Titulo: Biocatalizadores; Inmovilizacion de enzim

Objetivo

Este protocolo tiene como objetivo estandarizar el proceso de producción de Koji a través
de la definición y descripción de:

 los materiales utilizados para su producción

 las diferentes fases del proceso
 los parámetros implicados durante el proceso
 las correlaciones entre los parámetros del proceso y la producción enzimática
 análisis de tipo teórico sobre los riesgos toxicológicos del proceso.

Se busca optimizar el proceso considerando el crecimiento del hongo, con el fin de obtener
el máximo crecimiento de micelio, la máxima producción enzimática, evitar la
contaminación bacteriana durante el cultivo del hongo y en los materiales empleados
y prevenir la inactivación de las enzimas producidas.

Introducción

El koji es un ingrediente muy importante en la tradición alimentaria en el sudeste asiático y

en asia oriental, constituye el primer paso en la producción de alimentos fermentados como
la salsa de soja, el miso, el mirin, el sake o el amazaké. Su producción se basa en la
inoculación de un substrato de granos (ricos en carbohidratos y proteínas) con Aspergillus
oryzae, el cual realiza un proceso fermentativo con la consecuente producción de
enzimas extracelulares (amilasas y proteasas) que tienen la capacidad de hidrolizar
macromoléculas como el almidón, dextrinas y proteínas, convirtiéndolas en carbohidratos
más simples, péptidos o aminoácidos. La producción enzimática es una característica
fundamental del proceso y es la actividad de estas enzimas sobre diversos substratos, lo que
convierte al Aspergillus oryzae en la primera etapa de múltiples elaboraciones y
fermentaciones.

Agente

El microorganismo responsable de la fermentación en el proceso de producción de

Koji es el Aspergillus oryzae, es un hongo filamentoso con la capacidad de excretar, en
grandes cantidades, diferentes enzimas hidrolíticas. La capacidad de secretar proteínas al
medio, se potencia si el cultivo se realiza en un medio sólido comparado con un medio
sumergido (Biesebeke et al. 2002). Los dos principales metabolitos primarios secretados
por el Aspergillus Oryrzae son la α-amilasas (endo-1,4- α -d-glucanglucohydrolase EC
3.2.1.1) y las proteasas (Chancharoonpong et al. 2012).

La α-amilasa realiza una hidrólisis random de los enlaces α-1,4 en la cadena lineal de las
macromoléculas de almidón. De su acción se obtienen dextrinas y cadenas cortas
constituidas por glucosa. De este modo la amilasas encuentra particulares aplicaciones en la
industria de alimentos, textil y en la industria del papel.

En relación a las proteasas, estas son clasificadas en función de su acidez en ácidas, neutras
y alcalinas según el pH en cual tienen la máxima actividad. Las proteasas neutras son unas
de las más importantes en la industria de alimentos ya que tienen la capacidad de hidrolizar
los enlaces peptídicos a pH neutro reduciendo la amargura (Sandhya C. et al. 2005). Las
proteasas ácidas están presentes en la mayor parte de aplicaciones del koji donde el pH es
ácido.

Medio de cultivo

El medio de cultivo puede ser constituido por diferentes cereales (trigo, arroz, cebada, ect)
los cuales presentan una composición de macromoléculas bastante similar Tabla 1. La
fermentación en cuestión se realiza en un medio sólido. Este tipo de medio es muy
beneficioso para el crecimiento del hongo debido al bajo contenido de agua (40-60%),
permitiendo la penetración de los micelios del hongo a través del substrato sólido. Por otra
parte, la baja humedad en un medio de cultivo sólido, hace que los microorganismos
adquieran la capacidad de producir metabolitos (deseados en el caso de la producción de
Koji), que en medio líquido no serían producidos. (Biesebeke et al. 2002).

Al considerar diferentes cereales como substrato, no hay diferencias significativas respecto

a la producción enzimática. Sin embargo, el substrato de trigo permite la máxima
producción, a nivel de expresión génica, de enzimas hidrolíticas específicamente α-
amilasas (Maeda et al., 2004). Como evidencian los estudios de (Machida et al., 2008) el A.
oryzae en un terreno de cultura sólido constituido por trigo es capaz de producir cerca
de 50 g de α-amilasas por kilo de trigo. Otros terreno de cultivo a base del arroz
favorecen la producción de proteasa (Chutmanop et al., 2008).

Trigo
Proteína 15%
Grasa 6%
Carbohidratos 79%
Cebada
Proteína 13%
Grasa 6%
Carbohidratos 81%
 Arroz
Proteína 8%
Grasa 4%
Carbohidratos 88%

Tabla 1. Datos del trigo. Fuente: Bedca (Base de Datos Española de composición
alimentaría)

Parámetros

Los parámetros fundamentales durante los procesos de fermentación son:

 Humedad del substrato

 Temperatura
 Tiempo

Entre los parámetros antes mencionados no se encuentra el pH, ya que dicho parámetro en
la producción de Koji no resulta un parámetro crítico en la producción enzimática
(amilasas y proteasas), si el intervalo de trabajo es cercano a la neutralidad (pH 5,5- 7,5)
como lo indica (Francis et al., 2003) y (Sandhya et al., 2005).

Por su parte la concentración de Aspergillus en el medio se fija a 10 esporas/g DS en el

medio.

Es necesario mencionar que las condiciones óptimas de crecimiento del hongo, no

corresponden con las condiciones óptimas de producción enzimática. Por este motivo para
definir las condiciones se tienen que considerar tres protagonistas en la producción del
koji: el Aspergillus oryzae, α-smilasas y proteasas (neutras y ácidas). Las condiciones de
producción óptimas resultan las condiciones en las cuales se permite el crecimiento del
microorganismo y maximizan la producción de los metabolitos primarios de interés.

Otro aspecto importante radica en el hecho de que las amilasas y la proteasas son
producidas en fases diferentes del crecimiento del microorganismo. Por una parte, las
amilasas son excretadas al inicio del proceso metabólico (0-18h) puesto que son enzimas
necesarias que permiten la disponibilidad de alimento (carbohidratos simples) para
el microorganismo (Chutmanop et al., 2008). Las proteasas, por su parte, son producidas
en una segunda fase (18-48h) cuando el microorganismo ya ha crecido suficientemente y ha
consumido los carbohidratos disponibles en el medio de cultivo (Chutmanop et al., 2008).

Humedad inicial

En los procesos fermentativos en estado sólido, la humedad inicial del substrato es un

factor crítico en el crecimiento del hongo y en la producción enzimática. La presencia de
agua en el sustrato hace que los nutrientes sean más accesibles para el hongo, favoreciendo
su crecimiento. Un exceso de la humedad del sustrato afecta a la difusión del oxígeno en el
medio reduciendo la porosidad, haciendo que las partículas se peguen entre si afectando
negativamente a la transferencia de oxígeno al hongo, y por consiguiente al crecimiento
del microorganismo. Por otra parte, una disminución de la porosidad impide la disipación
de calor, favoreciendo un incremento de la temperatura durante la primera fase en donde
hay una respiración muy activa. Una temperatura elevada (superior a 45ºC) puede matar el
microorganismo.

Por su parte una baja humedad del sustrato reduce los valores de agua libre hasta niveles
que no favorecen el crecimiento del hongo.

Durante el proceso fermentativo, en especial durante la fase de crecimiento del

microorganismo, se evidencia una actividad respiratoria del mismo elevada con
consecuente producción de CO2 y agua, que se traduce en un aumento de humedad. Sin
embargo después de esta primera fase de crecimiento el metabolismo de hongo disminuye
su cinética y se presenta una reducción en la humedad de medio (Chancharoonpong et al.
2012).

Las condiciones óptimas de humedad para crecimiento del hongo, no corresponden con
las condiciones óptimas de producción enzimática (Tablas 2).

Estado Humedad % subtrato

Crecimiento Aspergillus oryzae 40 a
Producción α-amilasas 70 a
Producción proteasas neutras 35 c

Tablas 2. Condiciones de Humedad óptima del sustrato para el crecimiento del Aspergillus
oryzae, α-amilasas y proteasas neutras. Fuente: a. Narahara et al, 198 , b. Francis et al.,
2003, c. Narahara et al, 1982

La humedad inicial óptima del medio de cultivo es 50-55%. Esta humedad favorece el
crecimiento del microorganismo y la producción de amilasa en las primeras horas de
proceso. Considerando la disminución de la humedad durante la segunda fase metabólica,
la humedad del medio resulta muy cercana a la humedad óptima para la producción de
proteasas.
Figura 2: perfil del pH y de la humedad en el tiempo: Fuente (Chancharoonpong et al.
2012)

Temperatura

La temperatura resulta un parámetro fundamental en el desarrollo de los parámetros

biológicos, ya que determina los efectos de la desnaturalización de las proteínas, la
inhibición enzimática, y la activación o supresión de la producción de metabolitos.

Al igual que con la humedad del medio de cultivo, la temperatura óptima de crecimiento
del Aspergillus oryzae, difiere de la temperatura óptima de producción de α-amilasas y
proteasas (tabla 3)

Estado T Optima ºC
Crecimiento Aspergillus oryzae 38 a
Producción α-Amilasas 30-35 b
Producción Prótesis 25-30 c, d

Tablas 3. Condiciones de temperatura óptima del sustrato para el crecimiento del

Aspergillus oryzae, α-amilasas y proteasas neutras. Fuente a. Narahara, H. et al, 198 ,
b. Francis. et al., 2003, c. Chutmanop et al., 2008, d. Narahara. et al, 1982

Por este motivo durante el proceso de producción de Koji es oportuno utilizar dos
temperaturas a lo largo del proceso. Una temperatura en la fase inicial (0-18h) de 32ºC,
para favorecer el crecimiento del Aspergillus y la producción de amilasas y otra
temperatura en la fase de producción de proteasas (18-48h) de entre 25-30ºC.
El parámetro de la temperatura puede verse afectado si no tenemos en cuenta que durante la
primera fase de este proceso (0-18 h), como consecuencia de la actividad metabólica
(respiración con consecuente liberación de energía térmica) se produce un aumento de la
temperatura.

Por lo tanto sería oportuno durante la primera fase, fijar el SP (set point) de temperatura en
32ºC. Esta temperatura aumentará 6ºC por el calor emitido por la actividad metabólica y
por consiguiente se trabajara en un rango de temperatura de entre 32ºC y 38ºC, rango
óptimo para el crecimiento microbiológico y para la producción de amilasas.

Tiempo

La producción de koji debe tener un tiempo máximo de 48 h, ya que la máxima producción

de proteasas se alcanza después de 48h, acto seguido entra en una fase decreciente
(Chancharoonpong et al. 2012).

Por otra parte después de 50 h el Aspergillus oryzae, inicia la producción de metabolitos

secundarios entre los que se encuentran el ácido Kojico, ácido ciclopiazónico, Maltorizina,
ácido 3-Nitropropiónico, los cuales son tóxicos (Blumenthal, 200).

a)
b)

Figura 4. a) Temperatura y humedad de Set point (SP) en la producción de Koji. En

términos de humedad del medio solo se considera la humedad inicial del medio a
55%. Considerando la temperatura se establecen dos SP de temperatura en función del
tiempo. Tiempo 0-18h de Temperatura SP= 32ºC y tiempo de 18-48h de Temperatura
SP=25ºC. b) Tendencia de la actividad enzimática de las proteasa y amilasa en función del
tiempo. Fuente: Chutmanop et al., 2008.
Figura 5. Descripción de las condiciones tiempo y temperatura de crecimiento óptimo de
Aspergillus oryzae y producción de α-amilasas y proteasas.

Materiales y Método

Materiales:

 1kg de Cereal (cebada, trigo o arroz).

 2 g Esporas de Aspergillus oryzae.
 Horno o estufa con control de temperatura y conservador de humedad.
 Paños limpios esterilizados
 Recipiente rectangular plástico.
 Termómetro.
  Alcohol para desinfección de los materiales y equipos.
 Guantes propileno

Método tradicional de la preparación del Koji:

La preparación del Koji sigue las siguientes fases:

 Remojo
 Cocción (vapor)
 Enfriamiento
 Inoculación
 Incubación

Los pasos de preparación se describen a continuación:

1. Remojar el cereal durante 12 h mínimo. Para el remojo se utiliza agua para favorecer que
el grano se ablande.

2. Cocinar el cereal en un horno a vapor 100ºC durante 90 minutos utilizando una bandeja
perforada filmada.

3. Una vez el cereal se ha enfriado (35-30ºC), esterilizar las manos con alcohol, ponerse
guantes y verter el cereal en un contenedor hermético creando un estrato de
aproximadamente 2 cm de espesor.

4. Preparar un paño, esterilizado caliente, húmedo y escurrido para cubrir el koji.

5. Cuando el salvado ha llegado a una temperatura de 35ºC y se ha dispuesto el cereal en

una bandeja con las esporas de A. oryzae en polvo y se mezcla bien en modo de cubrir
todos los granos. A continuación se cubre el todo con el paño antes preparado.

6. Poner en una bandeja en la incubadora con control de temperatura a 32ºC.

Consideraremos ahora tiempo 0 en la fermentación.

7. Después de 18h (t=18h), se retira la bandeja y se mezcla el koji para airear y asegurar
una distribución uniforme de las esporas. Debe comenzar a oler afrutado y
fragante. Rehumedecer el paño, cubrir nuevamente. Cambiar el set point de la temperatura
del horno a 25ºC. A este punto se introduce el recipiente en la incubadora nuevamente.

8. Al t=24h mover nuevamente el koji. Volver a introducir el recipiente ala incubadora con
el paño humedecido.

9. Al t =30h, se mezcla por la última vez el koji, Se humedece de nuevo el paño y se

introduce el recipiente en la incubadora.
10. Después de 36h el micelio ha cubierto completamente los granos y se encuentra
completamente mezclado con el substrato. En este periodo se evidencia la producción de
proteasas.

11. A las 48 h retirar el koji de la incubadora.

Evaluación Toxicológica

Durante la fermentación Aspergillus oryzae además de la producción de amilasas y

proteasas, se producen metabolitos secundarios muchos de los cuales pueden ser tóxicos:
ácido kojico, ácido ciclopiazónico, maltorizina, ácido 3-Nitropropiónico entre otros. Sin
embargo, como es declarado por Environmental Protection Agency (EPA), 1997b en su
documento de decisión final, bajo las condiciones usuales de cultivo, la cepas
comercializadas de Aspergillus oryzae no parecen producir micotoxinas a niveles
significativos. Esta afirmación es confirmada por diferentes estudios científicos (Kusumoto,
K. I.et al., 1998; Kusumoto, K. I.et al., 2000; Liu and Chu, 1998; Watson et al., 1999; Wei
and Jong, 1986) en donde se afirma que los genes del A. oryzae responsables de la
biosíntesis de aflatoxinas estas desactivados.

Por otra parte, la producción de ácido ciclopiazónico no se verifica con tiempos de

inoculación de A. oryzae inferiores a 50h como lo evidencia Goto et al. 1987. El tiempo de
inoculación descrita en este método, es de 48 h por lo tanto, se puede concluir que no
habrá producción de este metabolito.

Por su parte, la producción de maltorizina depende de la composición del substrato y en el

caso de producción de koji utilizando arroz, cebada, trigo o maíz, no se verifica la
producción de este compuesto (Blumenthal, 2004).

En cuanto al ácido kojico, fue demostrado por Burdock et al, 2001 que no presenta un
peligro para la salud humana en las concentraciones producidas durante la fermentación
producida por Aspergillus oryzae.

Conclusiones

La producción de koji es un proceso fermentativo, a partir del crecimiento de Aspergillus

oryzae en un substrato sólido, formado por cereales ricos en carbohidratos y proteínas, que
tiene como objetivo la producción de amilasas y proteasas. Teniendo en cuentas que estos
dos tipos de enzimas son secretadas en fases diferentes del proceso, se proponen
finalmente los siguientes parámetros para maximizar la producción de las dos enzimas:
humedad inicial del medio 50-55 %; temperatura en las primeras 18h de proceso de 32ºC y
temperatura en la segunda fase del proceso (18h-48h) de 25ºC; un tiempo de crecimiento
máximo de 48h.

Se concluye que el proceso de producción de Koji, siguiendo las indicaciones presentadas

en este estudio, no conlleva la producción de sustancias tóxicas como aflatoxinas y otros
metabolitos secundarios tóxicos.

Bibliografia

Biesebeke, R., Ruijter, G., Rahardjo, Y. S., Hoogschagen, M. J., Heerikhuisen, M., Levin,
A., & Weber, F. J. (2002). Aspergillus oryzae in solid-state and submerged fermentations.
FEMS yeast research, 2(2), 245-248.

Blumenthal, C. Z. (2004). Production of toxic metabolites in Aspergillus niger, Aspergillus

oryzae, and Trichoderma reesei: justification of mycotoxin testing in food grade enzyme
preparations derived from the three fungi. Regulatory Toxicology and Pharmacology,
39(2), 214-228.
Burdock, G. A., Soni, M. G., & Carabin, I. G. (2001). Evaluation of health aspects of kojic
acid in food. Regulatory toxicology and pharmacology, 33(1), 80-101.

Chancharoonpong, C., Hsieh, P. C., & Sheu, S. C. (2012). Production of enzyme and
growth of Aspergillus oryzae S. on soybean koji. International Journal of Bioscience,
Biochemistry and Bioinformatics, 2(4), 228.

Chutmanop, J., Chuichulcherm, S., Chisti, Y., & Srinophakun, P. (2008). Protease
production by Aspergillus oryzae in solid‐state fermentation using agroindustrial substrates.
Journal of Chemical Technology and Biotechnology,83(7), 1012-1018.

Francis, F., Sabu, A., Nampoothiri, K. M., Ramachandran, S., Ghosh, S., Szakacs, G., &
Pandey, A. (2003). Use of response surface methodology for optimizing process parameters
for the production of α-amylase by Aspergillus oryzae. Biochemical Engineering Journal,
15(2), 107-115.

Goto, T., Shinshi, E., Tanaka, K., & Manabe, M. (1987). Production of cyclopiazonic acid
by koji molds and possibility of cyclopiazonic acid contamination of Japanese fermented
foods. Report of National Food Research Institute (Japan).

Kusumoto, K. I., Nogata, Y., & Ohta, H. (2000). Directed deletions in the aflatoxin
biosynthesis gene homolog cluster of Aspergillus oryzae. Current genetics, 37(2), 104-111.

Kusumoto, K. I., Yabe, K., Nogata, Y., & Ohta, H. (1998). Aspergillus oryzae with and
without a homolog of aflatoxin biosynthetic gene ver-1. Applied microbiology and
biotechnology, 50(1), 98-104.

Sandhya, C., Sumantha, A., Szakacs, G., & Pandey, A. (2005). Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state
fermentation. Process biochemistry, 40(8), 2689-2694.

Machida, M., Yamada, O., & Gomi, K. (2008). Genomics of Aspergillus oryzae: learning
from the history of Koji mold and exploration of its future. DNA research, 15(4), 173-183.

Maeda, H., Sano, M., Maruyama, Y., Tanno, T., Akao, T., Totsuka, Y., … & Akita, O.
(2004). Transcriptional analysis of genes for energy catabolism and hydrolytic enzymes in
the filamentous fungus Aspergillus oryzae using cDNA microarrays and expressed
sequence tags. Applied microbiology and biotechnology, 65(1), 74-83.