Artículo de investigación

Evaluación sistemática de los parámetros

cromatográficos para los alcaloides de isoquinolina
en la columna XB-C18 Core-Shell utilizando
diferentes composiciones de fase móvil

Ireneusz Sowa, 1 Sylwia Zielińska, 2 Jan Sawicki, 1 Anna Bogucka-Kocka, 3 Michał Staniak, 1 Ewa
Bartusiak-Szcześniak, 1 Maja Podolska-Fajks, 1 Ryszard Kocjan, 1 y Magdalena Wójciak-Kosior1
1 Departamento de Química Analítica, Universidad Médica de Lublin, Chodźki 4a, 20-093 Lublin,
Polonia
2Departamento de Biología Farmacéutica, Universidad Médica de Wroclaw, Borowska 211, 50-556
Wroclaw, Polonia
3Departamento de Biología con Genética, Universidad Médica de Lublin, Chodźki 4a, 20-093 Lublin,
Polonia
La correspondencia debe dirigirse a Magdalena Wójciak-Kosior; kosiorma@wp.pl
Recibido el 31 de agosto de 2017; Aceptado el 25 de octubre de 2017; Publicado el 20 de febrero de
2018
Editor académico: Adam Voelkel

Copyright © 2018 Ireneusz Sowa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo la
Creative Commons Attribution License, que permite el uso, la distribución y la reproducción sin
restricciones en cualquier medio, siempre que el trabajo original esté debidamente citado.

Abstracto:
Chelidonium majus L. es una rica fuente de alcaloides de isoquinolina con actividades
antiinflamatorias, coleréticas, espasmolíticas, antitumorales y antimicrobianas confirmadas. Sin
embargo, su análisis cromatográfico es difícil porque pueden existir tanto en formas cargadas como
no cargadas y pueden dar como resultado la forma de pico irregular y la disminución en la eficacia
del sistema cromatográfico. En el presente trabajo, la separación de los principales alcaloides de C.
majus se optimizó utilizando una columna XB-C18 de núcleo-cubierta con extremo terminal dedicada
para el análisis de compuestos alcalinos. Se investigó la influencia de la concentración del
modificador orgánico, la adición de sales y el pH de eluyentes en los parámetros cromatográficos,
tales como la retención, la resolución, el número de placas cromatográficas y la asimetría de los
picos. Los resultados se aplicaron para elaborar el sistema cromatográfico óptimo para la
cuantificación simultánea de siete alcaloides de la raíz, hierba y fruto de C. majus.

1. Introducción:
Los alcaloides de la isoquinolina, como la coptisina, la alocrofitina, la protopina, la berberina, la
quelidonina, la sanguinarina y la queleritrina son los principales componentes de Chelidonium majus
L. responsables de las propiedades biológicas de la planta. Tienen actividades analgésicas,
antiespasmódicas, antibacterianas, antivirales y antifúngicas. Por otra parte, muestran efectos
citotóxicos y antiproliferativos contra varios tipos de líneas celulares de cáncer [1 - 4]. Debido al
amplio espectro de acción, los alcaloides de C. majus son un tema de interés para la farmacología y
la toxicología; por lo tanto, los métodos analíticos efectivos para su investigación aún se están
desarrollando. La espectrofotometría [5, 6], la electroforesis capilar [7, 8] y la cromatografía en capa
fina [9-12] se han utilizado para este fin; sin embargo, la cromatografía líquida de alto rendimiento
es la más común para los análisis cualitativos y cuantitativos de C. majus [5, 13-17].

Debido a la durabilidad, las fases estacionarias basadas en sílice RP-18 son ampliamente utilizadas
para la separación por HPLC de extractos de plantas [18, 19]; sin embargo, la cromatografía RP de
alcaloides es bastante difícil porque pueden existir tanto como bases libres como formas cargadas.
Las formas catiónicas interactúan fuertemente con grupos silanol residuales de la fase estacionaria
tipo RP y causan la ocurrencia del mecanismo de retención dual (RP y mecanismo de retención de
intercambio iónico) y resultan en el pico de cola, retención irreproducible y pobre eficiencia del
sistema [20] .

Debido al carácter básico de los alcaloides de isoquinolina, sería preferible llevar a cabo la separación
cromatográfica a pH alcalino para evitar su ionización; sin embargo, los adsorbentes a base de sílice
son inestables en esta condición [21]. Se pueden usar diferentes enfoques para eliminar estos
problemas. Los aditivos alcalinos para las fases móviles, en su mayoría aminas orgánicas como la
dietilamina, la trietilamina o la dimetiloctilamina, se aplican para suprimir la ionización del analito y
como bloqueadores de silanol [14, 15]. La adición de reactivos de emparejamiento de iones
aniónicos, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio o sales (por ejemplo, acetato de amonio, formiato
de amonio y fosfato de sodio) también se usa para mejorar la separación cromatográfica [5, 13, 17,
22]. Por otro lado, el efecto de enmascaramiento del silanol puede lograrse mediante una
modificación adicional de la superficie del sorbente, por ejemplo, el remate [23, 24].

El sorbente XB-C18 es un relleno de columna relativamente nuevo con terminaciones de

trimetilsilano y cadenas de isobutilo adicionales. En el presente trabajo, se usó una columna de fase
inversa XB para separar los alcaloides de isoquinolina que se encuentran típicamente en el extracto
de C. majus. Se investigó la influencia de la concentración del modificador orgánico, la adición de
sales y el pH de eluyentes en los parámetros cromatográficos, tales como la retención, la resolución,
el número de placas cromatográficas y la asimetría de los picos. Los resultados se aplicaron para
elaborar el sistema cromatográfico óptimo para la cuantificación simultánea de alcaloides de la raíz,
hierba y fruto de C. majus.

2. Experimental:
2.1. Sustancias químicas y reactivos:
Se adquirieron patrones de alcaloides tales como protopina (Prot), alocriptopina (Todos),
berberina (Berb), quelidonina (Che), queleritrina (Chele) y sanguinarina (Sang) de Sigma (St. Louis,
MO) y coptisina (Cop) de ChromaDex (EE. UU.). El acetato de amonio, el formiato de amonio, el
ácido acético, el ácido fórmico, el metanol (MeOH) de grado HPLC y el acetonitrilo (ACN) eran de
Merck (Darmstadt, Alemania). El agua fue desionizada y purificada por ULTRAPURE Millipore
Direct-QVR 3UV-R (Merck, Darmstadt, Alemania).
 2.2. Cromatografía líquida de alta resolución:
La cromatografía se llevó a cabo usando un cromatógrafo VWR Hitachi Chromaster 600 (Merck,
Darmstadt, Alemania) con un detector espectrofotométrico (DAD) y el software EZChrom Elite
(Merck).

Las muestras se analizaron en una columna de núcleo-coraza de fase reversa XB-C18 (Kinetex,
Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) (tamaño de partícula de 25 cm × 4,6 mm, 5 μm), a una
temperatura de 25 ° C y un flujo de eluyente velocidad de 1 ml / min.

Los cromatogramas se registraron en el rango de longitud de onda de 220 a 400 nm. La identidad
de los compuestos en los extractos de plantas se confirmó mediante la comparación de los
tiempos de retención y los espectros con los estándares correspondientes. La homogeneidad
máxima se estableció al comparar el espectro registrado en las tres secciones de picos
ascendentes, ápice y descendente con el espectro de referencia. Además, las fracciones
cromatográficas eluidas en la característica de tiempo de retención para los alcaloides
investigados se recogieron usando un colector de fracciones Foxy R1 (Teledyne Isco, Lincoln, EE.
UU.) Y su identidad se confirmó mediante espectrometría de masas de inyección directa
(micrOTOF-Q II, Bruker Daltonics , Bremen, Alemania) utilizando el software Compass
DataAnalysis versión 4.1.

2.3. Preparación de la muestra:

Las condiciones de extracción se basaron en la literatura [13]. La raíz, la hoja y la fruta de C. majus
(1 g) se extrajeron en un baño ultrasónico (3 x 15 min) con 10 ml de metanol acidificado con HCl
0,05 M. Posteriormente, los extractos se combinaron, se evaporaron a sequedad y se disolvieron
en 20 ml de metanol.

3. Resultados y discusión:
La resolución suficiente entre los picos vecinos, los picos simétricos y los picos estrechos son los más
importantes para el sistema cromatográfico óptimo. Una fase estacionaria y una fase móvil tienen
un impacto crucial en estos parámetros. En nuestro trabajo, se probaron diferentes variantes de
composiciones de eluyentes para determinar su idoneidad en HPLC de alcaloides de isoquinolina en
una columna XB-C18 de núcleo-envoltura endcapped de nueva generación. La influencia de las tres
variables: concentración del modificador orgánico, sal y pH en la resolución (RS), asimetría pico (AS)
y eficacia del sistema (números de placa teóricos N) para metanol / agua y sistemas solventes de
acetonitrilo / agua fue investigado.

3.1. Optimización de Condición Cromatográfica:

Los parámetros cromatográficos se establecieron en el rango de 20-40% de acetonitrilo (ACN) y
30-40% de metanol (MeOH) en agua. Se añadieron ácido (acético o fórmico) para obtener un pH
apropiado (3-5.5) y sal (acetato de amonio o formiato de amonio) en el intervalo de concentración
5-20 mM a los eluyentes probados porque bloquean y suprimen la ionización de grupos silanol
residuales del estacionario la fase fue necesaria para evitar la división máxima o el
ensanchamiento de los compuestos básicos.
En los sistemas ACN / agua y MeOH / agua, la cantidad de modificador orgánico influye
fuertemente en la retención de alcaloides. Tomando en consideración la resolución, se obtuvo la
separación total de los compuestos investigados para la concentración de 20% de ACN en el rango
total de pH y concentración de sal ensayados. Al 25% de ACN, el compuesto All / Che (a pH ≥ 4) o
Che / Cop (a pH ≤ 4) se coeluyeron parcialmente. Los valores de Rs a modo de ejemplo se dan en
la Tabla 1.

Tabla 1: La comparación de los tiempos de retención y las resoluciones máximas de los alcaloides

investigados en 20-25% de acetonitrilo en agua a diferentes pH y concentraciones de acetato de

amonio.

En concentraciones más altas, la mayoría de los compuestos se eluyeron por debajo de 10 min
(los valores de k para protopina, alocriptofina y quelidonina fueron inferiores a 1) y la resolución
fue deficiente (Tabla S1). La concentración de acetato de amonio y pH también afectó a la
retención de alcaloides; a valores de pH más bajos y a mayores cantidades de sal, los tiempos de
retención se acortaron. Además, la eficiencia del sistema
(N), la simetría de los picos (As) y la resolución (Rs)
dependen fuertemente de estas variables. Los valores de
N, As y Rs frente al pH y la concentración de sal se
presentan en la Figura 1 y la Figura S1.

Figura 1: La relación entre los números de placa teóricos

(N), la asimetría de pico (As), la resolución (Rs) y la
concentración de pH / acetato de amonio.
Como se puede ver, a pH 5 y a una concentración de sal de 5 mM, el número teórico de placa
disminuyó y la asimetría máxima aumentó significativamente, y dio como resultado el pico de
ensanchamiento y la disminución de la resolución máxima. En contraste con la concentración de
sal, el pH tuvo un impacto importante en Rs. La resolución entre Che / Cop, Cop / Sang y Sang /
Berb aumentó a un pH más bajo; a su vez, para All / Che, ocurrió el efecto opuesto. Por otra parte,
se observó un orden de elución para la quelidonina y la coptisina a pH 5. El metanol mostró una
menor fuerza de elución, y se requirió una concentración en el intervalo de 30-35% para obtener
la elución de alcaloides en un tiempo razonable. Además, el orden de elución dependía
fuertemente del pH y la cantidad de modificador orgánico y sal (Tabla 2 y Tabla S2).

Tabla 2: Comparación de los tiempos de retención y

las resoluciones máximas de los alcaloides
investigados en 35% de metanol en agua a pH
diferente y Como se puede ver, ninguna
composición de fases móviles proporcionó
suficiente separación dentro de compuestos con
retención más débil como protopina, alocriptofina,
quelidonina y coptisina, y todos los parámetros
cromatográficos probados fueron peores para metanol / agua que para acetonitrilo / eluyentes
de agua En experimentos adicionales, el acetato de amonio / ácido acético en ACN / eluyentes de
agua se reemplazó por formiato de amonio / ácido fórmico; sin embargo, tuvo un impacto menor
en los parámetros cromatográficos. Los valores de Rs y los tiempos de retención no difirieron
significativamente, y solo se observó un ligero aumento en la eficacia del sistema (picos más
estrechos). Ejemplos de cromatogramas de la mezcla estándar obtenida en diversas
composiciones de fase móvil se muestran en la Figura 2.

Figura 2: cromatogramas a modo

de ejemplo de la mezcla estándar
obtenida en (a) acetonitrilo y 10
mM de solución acuosa de
formiato de amonio ajustado a pH
4 con ácido fórmico (20 : 80, v / v),
(b) acetonitrilo y solución acuosa
20 mM de acetato de amonio
ajustado a pH 4 con ácido acético (20: 80, v / v), y (c) acetonitrilo y solución acuosa al 10 mM de
acetato de amonio ajustado a pH 4 con ácido acético (20: 80, v / v). (1) protopina, (2)
allocryptopine, (3) chelidonine, (4) coptisine, (5) sanguinarine, (6) berberine, y (7) chelerythrine.
La comparación de N y As para varias composiciones de fase móvil se presenta en Figura 3.
 Figura 3: Comparación de los números de
placa teóricos y la asimetría pico obtenida
en la columna XB-C18 para 20% de
acetonitrilo y 30% de metanol: (A)
acetonitrilo y solución acuosa 10 mM de
acetato de amonio ajustado a pH 4 con
ácido acético ; (B) acetonitrilo y solución
acuosa 10 mM de formato de amonio
ajustado a pH 4 con ácido fórmico; (C)
metanol y solución acuosa 10 mM de acetato de amonio ajustado a pH 3 con ácido acético; (D)
metanol y solución acuosa al 10 mM de acetato de amonio ajustado a pH 4 con ácido acético. De
acuerdo con los resultados obtenidos, acetonitrilo a una concentración de 20% y agua a pH 3-4
con adición de acetato amónico 10-20 mM o amonio el formiato se consideró como óptimo para
la separación del alcaloide isoquinolínico en una columna con núcleo-coraza XB-C18. En la
literatura se describieron muchos sistemas cromatográficos para la separación del RP de los
alcaloides isoquinolínicos en C. majus; sin embargo, la mayoría de ellos eran más complicados
[14, 15, 22] o no proporcionaban una separación suficiente para el análisis cuantitativo [25].
Debido a la modificación adicional de la sílice de octadecilo terminal por las cadenas de isobutilo
en la fase estacionaria XB-C18, la interacción del analito básico con silanol residual disminuyó
significativamente. Permitió llevar a cabo la separación cromatográfica utilizando un pH más
suave y una menor cantidad de adición de sal en comparación con los eluyentes propuestos en la
literatura [13], y es beneficioso para el sistema de HPLC.3.2. Análisis cromatográfico de extractos
de C. majus La cromatografía del extracto de C. majus se llevó a cabo utilizando la fase móvil que
consiste en ACN (disolvente A) y una solución acuosa al 10 mM de acetato de amonio ajustado a
pH 4 con ácido acético (disolvente B) (20: 80 , v / v). Los valores altos de Rs entre coptisina y
sanguinarina permitieron utilizar el programa de gradiente simple para acortar el tiempo total de
análisis. Después de 20 minutos, la fuerza de elución de la fase móvil se incrementó para acelerar
la elución de sanguinarina, berberina y queleritrina fuertemente retenidas. El programa de
gradiente fue el siguiente: A 20% y B 80% durante 0-20 min, A 25% y B 75% durante 20-27 min, y
A 30% y B 70% durante 27-40 min. Los cromatogramas obtenidos se presentan en la Figura 4.

Figura 4: Ejemplo de un cromatograma HPLC-

DAD de extractos de diferentes partes de C.
majus: (b) raíces, (c) frutas y (d) hierbas y (a)
normas de alcaloides investigados: (1)
protopina, (2) allocryptopine, (3) chelidonine,
(4) coptisine, (5) sanguinarine, (6) berberine,
y (7) chelerythrine. Los datos usados para la
identificación de los compuestos investigados
se dan en la Tabla 3.
 Tabla 3: los datos utilizados para la identificación de los compuestos
investigados. Los resultados de la determinación cuantitativa de
alcaloides isoquinolínicos en la raíz, hoja y fruto de C. majus se dan en
la Tabla 4, y los parámetros de validación se resumen en la Tabla S3.

Tabla 4: contenido de alcaloides investigados (mg / 100 g ± DE) en

diferentes partes de C. majus.

Conflictos de interés:

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses con respecto a la publicación de este
documento. Materiales complementarios Tabla S1: la comparación de tiempos de retención y
resoluciones máximas Investigó alcaloides en 30% de acetonitrilo en agua a diferentes pH y
concentración de acetato de amonio. Tabla S2: la comparación de los tiempos de retención y las
resoluciones máximas de los alcaloides investigados en 30% de metanol en agua a diferentes pH y
concentración de acetato de amonio. Tabla S3: datos de calibración para la cuantificación de
alcaloides investigados. Figura S1: la relación entre los números de placa teóricos (N), la asimetría de
pico (As), la resolución (Rs) y la concentración de pH / acetato de amonio. (Materiales
complementarios).