la perspectiva.

CONSUITAR DIAPO§ITTVAS 1 a 11: Hlstorla de la citogenétlca

1.2.. Trastornos genéücos Vs Momento VItaL

Con Ia citogenética se pretpnde estudiar las anomalías cromosómicas en humanos. [a

frecuencia de estas anomallas en sujetos normales se presenta en Ia diapositiva 12: 10%
en espermatozoides, 25Vo en ovocitos, 50oÁ en abortos espontáneos, 0.5-19o en recién
nacidos vivos.

Por tanto desde el momento de la concepción hasta el primer trimestre hay un porcentaie
muy alto de anomalfas cromosómicas; enffe el primery segundo trimestre este porcentaie
ya disminuye bastante y por último en el momento del nacimiento encontramos ese 196
comentado anteriormente. En la pubertad ese porcentaje vuelve a subir porque se afloran
Ias anomallas de maduración sexual que se habfan quedado por diagnosticar y
posteriormente cuando se entra en Ia edad adulta en las parejas infértiles, en las que el
10% de las mimas se las localiza una anomalfa citogenéüca.

Asl pue¡ el estudio citogenéti$o depende de:

- Diagnóstico previo de Ia persona

- Edad de la persona
- No perder la perspectiva
- Saberescogerlatécnica
- Saber interpretar

Certificado de Genética Médica 2AL4-Z0Lí Página 2

 rÉcrulc¡s rE txAcnóflrco cffoerNÉfl co
Materhl dilárfi¡: Modulo 2 * Clase g

Normalmente no hay una técnica única si no que será una secuencia de técnicas. Las
técnicas de citogenética son técnices sencillas de laboratorio, lo importante es la
C0N§ULTA CLÍNICA, manteniendo Ia perspctiva y por supuesto, Ia capacidad de saber
interpretar los resultados que se obüenen de los estudios realizados.

Conociendo los trastornos genéticos más frecuentes asociados a la edad de la persona. Las
técnicas de estudio citogenéüco serán üfurmteq por tanto, segrin la edad:

Anornalias cromosómicas. La mayorparte err el embarazo, La especie humana es Ia especie

de mamífero con menos érdto en ferlllldad, el7}Va de las concepciones se nos quedan
en
el camino y más de la mitad de ese 70 96 son anomalfas cromosómicas. [a trisomla mas
frecuente en el embrión es la del cromosoma 16.

AnQmalías mulüfactoriales. Son totalmente distintas a las otras. Mayoritarias en la edad

adulta, En esta etapa abundan las anomalfas consütucionales.

Enfern¡edades monogénicas. La mayor parte se diagnostican en la época postnatal.

En la etapa prénatal. las anomallas cromosémicas mayoritarias son las trisomlas y las
monosomlas' En Ia etapa postnatal temprana, Ias trisomlas son las más abundantes
mienta§ que en Ia edad adulta están presentes en mayor grado las traslocaciones, por lo
que se suelen realizar estudios de parejas infértiles,

CON§UITAR DIAPOSITIVAS 12, LZ y t4

2. E"T'OtUcIórg Pg Ur§ TÉCNICAS DE DIAGNÓSNCO GENÉTICO

Zl.'Pfimeros trastornos genéticos descubiertos: ANEUpLOIDIAS.

CITOGENETICA CLÁSICA

En los años 60 se podlan descubrir y describi¿ en definitiva, diagnosticar

síndrornes de
aneuplsidias:

-Sindromes de Down Edwards, patau, Turner, Klinefelter

-Mosaicos

-Traslocactén Philadelphia asociada a Ia Leucemia Mieloide Crónica (LMq

aunque
entonce§ no se sabía que esta última se trataba de Ia traslocación del gen ZZ d,el
cromosoma BCR con el cromosoma 9 del gen ABL.

Certificado de Genética Médica ZOL$-ZA7S

Página 3
 rÉcn¡lc¡s og onei¡ómco clroer¡lÉlco
Material dilá<*b: Modulo 2 _ Clase 9

CONSUITAR DTAPO§ITIVA 15 Y 16

2.2.- Técnicas de bandeado.

En Ios 70 (bandas G) además de contar los cromosomas,

con la técnica de bandas se podia
diferenciar entre ellos. Existe un catálogo con el patrón de bandas.
se empiezan a vÉr
anomallas diferentes como pequeñas deleciones, duplicaciones,
etc. surge el comité
internacional de clasificación de citogenética.

§e podlan ver anomallas estructurales, tales como que habían

dos tipos de slndrome de
Down: el sfndrome de Down clásico de trisomfa primaria presente
en un 95yo de los casos
y el sÍndrome de Down por mosaicismos relacionado con la edad
materna [l%oJ y el
slndrome de Down debido a translocaciones (4Vo d,e los casos,
además éste caso es
hereditario, no depende de la edad, con lo que se precisa de consejo genético).

Entonces, con el esfudio de las traslocaciones surge una

nueva técnica sobre el estudio de
la meiosis para Ia observación de translocaciones balanceadas
o no.

Las parejas iufértiles [o abortosJ tienen traslocacione§,

esto es que no hay exceso o defecto
de información genética, sino que ha habido un cambio
de lugar de la misma en el genoma
Cuando una pareja va a someterse a tratamientos de reproducción
asistida, Io primero que
hay que hacerle es el cartotipo' si Ia mujer sufre de alguna
traslocación, el riesgo de tener
concepciones es del 10%o pero en el varón no llega
al 5%, Esto es debido u quu h"y muchos
millones de espermatozoides y llegan los mejores. Los portadores balanceados de
traslocación robertsoniana tienen 45 cromosomas yson
fenoüpicamente normales"
Existen distintos tipos de traslocación recfproca según
la segrepción de las cromátidas
que se produzca {diapositivas ZZ a 26}.

TAR DIAPOSITMS l?, a Zil;bandeo y translocaclones

@il@
l¡t{á fi :&
i¡fi§ l¡¡ll .t." !lt.

i!llldf¡Í "t,ii

Certificado de Genética Médica 2014-ZOLí

Página 4
 TÉciltcAs DtAc¡úsnco ctrocEruÉnco
DE

Material diláair¡: Modulo 2 - Clase 9

En esta época de bandas, se vieron individuos, en su mayorfa

varones, con retraso mental
debido al sfndrome del frágil x, segunda causa más importante
de retraso mental
fdiaposiüva 27J. Durante años se hizo el diagnóstico de esta ánfermedad por citogenética.
En estos caso§, se realizaba diagnóstico prenatal del X frágil,
esto es: diagnóstio de la
enfermedad si se observaba crom(§oma x frágil en un
embrién varón. para los
citogenetistag Ia ocurrencia de dos abortos esponüáneos
es indicación para realizar
estudios citogenéticos ya que en el 10 1:S% de las parejag
- al menos uno de los dos
miembros es portador de una anomalía cromosómica balanceada, posible
causa del fallo
en el éxito reproductivo de la pareia.

En la "Etapa del Gris" donde se pueden ver los cromosomas

con más resolución al estar Ias
bandas "alargadas". AI ver muchas más bandas, en esta etapa
se empezaron a describir las
microdeleciones y microduplicaciones. En slndromes pediátricos
de malformaciones
descritos anteriormente se pudieron relacionar con este tipo de
alteraeiones.
Por eiemplo en el síndrome de Prader- willi
fnacen delgados y se vuelven obesos y
además presentan retraso mental se vio que se produce
) en un 70g6 de los casos por una
deleción muy pequeña de la parte proximal del cromosoma
15. En el 30ouá de los casos
restantes ocurre por una disomfa uniparental paterna.

Existe otro slndromq el s. de Angelman totalmente distinto al

X ftágil, que también curso
con microdeleción del cromosoma 15 pero en este caso
en el cromosoma materno o tiene
Ia disomia uniparentat paterna. Esta enfermedad se caracteriza porque
los niños que Ia
sufren presentan retraso mental profundo y una constante
apariencia de risas y/o
sonrisas {" Happy puppet}.

CoNSLLTAR DIAPOSITIVA?T a 31: §fndrome X ftágII y

microdelecciones y
microduplicaciones

2.3.- Hibridacién tn situ fluoresceute: FISH. Apricaciones.

En los años 90 llega la técnica de FI§H (Hibridación in situ fluorescente) que es una
técnica de mapeo fisico de DNA en la que una sonda
de DNA etiquetada ron uru molécula
marcadora (fluorocromo) hibrida con los cromosomas
en un portaobjetos y se visualiza al
microscopio de fluorescencia con luz UV.

La molécula marcadora es fluorescente por si sola o esta

eüquetada con un anticuerpo
fluorescente. Esta molécula se excitará a una longitud de onda
determinada (43S nm) y su
espectro de emisión se producirá a una longitud de onda
diferente, viendo la señal en un
color diferente' se trata de una molécula pequeña y dicha
señal podrá verse en el

Certificado de Genérica Médica ZOL4.-Z}LS

Página 5
 TEcNrcAs DE DrActsósnco ctrocENÉnco
Material did¡ictico: Modulo 2 - Clase 9

microscopio de fluorescencia en un corto periodo de tiempo. Existen diferentes tipos de

fluorocromos que emiten en diferentes espectros. Hay que teñir el fondo {cromosomasJ de
un color uniforme para poder visualizan'los contrastes de color que se produzcan.

Se basa en la capacidad de hibridación del DNA con su cadena complementaria. Lo que se

pretende es visualizar regiones cromosómicas invisibles al microscopio óptico.

Tipos de sonda enfish:

- Centromérica: veremos centrómeros, secuencias repetitivas...etc. La aplicación de

este üpo de sonda es la más fácil, siempre sale bien. Se puede diferenciar un
cromosoma de otro.
- Telómeros: para ADN repetiüvo de los telómeros fextremos de los cromosomasJ.
Permite también diferenciar un cromosoma de otro.
- De secuenclas.rlnicas: de un gen o grupo de genes determinados. Es una técnica
más diffcil, Ia hibridación es leve, por Io que se hace necesario la ejecución precisa
de esta técnica para su éxito. Se usa una sonda de control para corroborar la
presencia o ausencia de la región genómica en cuesüón.
- Pintado de crpmosomas: usamos una libreria de sondas (excluyendo las zonas
repetiüvas) que van a hibridar casi todo el cromosoma teñido de un color
determinado. Esta técnica es rltil en citogenética tumoral y/o en detección de
traslocaclones muy r¿rras en etapa prenatal.

COBNSULTAR DIAP0§ITMS 32 A 42: FI§H

EI uso de estas sondas también puede ser en interfase para por ejemplo saber el sexo de
un embrión asl como algrln tipo de anomalfa como slndrome de Prader-Willi y
microdeleciones del cromosoma 22.

Tfu sloc ocio pes en. e I cánc er

la técnica FISH es muy rltil también para la detección de anomalías asociadas al desarrollo
de distintos tipos de cáncer debidos a traslocaciones. Por ejemplo, el FISH de dos colores
se emplea para la detección de traslocaciones en cánceres leucémicos'como Leucemia
Mieloide Crónica [CML]. Gracias a esta técnica se descubren Ios genes de fusión
fgenerados por aneuoplidfas) con carácter oncogénico. El caso más conocido es el del
Cromosoma Philadelphia el cual se produce por una traslocación entre los genes ABL del
cromosomas 9 y el gen BCR del cromosoma?Z.

En definitiva,la técnica de FISH en el ámbito oncológico:

¡ Permite visualizar cambios somáücos clonales (no consütucionales).

Certiñcado de Genética Médica 201-4-2ü15 Página 6

 TÉcNrcAs Dt Dncxósnco qrocENÉrco
Material dkliidico: Modulo 2 - Clase 9

r Es crfüco para la localización de h¡mores asociados a oncogenes. No aparecen

nuevos genes sino que ocurre una traslocación: oncogen que estaba en una zona
silenciada pasa a una zona genéticamente activa.
¡ El linfoma folicular es oko ejemplo de gen de fusión. Hay otros eiemplos como las
traslocaciones 14:tB y LS:77.

Si mediante FISH se diagnostica leucemia y el paciente es tratado, Ia leucemia remite pero

si al tiempo se reactiva, se vuelve a estudiar para evitar una posible recalda (tratamiento
previo a la recafda); esto es Io que llamamos ENFERMEDAD MíNIMA RESIDUAL que
detectamos mediante FISH de 2 colores.

CONSULTAR DTAPOSÍNVAS 43 A46:FISH Y TRAN§LOCACIONE§ ONCOLÓGICA§

Awllficaclón génica enfrimores medlante FISII:

. La amplificacién de regiones cromosómicas (como región homogéneamente teñida
o dobles minutos) se ha observado frecuentemente en tumores,
r La amplificación génica es importante en la patogénesis y pronóstico de muchos
tumores sólidos.
o FGFRS, MYC, HER-Z-neu fresponsable del cáncer de mama)
¡ Dicha amplificación oncogénica se realiza sólo en algunos üpos de cáncer de
mama, no en todos (estudio molecular rápido mediante FISH)

Multiole FISH lilI-FlSHl

El "FISH Mulücolor", "M-FI§H" o "SKY" {Spec*al Karyotiptng) es una adaptación del

FISH que permite Ia visualización de los 23 pares de cromosomas a Ia vea teñidos con
diferentes sondas fluorescentes. Es importante para el estudio de tejidos tumorales. Es
bueno para investigación ya que sirve también para la detección de anomalfas
cromosómicas como inversiones pequeñas a pesar de que no es una técnica muy utilizada.

I¿s librerfas de DNA para cada cromosoma se etiquetan directamente con uno o más de 5
fluorocromos de forma combinatoria por lo que resulta un color único para cada uno de
los 24 cromosomas.

CONSUITAR DIAPOSITIA§ 47 A 51

Cerrificado de Genética Médica 2014-2015 Pág¡na7

 TECNICAS DE DIAGilÓsnco cIToGENEIco
Material diliicfm: Modulo 2 - Clase 9

FISH 4e Inter{ase en estgdo prenatah

La técnica de FISH se utiliza también en la detección de anomallas en estado prenatal:

o y 21y la monosomfa X son las aneuplididas más comunes

Las trisomlas 13, 18
relacionadas con la edad materna o con anomalfas fetales (extensión
amniocitos, bio§acorial..,etcJ
. El análisis cromosómico prenatal tarda de 8 a 14 dfas,
r El FISH prenatal suministra una forma rápida (2 dlas) de cribaje para
aneuploidias en amniocitos no cultivados (interrupción rápida del embarazoJ
r FISH prenatal rápido: Sondas para los cromosomas 13,18 y 2L en una zona
del porta, eüquehdos con 3 colores diferentes. Sondas para los cromosomas X
e Y en el mismo porta.

MlcwdtsecJetén:

En esta técnica se usa un micromanipulador.

r se usa para identificar material cromosómico de origen desconocido.

r La regién de interés se disecciona del cromosoma en S-10 metafuses.
Los fragmentos cromosómicos se colocan en: eppendorf-) sonicación-)pcR con
primers para Alu-PCR o Dop-PCR-)fluorocromo-)Hibridación de los fragmentos
de PCRsobre células normales.
Es una técnica obsoleta en investigación.

2.4.- Hibridacién genómlca comparaüva: CGH. Aplicaclones.

Esta técnica es un método para detectar globalmente gananciasy pérdidas del genoma sin
necesidad de tener células en división. El protocolo de actuación es:

r Se extrae ADN del tejido muestra y del control, se etiqueta cada uno con una
molécula de color diferente frojo yverde).
¡ Se hibridan simulüáneamente ambos DNAs sobre mehfases de células humanas
normales.
e Se compara las intensidades relativas de los 3 fluorocromos a lo largo de cada uno
de los cromosomas diana.

De este modo se ha descubierto ganancia de oncogenes (hibridación, zonas amplificadasJ

y genes supresores de tumores fno hibridación, zonas delecionadas -)pérdida de
heterogeneidadJ.

Aqllcaclones de la CGH:

r Deteccién de aneuploidias o ampliflcación génica en tumores.

Certiñcado de Genética Médica 2}t4-Z0ts Página I

 rÉcHrc¡s or oue¡¡ósnm croerruEnco
Materhl didácti¡: liodulo 2 - Clase 9

Identiñcación de crommorn¡§ marcrdores detectados en citogenética cllnica

(alternativa al M-FISH).
Detección de aneuploidias en material de abortos espontáneos
ftejido que
habitualmente no crece).
I La CCH No {etecta reaiustes ba}anceados (traslocacionesJ, mienkas que la técnica
del M-FISH sl que lo hace).

CONSULTAR DIAPOSITIVAS 54A Gl: CGH

2.5.- Citogenómica.

La técnica CGH es Ia "madre" de Ios alTays de CGH. La técnica de arrays de CGH estudia
trocitos de secuencia de cada cromosoma y se hibridan en pocillos con el DNA de células
normales / tumorales' EI estudio no se hace sobre cromosomas, sino sobre secuencias
génicas (barrido). Por tanto es una hibridacién genómica, permite conocer exactamente
dónde se localizan por ejemplo las microdeleciones ya que la "resolución" de Ia técnica es
de menos de 1Mb.

La técnica se empezó a aplicar para el diagnéstico de Síndromes de retraso mental

acompañados de algún üpo de malformación donde se obserya un cariotipo normal.

Con el uso de los microariays se ha descubierto que en la población normal se dan

multitud de variaciones de copias genéticas:

CNV's

Variantes en el nrlmero de copias. Actualmente se sabe que hay zonas del genoma
en Ias
que sólo hay una copia y fenotípicamente no es observable al igual que
si se tienen S
copias tampoco üene por qué derivar en consecuentes anomalfas citogenéücas. Se pueden
tolerar hasta 10 copias o una sola copia.

Se hacen comparaciones con bases de datos IDECIPHER) por si se encuentran más cosas.

Los microarrays no deben usarse en diagnóstico prenatal porque si le informa

a Ia madre
que al niño Ie ftlta o Ie sobra algo abortará aunque no tenga por qué pasarle
nada.

CGH + SNPK

Esta técnica es una variante de la anterior y además se pueden ver: pérdidas de

heterocigosidad y disomlas uniparentales {síndrome de prader-willi,..etc.J

Cer¡ificado de Genética Médica ZA14-Z}ts

Página 9
 TEcNrcAs DE DnffiíI@ €IToGENÉTlco

Material dklácti¡- Module 2 - Clase 9

8AC5 ON BEAD§

Esta técnica es emergente y lo último del mercado. Se trata de bolas magnéticas con
sondas de DNA conocidas que se pegan oon k secuencia complementaria corre§pondiente;
la elección d aquellas secuencias que han hibridado con dichas sondas se realiza mediante
el uso de láser. Esta técnica se está infoduciendo en diagnóstico prenatal para anomalias
muy contrastadas como microdelecciones patológicas.

CONSULTAR DIAPOSITTVA§ 62 A 7 S;CITOGENÓA{ICA

Existen consensos y gufas para el uso de las técnicas de citcgenómica [arrays-CGH; arrays-
SNPs, Bacs on Beads, etc); y las bases de datos DECIPHER a nivel mundia y "the
international standards for Cytigenomic Arrays Consortium" a nivel americano.

Certiffcado de Genética Médica ZA14'2ALS Página L0