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Resumen
La reacción de la cadena de la polimerasa se ha establecido como una técnica común en los
laboratorios de investigación debido a que permite una rápida amplificación de muestras de DNA,
aumentando así su cantidad, para posteriores análisis. En este informe se amplificó el fragmento
del gen GapA de Klebsiella pneumoniae HS11286 haciendo uso de un termociclador y las
condiciones necesarias para la amplificación, programando temperaturas de desnaturalización
94°C, alineación 60°C y extensión 72°C en 35 ciclos de un minuto, con una posterior electroforesis
en gel de agarosa. Se logró una amplificación selectiva del fragmento de GapA, observándose
bandas de aproximadamente 600 pb en el electroferograma. Para confirmar estos resultados, se
realizó una PCR in silico del gen obteniéndose bandas de 663bp en la posición 2132725bp del
genoma bacteriano.
OBJETIVO: Realizar la amplificación del gen gapA de Klebsiella pneumoniae HS11286 mediante
la reacción en cadena de polimerasa (PCR), realizar una corrida electroforética en gel de agarosa del
producto obtenido, observar los resultados y compararlo con un ensayo de amplificación in silico.
dupletas, por lo que se rotuló 3 tubos eppendorf M1 del marcador de peso molecular de 1Kb se encuentre
(Master Mix), M2 (segunda reacción) y el C(-) a 1cm del borde inferior.
(control sin ADN).
III. RESULTADOS
La enzima es agregada como último paso, ya que al
tener contacto con el DNA comienza a actuar. Análisis del gen gapA de Klesbsiella
pneumanie en el programa NCBI
B. PCR
La figura 1 indica el locus, y el tamaño del gen gapA
Se configuró el programa mostrado en la Tabla 3 en
el tamaño en bp analizados a partir de los primers
el termociclador.
Locus NC_0168451
Tabla 1. Programa utilizado en el termociclador Tamaño 663 bp
Primer F 5´CTTCAGAAGCTCCACTCACGG 3´
Temperatur Tiemp Ciclo
Primer R 5’
a (°C) o (min) s
CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT´
Desnaturació
94 2 1
n Inicial
Figura 1: Análisis del gen gapA en NCBI-Blast
Desnaturació
94 30 seg
n
35
Annealing 60 30 seg La figura 2 indica la secuencia completa del gen
Extensión 72 1 gapA de Klebsiella pneumonie obtenida en NCBI-
Extensión Blast.
72 30 seg 1
Final
Conservación 4 - 1
C(-) M1 M2 M B. PCR
La PCR es un ensayo enzimático simple. Dentro del
Figura 3: Electroforesis de la amplificación del gen gapA de
Klebsiella pneumonie. En agarosa 1.5 % TBE.C(-): Control proceso de elongación de la cadena de ADN se unen
Negativo, M: Marcador, M1 y M2: Muestras con el DNA los cebadores que debe detectar a la cadena de DNA
diana para amplificarse (Garibyan, 2015).
Amplificación en el software In silico.
Según Balari (2015), la concentración optima de los
primers en la mayoría de reacciones de PCR se
encuentra entre 0.2-0.5 𝜇𝑀, lo que nos garantiza la
correcta reacción de amplificación, y como se
observa en la figura 3, los resultados obtenidos tras
la electroforesis en el gel de agarosa se evidencia la
amplificación del gen gap A en la que se utilizó 0.2
𝜇𝑀, a esto se suma lo descrito por (Louis, 2017)
sobre la importancia de un buen diseño de primers,
en figura 1 y 2 el análisis del gen se pudo realizar a
partir de los primers previamente diseñados y
colocados dentro del master mix, dando como
Figura 4: PCR in silico del gen gapA de Klebsiella información el locus, el tamaño, la secuencia del gen
pneumoniae HS11286 que se va amplificar (Klesbsiella pneumanie)
comprobando la defectibilidad de los primers
utilizados.
IV. DISCUSIÓN
C. ELECTROFORESIS
A. Preparación de reactivos y muestras
Para observar los amplicones generados tras el
Según Genómica Médica (2015) “la primera etapa
procedimiento de PCR se utilizó electroforesis en
para realizar una reacción en cadena de polimerasa
gel de agarosa 1.5% con la tinción del bromuro de
es la preparación del master mix, esta etapa es
etidio, observando en la figura 3 dos bandas cuyos
crucial para obtener buenos resultados (2015). El
tamaños del fragmento amplificado en teoría deben
master mix con las cantidades exactas tiene la
ser idénticos a los predichos a partir de la secuencia
ventaja de que el costo por cada reacción disminuye
de nucleótidos obtenida con el programa NCBI,
considerablemente (Pacheco, 2014). En la Tabla 2
Biología Molecular III
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/m ed=0ahUKEwi02KrBn9bYAhWFmeAKHc
icrobios/Cap18/ tkAIgQ6AEILTAB#v=onepage&q&f=true
Segal, C. (2005). Biologia Molecular de la UNIPROT. (2013). Glyceraldehyde-3-
Celula I. Mexico: UNAM. Obtenido de phosphate dehydrogenase. Obtenido de
https://books.google.com.ec/books?id=- http://www.uniprot.org/uniprot/P24164
i_7RXUu44IC&pg=PT92&dq=enzimas+de
+restriccion+introduccion&hl=es&sa=X&v
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