Introducción.

La mayoría de las enzimas son biomoléculas, que catalizan una reacción química en
soluciones acuosas y que mantienen el proceso metabólico en funcionamiento, cada enzima
es muy específica y de alta eficiencia. Esto consiste en aumentar la velocidad de cada
reacción, disminuyendo la energía de activación sobre las moléculas que participan en esta.
_(1)
Las fosfatasas son enzimas que actúan como catalizadores en la hidrolisis de ácido fosfórico
inorgánico, se utilizan para liberar grupos fosfatos adheridos a otras moléculas. Existen dos
tipos de estas enzimas, las fosfatasas acidas y las fosfatasas alcalinas, dependiendo del medio
en el que existen. Cabe mencionar que estas enzimas presentan una característica importante
y es que poseen especificidad por un amplio rango de sustrato _ (2). Las fosfatasas acidas se
encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta la
concentración en próstata, estomago, hígado, músculos, bazos, eritrocitos y plaquetas.
También se encuentran presentes en las semillas de las plantas, aumentando su actividad
durante la germinación y disminuyendo mientras la planta se desarrolla _ (3). La fosfatasa
alcalina se encuentra en todos los tejidos corporales. Los tejidos con cantidades más altas de
estas fosfatasas son el hígado, las vías biliares y los huesos, siendo este último una de las
mayores fuentes de fosfatasa alcalina, por eso en niños y adolescentes en etapas de
crecimiento, normalmente tienen muy elevada esta enzima. _ (4)
La cinética enzimática nos habla de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por
enzimas. El estudio de los parámetros cinéticos de una enzima permite explicar los detalles
de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, como es controlada su actividad en
la célula y como puede ser inhibida su actividad por fármacos, venenos o potenciada por otro
tipo de moléculas, por lo tanto, es muy importante conocer estos parámetros cuando se quiere
estudiar una enzima y como trabaja. _ (5)
Universidad Andrés Bello
Facultad de Ciencias Biológicas
Depto. de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Bioquímica I
Profesores: José Manuel Pérez
Nicolás Bruna
Diego Martínez

Practico Nº 3 y 4:” Enzimología 1 y 2.”

Integrantes: Macarena González.

Gonzalo Ruiz.
Fecha: 27 abril 2018.
 Objetivos.

 General: Comprender acerca de cómo funciona la enzima fosfatasa, su actividad,

características y utilización.
 Específicos:
- Analizar experimentalmente el significado de los componentes Km y Vmax para la
búsqueda de los parámetros cinéticos.
-Entender los gráficos y las curvas de calibración de acuerdo a su concentración,
absorbancia y el tiempo.

Materiales.

 Tubos de ensayo.
 Micropipeta
 Vaso precipitado
 Gradilla
 Espectrofotómetro
 Baño termorregulador
 Enzima fosfatasa
 NaOH 0.02 M
 Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0
 PNP 60 Um
 Cubetas
 Métodos.

1) Curva de calibración.
- Se rotularon los tubos de ensayo del 1 al 6. Para el tubo número 1 se agregó
exclusivamente 6ml de NaOH a 0,02 M que corresponde a la muestra “blanco”. Para
el tubo número 2 se agregó 5 ml de NaOH y 1 ml de PNP 60 uM. Para el tubo número
3 se agregó 4ml de NaOH y 2ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 4 se agregó 3ml
de NaOH y 3 ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 5 se agregó 2 ml de NaOH y 4
ml de PNP 60 uM. Para el tubo número 6 se agregó 1 ml de NaOH y 5ml de PNP 60
uM.
Luego se adiciono 1 ml de cada solución en las cubetas y se ajustó el
espectrofotómetro a 405 nm para posteriormente, medir aquella que corresponde al
tubo número 1, la muestra “blanco” y luego todas las demás cubetas, para lograr
medir la absorbancia de cada una de las soluciones y registrarlas. (Tubo mixto)
2) Rango Lineal.
- Se agrego 2 ml de Buffer Citrato y 2 ml de sustrato NPP 2,5 M en un tubo de ensayo
para luego incubarlo en el baño termorregulador a 37°C durante 5 minutos.
- Se rotulo los tubos de ensayos del 1 al 5. Para cada tubo de ensayo se agregó 5.5 ml
de NaOH y 0.5 ml de solución del tubo mixto.
Luego se agregó 500 ul de fosfatasa a cada tubo de ensayo durante ciertos intervalos
de tiempo, donde al tubo 1 se agregó la enzima al minuto 0, al tubo 2 se agregó la
enzima al minuto 5, al tubo 3 se agregó la enzima al minuto 10, al tubo 4 se agregó
la enzima al minuto 15, y por último al tubo 5 se agregó la enzima al minuto 30.
Posteriormente se adiciono 1 ml de cada solución en las cubetas, se ajustó el
espectrofotómetro a 405 nm, se midió la absorbancia de las soluciones y se
registraron.
3) Determinación de parámetros cinemáticos.
-Se rotularon tubos de ensayo del 1 al 5 y se agregó buffer citrato, agua y NPP según
las cantidades que indica la siguiente tabla, con un volumen total de 4,5 ml.

Tubo NPP (ul) Buffer Agua (ml) Fosfatasa

Citrato (ml) (ml)
1 50 2 2.45 0.5

2 100 2 2.40 0.5

3 200 2 2.30 0.5

4 500 2 2.00 0.5

5 1000 2 1.00 0.5

Se incubaron los tubos de ensayo durante 15 minutos a 37°C y luego se agregó 500
ul de enzima fosfatasa a cada tubo y se incubo nuevamente por 15 minutos. Paralelo
a este proceso se rotularon 5 tubos de ensayos y agregaron 5 ml de NaOH 0.1 M a
tiempo 0 minutos y 15 minutos. Posteriormente de la solución con la enzima se
tomaron 500 ul y agregaron a cada tubo en el tiempo cero, se midió la absorbancia en
el espectrofotómetro a 405 nm y luego se hizo el mismo procedimiento, pero con los
tubos de tiempo 15 minutos.
 Resultados.

Curva de Calibración: Tras llevar cada uno de los tubos el espectrofotómetro se

obtuvieron los resultados de absorbancia de la tabla 1. Luego de esto lo que se hizo
fue sacar la concentración de P-Nitrofenol para poder obtener la cantidad de moles
en cada uno de los tubos. Esto se realizó usando formulas simples de concentración
“C1*V1=C2*V2” en donde C1=concentración de PNP (60 uM). V1=ml de PNP
utilizados. V2=volumen final disolución. C2=concentración obtenida finalmente. Y
para sacar los Umol se multiplico las concentraciones por 0,006 L obteniendo los
resultados que se muestran en la tabla 1.

Tabla 1.
Tubo ml PNP 60 ml NaOH Absorbancia PNP uM PNP Umol
uM 0,02M
1 0 6 0 0 0
2 1 5 0,329 10 0,06
3 2 4 0,639 20 0,12
4 3 3 0,941 30 0,18
5 4 2 1,246 40 0,24
6 5 1 1,541 50 0,30

Después de haber obtenido los resultados visto en la tabla 1se hizo una curva de
calibración la cual se graficó y se obtuvo la siguiente ecuación de la absorbancia
respecto a los Umoles de PNP: “Y=5,1229X+0,0142” en donde Y= absorbancia.
X=Umoles de PNP.

Umol PNP v/s Absorbancia

1.8
1.6
1.4
Absorbancia.

1.2
1
0.8 y = 5.1229x + 0.0142
0.6 R² = 0.9997
0.4
0.2
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
Umol de PNP.
Representación de rango: En la tabla 2 se muestra la relación de la absorbancia respecto al
tiempo de reacción de la enzima (fosfatasa acida) con el P-Nitrofenolfosfato en medio
alcalino (NaOH) en el cual se producto será P-Nitrofenolato (coloración amarilla).
Tabla 2.
Tubo NaOH (ml) Mix (ml) Tiempo (min) Absorbancia (405
nm)
1 5,5 0,5 0 0
2 5,5 0,5 5 0,102
3 5,5 0,5 10 0,238
4 5,5 0,5 15 0,374
5 5,5 0,5 30 0,646

En el siguiente grafico se puede observar el rango lineal entre la absorbancia (eje y) medida
a 405 nm v/s el tiempo (min) (eje x) en donde se obtuvo la siguiente ecuación:
“Y=0,0218X+0,0103”.

Tiempo (min) v/s Absorbancia.

0.7

0.6

0.5
absorbancia.

0.4
y = 0.0218x + 0.0103
0.3 R² = 0.9914
0.2

0.1

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (min).
Tras obtener estos resultados lo que se hizo fue sacar la concentración de P-Nitrofenolato en
Umol reemplazando las absorbancias de la tabla 2 en la ecuación de la recta del primer grafico
(Y=5,1229x+0,0142). A lo que se obtuvo lo mostrado en la tabla 3.
Tabla 3.
Tubo Tiempo (min) Absorbancia Umol de PNP
(405) nm
1 0 0 0
2 5 0,102 0,536
3 10 0,238 1,233
4 15 0,374 1,930
5 30 0,646 3.323

Representación gráfica de la cantidad de Umoles de PNP con respecto al tiempo (min) en

donde se obtuvo la siguiente ecuación: “Y=0,0112x+0,0598”. En donde Y= Umoles de PNP.
X=Tiempo (min).

Umol PNP v/s Tiempo (min)

4

3.5

2.5
Umol PNP

2
y = 0.112x + 0.0598
1.5 R² = 0.9912

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30 35
Tiempo (min)
En la tabla 4 se muestran las absorbancias obtenidas en tiempo (min) 15 con distintas
cantidades de P-Nitrofenilfosfato e igual cantidad de enzima fosfatasa acida (500 ul).
Tabla 4.
Tubo NPP 0,025 Citrato 0.1 H2O (ml) NaOH 0.1 Fosfatasa Absorbancia
M (ul) M (ml) M (ml) (ul)
1 50 2 2,45 5 500 0,044
2 100 2 2,40 5 500 0,083
3 200 2 2,30 5 500 0,138
4 500 2 2,00 5 500 0,236
5 1000 2 1,00 5 500 0,384

Luego se ocupó la ecuación de la curva de calibración del primer grafico

(Y=5,1229x+0,0142) para obtener la cantidad de Umoles de NPP que reaccionaron con la
enzima (PNP) en el tiempo (min) 15. Los resultados de estos fueron los siguientes:
Tabla 5.
Tubo Absorbancia Umol de PNP
(T 15)
1 0,044 0,239
2 0,083 0,439
3 0,138 0,721
4 0,236 1,223
5 0,384 1,981

Tras obtener cada una de sus concentraciones se realizó el cálculo de las velocidades de cada
una de ellas dividiendo los Umol resultantes en 15 min. Los resultados se muestran en la
tabla 6.
Tabla 6.
Tubo Vo (Umol/min)
1 0,0159
2 0,0292
3 0,0480
4 0,0815
5 0,1320
Posteriormente a partir de las cantidades de ul de NPP a 0,025 M se calculó cada una de las
concentraciones a partir de la fórmula de concentraciones “C1*V1=C2*V2” en donde C1=
25 uM. V1=los uL que se utilizaron de NPP.C2=es la concentración final obtenida. V2=
volumen final que equivale 4,5 ml.
Tabla 7.
Tubo Concentración (uM)
1 0,2777
2 0,5555
3 1,1111
4 2,7777
5 5,5555

Al obtener los valores de velocidad y concentración se realizó el siguiente grafico

(Velocidad/Sustrato).

Grafico Michaelis-Menten.
0.16
0.14
velocidad (Umol/tiempo)

0.12
0.1
0.08
0.06
y = 0.0212x + 0.0178
0.04 R² = 0.9838
0.02
0
0 1 2 3 4 5 6
sustrato (uM)
Después se calculó el inverso de las velocidades y de los sustratos del grafico para poder
realizar el Grafico de LineWeaver-Burk el cual arrojo los siguientes resultados.

Grafico de LineWeaver-Burk.
70
60
50
40
30 y = 15.869x + 5.8506
1/V

R² = 0.9988
20
10
0
-2 -1 0 1 2 3 4
-10
-20
1/[s]

A partir de este grafico se obtuvieron las constantes cinéticas usando la ecuación de la recta
pendiente las cuales resultaron ser las siguientes:
Vmax= 5,8506 uM/min
Km= 2.7 Um
 Discusión.

La curva se utiliza para determinar la concentración de una muestra problema, en donde se

relaciona una solución de concentración conocida “micromoles de PNP” con su
correspondiente absorbancia. Cabe mencionar que la ley de Lamber Beer establece que la
absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito con su
concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra,
y en los resultados apreciamos que mientras mayor fue la concentración de Umoles de PNP
mayor fue la absorbancia registrada, existiendo una relación exponencial entre la transmisión
de la luz a través de una sustancia y la concentración de ella misma._(6)
Esta curva de calibración nos arroja una ecuación, que fue “Y=5,1229x+0,0142”, en donde
“Y” corresponde a la absorbancia y “X” los Umoles de PNP, y reemplazando las
absorbancias obtenemos la concentración requerida. Estas concentraciones deben estar
comprendidas en el rango de concentración que se observa en la curva de calibración. Para
tener una buena exactitud y confiabilidad estadística, el método de mayor confiabilidad para
encontrar los parámetros de la curva de calibración es el método de los “mínimos cuadrados”.
Este método busca la recta del que haga que la suma de los cuadrados de las distancias
verticales entre cada punto experimental y la recta de calibrado sea mínima o tienda a cero,
lo que se observa gratamente en la línea de nuestra curva. _(7)
En relación con la curva de la absorbancia respecto del tiempo, podemos extraer que a medida
que transcurre el tiempo de la reacción, esta avanza de mejor forma debido a que la enzima
tiene más tiempo para que se logre la interacción entre el sustrato y el sitio activo, por lo
tanto, existe una relación directa entre ambas variables, donde a mayor paso del tiempo,
mayor absorbancia y viceversa, en un bajo tiempo se obtuvo una baja absorbancia.
Para comenzar a discutir acerca de los parámetros cinéticos obtenidos es necesario definir
ciertos conceptos como Vmax y Km. En el caso de esta última, es una constante lo cual nos
indica la concentración de sustrato que interactúa con la enzima, (en este caso el PNP con la
fosfatasa acida), en la mitad de la velocidad máxima de la reacción (Vmax/2), lo que representa
que tan rápido se une el sustrato al sitio activo de la enzima. El valor de este nos da como
idea la afinidad que tiene la enzima con el sustrato por lo que entre menos sea el valor de Km
mayor será la afinidad de la enzima con el sustrato, aunque esto no nos sirva para comparar
distintas enzimas si es necesario para que mediante otra fórmula (Kcat/Km) si poder comparar
la eficiencia máxima a la que llega la velocidad de la reacción enzimática en donde se alcanza
el punto de saturación de la enzima._(8)
En cuanto a los resultados de parámetros cinéticos (Vmax y Km) comparamos nuestras
constantes cinéticas con las de otros trabajos y aunque no fueron del todo iguales solo se
diferencian por pequeños errores de márgenes, esto puede deberse a la temperatura uno de
los factores más importantes que gobiernan la velocidad de las reacciones bioquímicas, ya
que dependiendo de la temperatura la enzima tiene un funcionamiento distinto considerando
de que esta ya consta de una temperatura óptima. Respecto del PH no tuvimos diferencias,
ya que, se utilizó un PH estándar (un buffer de citrato de sodio, para mantener el PH optimo)
para todos los trabajos prácticos, a un que la acción catalítica de una reacción enzimática es
alcanzada dentro de límites muy estrechos de PH óptimos (4.5 a 8.0), donde a estos valores
usualmente se presentan los máximos de actividad. _(9)
Tras el análisis de nuestros resultados como la Km la cual nos arrojó un resultado de: “2.7
uM" el cual nos dice que la enzima con la cual se trabajó (fosfatasa acida) junto con el sustrato
(P-Nitrofenolfosfato) a la mitad de la velocidad máxima de reacción alcanza interacciones
entre el sitio activo y el sustrato de 2,7 uM o en simples palabras 2,7 Umoles por litro lo cual
a partir de lo investigado en referencias es una km baja por lo que representa una afinidad
muy alta._(10)
 Conclusión.

A partir del amplio análisis de los resultados y tomando en cuenta los objetivos de este
practico llegamos a concluir que en el caso de la curva de calibración se puede llegar a usar
para muchos procedimientos deseados en trabajos rutinarios de laboratorio (ej: Utilización
de parámetros químicos y microbiológicos como criterios de madurez durante el proceso de
compostaje , Purificación y determinación de actividad enzimática de la catalasa en
Staphylococcus aureus, etc.) ya que con ella podemos establecer o predecir futuros valores
de interés los cuales nos pueden servir para llevar a cabo experimentos o sacar valores
deseados de concentraciones como lo fue en este caso. En cuanto a la curva del rango en un
determinado tiempo se infiere que es muy necesario para así poder calcular el tiempo de
saturación de una enzima a estudiar y así poder tener valores más exactos para el caculo de
las constantes cinéticas de las enzimas.
 Bibliografía.

(1) _Donald Voet, Judith G. Voet. Bioquímica. Tercera edición. Editorial Medica

Panamericana. Página 273.

(2) _ Development of a reference material for alkaline phosphatase. Clin Chem 1984;30:93-
7.

(3) _ Athel Cornish-bowden,Fundamentals of Enzyme Kinetics. (3rd edition), Portland

Press2004.

(4) _ Chris Walsh.Enzymatic Reaction Mechanisms. W . H . Freeman and Company. 1979

(5) _ Nicholas Price, Lewis Stevens, Fundamentals on Enzymology, Oxford University

Press, 1999.

(6) _ Fischer r. b. Compendio de análisis químico cuantitativo. Absorbancia. Editorial

Interamericana México 1971. pp. 403-408

(7) _ Danzer Klaus, Currie Lloyd A. "Guidelines for calibration in analytical chemistry Part
1. Fundamentals and single component calibration UPAC Pure & Appl. Chem, Vol.70, No.4,
pp.993-1014, 1998.

(8) _ Miguel A. Rosa, José M. Peralta y Diego M. Bosco. "Estimación de Parámetros

Cinéticos de la Degradación Aeróbica de Efluentes Lácteos usando AQUASIM".
Universidad Tecnológica Nacional - Facultad Regional Villa Maria, Grupo de Investigación
en Simulación para Ingeniería Química. Oct. 26, 2009

(9) _ José Antonio Bárcena Ruiz, Concepción Garcia Alfonso, Carmen Alicia Padilla Peña,
Emilia Martinez Galisteo, Jesús Diez Dapena. Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severa Ochoa, 14071-Córdoba.
"Caracterización cinética de la fosfatasa alcalina”

(10) _ Emilio Guija , Mercedes Soberón Hielke Haak-M. Anales de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. “Mecanismo de acción de las fosfatasas ácidas
de bajo peso molecular “