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RESUMEN
Las tinciones en microbiología son las primeras
herramientas que se utilizan en el laboratorio para el
diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde ABSTRACT
hace más de un siglo han ayudado a resolver Stains in microbiology lab are the first tools employed
problemas de etiología microbiana. Hay una gran for diagnosis of infectious diseases. Stains have helped
variedad de tinciones, que se han ido desarrollando to identify the ethiology of microbial involvement for
para la detección de los diferentes agentes infecciosos more than a century. As the wide spectrum of stains is
en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La currently in progress for the detection of bacteria,
tinción de Gram se considera básica en la valoración fungus and parasites, such fundamentals as the Gram
inicial de muestras para análisis bacteriológico, stain are still considered basic for initial evaluation of
mientras que la tinción de Wright se ocupa para el bacteriological samples, while the Wright stain is used
diagnóstico de enfermedades muy particulares en el for very particular diseases as those related to
rubro de la parasitología. Hay técnicas tintoriales parasites. Other specific tintorial methods as the Ziehl-
específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl- Neelsen stain are used for diagnosis of chronic diseases
Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de such as tuberculosis oractinomycosis. The lactophenol
enfermedades crónicas como la tuberculosis o la blue stain is best employed for diagnosis of fungal
actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que infections, as it helps to identify fungi and to preserve
preserva e identifica a los componentes estructurales de their morphological structures. Different stains in the
los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio clinical microbiological lab are permanent basic tools
microbiológico tienen una utilidad fundamental para el for the diagnosis and treatment of many diseases of
diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples infectious ethiology
patologías de etiología infecciosa.
I. INTRODUCCIÓN
En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante información para la
identificación temprana y definitiva de los microorganismos.
En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se define como la
capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto para que se
puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución de un objetivo es el responsable de la
calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz
utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado. El máximo poder de resolución en un microscopio de
luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere de una amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder
de resolución del ojo humano es de aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los microscopios,
se han desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los microorganismos. Existe
una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiología.
TINCIONES ESTRUCTURALES
Mientras las tinciones diferenciales permiten distinguir entre distintos tipos de microorganismos, las tinciones
estructurales incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se
incluyen las endosporas, los flagelos y las cápsulas.
Tinción de Gram
La técnica de la tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Christian Gram en 1884. Esta tinción
clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas.
La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste:
Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta, que tiñe de violeta.
Se añade el mordiente, iodo.
Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol.
En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el
colorante.
Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas, previamente
decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.
El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las
diferencias existentes en sus superficies externas. Las células Gram negativas poseen una capa de peptidoglicano
delgada y una membrana externa.
Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicano v carecen de membrana externa.
La tinción de Gram es extraordinariamente útil en clínica. Esta técnica es, casi siempre, la primera prueba que se
lleva a cabo en la identificación de un microorganismo causante de una enfermedad, aislado de un paciente. Con
sólo un microscopio y unos cuantos botes de colorante podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram
negativo, su morfología celular y su agrupación típica. Esto, a veces, es suficiente para determinar con qué tipo de
bacteria estamos trabajando. Es más, el tratamiento de una infección depende de que el agente sea Gram positivo
o Gram negativo, ya que algunos antibióticos actúan sólo sobre los primeros, y otros sobre los segundos. La
penicilina, por ejemplo, es más efectiva contra bacterias Gram positivas; mientras que la estreptomicina y la
tetraciclina actúan sobre ambas.
TINCIÓN NEGATIVA
Algunas bacterias están rodeadas por una estructura protectora denominada cápsula. Para poner de manifiesto
la presencia de una cápsula se utiliza una técnica denominada tinción negativa:
Se hace una preparación en fresco del espécimen.
Se añade tinta china. Las partículas de carbón de la tinta no pueden penetrar en la cápsula, de manera
que solo se ennegrece el fondo.
Al microscopio, se observan las células y sus capsulas, como zonas claras alrededor de las mismas.
Se puede aplicar un colorante para hacer las células más visibles (los colorantes habituales no tiñen las
cápsulas). También se puede usar nigrosina, en lugar de tinta china.
(a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacillus cereus es una
bacteria esporulada. Las endosporas mantienen la tinción primaria verde, mientras que las
otras células se observan teñidas con la coloración de contraste rosa. (b) La tinción de Leifson
revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificación como
Spirillum volutans..(c) La tinción negativa con tinta china permite observar que esta bacteria
posee cápsula, lo que facilita su identificación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de
la neumonía.
MATERIALES Y METODOS
PROCEDIMIENTO
RESULTADOS
A) MÉTODO DE LEIFSON, Los flagelos teñidos se visualizan de colores oscuros, rojo a negro-azulado.
B) MÉTODO HISS, Las células del fondo aparecen teñidos en color azul oscuro mientras que la capsula
aparece de color azul pálido.
C) MÉTODO DE WIRTS CONKLIN, Las esporas se observan verdes, mientras que las formas vegetativas se
ven de color rojo:
BIBLIOGRAFIA
1. Díaz R Gamazo C y López Goñi I. 1999. Manual práctico de microbiología. Edición Masson
2. Jenkins, D., Richard, M. y Daigger, G. (1993). Manual on the causes and control of activated sludge bulking
and foaming. 2ª Edición. Lewis Publishers. Michigan.
3. Feimbrook ME, Wang WLL, Campbell G. Staining bacterial flagella easily. . J. Clin. Microbiol. 1989.
4. Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. 2007. Introducción a la Microbiología, 9ª Ed. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
5. Gamazo, C.; López-Goñi, I. y R. Díaz. 2005. Manual práctico de microbiología. Masson. Barcelona.
CUESTIONARIO
a) Monótrica:
Pseudomona aeroginosa
Vibrio comma
b) Lofótrica
Pseudomonas fluoresces
Spirillus
c) Perítricas
E. coli
Proteus vulgaris
Salmonella typhasa
Clostridium parabotulinum
3. Mencione 4 coloraciones que permitan visualizar flagelos y describa el procedimiento de
cada una de ellas y como se observó dicha estructura:
TINCIÓN DE LEIFSON:
Utilizando un cultivo joven en un medio de agar adecuado, preparar una ligera suspensión
bacteriana en agua
Coloque una gota de la suspensión bacteriana sobre una lámina porta objeto limpia
Deje pasar a temperatura ambiente o pasando por una llama suavemente para obtener la
fijación del frotis con la finalidad que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción
Colorear durante 15 minutos, permitiendo que se forme un precipitado al evaporarse el alcohol.
El tiempo es menor si el colorante es fresco.
Cuando se forma un precipitado, enjuague el porta objeto con agua destilada, escurrir el exceso
de agua y dejar secar al aire seco.
Obtener al microscopio con lente de inmersión (100x) y con aceite de inmersión.
MÉTODO DE GRAY
Utiliza un mordiente cubre la superficie del flagelo aumentando aparentemente su grosor y a su vez
proporciona una copa de material teñible para captar el colorante de golpe.
Método
Pasar el portaobjeto 3 o 4 veces sobre la flama del mechero.
Preparar una suspensión de la bacteria en agua esteril.
Sobre el portaobjeto flameado y frio colocar 5 gotas de la suspensión.
Deja secar la preparación al aire, no calentar.
Cubrir con el mordiente durante 10 minutos
Cubrir una solución carbol-fucsina durante 5 minutos
Lavar con agua. Dejar secar al aire
Observar a los flagelos de color rojo
TEORÍA KODOKA
Se agrega una gota de colorante en el borde del cubreobjetos y se dejó reposar por 10 minutos a
temperatura ambiente el colorante entrara en la preparación y teñirá los flagelos
TINCIÓN DE NOLAND
Solución I: 20 mg de cristal violeta + 80 mg de fenol + 20 ml de formaldehido al 40
% + 4 ml de glicerol.
Procedimiento:
Mexclar una gota de solución I con una gota de muestra en el portaobjetos.
Colocar un portaobejtos y observar a 100x bajo aceite de inmersión y campo claro.
Resultados
Los flagelos aparecen teñidos de color azul
Esta tinción permite determinar el número y la disposición de los flagelos de las bacterias, que constituyen
una información esencial para la identificación de muchas especies y fundamentalmente en el caso de
bacteria móviles.
Capsula bacteriana
Compuesta de polisacáridos, polialcoholes y amino azúcares
Resistencia a la desecación
Resistencia al ataque de las células fagocitas y anticuerpos
Fijación a células hospedadoras
Glucocalix
Ayuda a proteger las bacterias contra los fagocitos fija el agua evitando que la células se seque
Compuesta de glucoproteinas y proteoglicanos
METODO HISS
Tome una lámina porta objeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis.
Debe realizarse un frotis espeso a partir de una suspensión de los gérmenes en suero sanguíneo
diluido en 1/3en suero fisiológico.
Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación
del frotis.
Cubrir la preparación con solución de cristal violeta y se calienta a vapor fuerte durante 1
minuto.
Lavar con solución de sulfato de cobre.
Secar al aire a temperatura ambiente.
Observar al microscopio con lente de inmersión (100x) y con aceite de intención.
METODO DE DUGUID
Poner con el asa una gota pequeña de tinta china en el centro de un portaobjetos limpio.
Poner una gota de agua del mismo tamaño junto a la gota de tinta china
Tomar con el Asa bacteriológica un pequeño fragmento del cultivo de bacterias
Hacer una suspensión ( sin extenderla) en la gota de agua
Mezclarla con la tinta china
Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión, evitando que queden burbujas
Observar la preparación al microscopio con el objetivo seco fuerte y de inmersión.
La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria en un campo oscuro
La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria de color rojo en un
campo de azul oscuro.
Las esporas son unidades de dispersión de los hongos, musgos y algunas plantas, su función primaria es
asegurar la supervivencia en tiempos de tensión ambiental.
12. Mencione 2 coloraciones que permiten visualizar esporas y en que consiste cada una
de ellas:
Es un colorante débilmente básica, y por tanto, se une débilmente a las bacteria, se penetre en las células
vegetativas, cuando se calienta la preparación también penetra las endosporas.
CARBOL FUSCINA
13. ¿Cuáles son las estructuras de verde de malaquita que aparecen en el medio circundante?
Son endosporas bacterianas a las esporas, para carecer de paredes celulares no se tiñen colorante
regulares y son teñidos con verde de malaquita.
14. ¿Todas las endosporas aparecen igual en las bacterias de la misma especie? ¿A qué se debe estas
diferencias?
No aparecen iguales, ya que la posición de las esporas diferencia entre especies de bacterias y es útil
en la identificación, las endosporas son difíciles de observar al microscopio debido a la impermeabilidad
de su pared, que evita la entrada de colorantes.
A los polisacáridos, lípidos, polifosfatos y azufre, esto sucede cuando las sustancias de partida se
encuentra en el medio pero el crecimiento está limitada por la falta de nutrientes de terminado o por la
presencia de inhibidores.
Se encuentra de forma de gránulos constituidos en su mayor parte por polifosfatos tipo sal de Graham.
Spirillum volutans
17. Mencione 2 colorantes que permitan observar los corpúsculos metacromáticos y en que consiste
cada uno de ellos:
a) Coloración de loffer: azul de metileno en Loffer para tinción de bacteria AAR, como bacilos de
tuberculosis.
b) Coloración de Albert: la tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes
celulares tinción puede ser uniforme.
18. Mencione 3 tipos de inclusiones y que función cumple cada uno de ellos: