FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA

LICENCIATURA EN QUÍMICO
FARMACÉUTICO BIÓLOGO

LABORATORIO DE
INMUNOLOGIA APLICADA
PRÁCTICA 1
PRUEBA DE ELISA

EQUIPO #7
DANIEL JASSO VILLALOBOS

PROFERSOR: M. EN D.U. MANUEL CARRERA

CAMARGO

FECHA DE ENTREGA: 03-04-17

INTRODUCCIÓN.

Esta técnica, también se conoce como ensayo de ELISA (Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay). La identificación de los complejos Ag-Ac, se hace
mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antígeno, o bien unidas al
anticuerpo. El ensayo de ELISA puede ser directo o no competitivo, constando
de los siguientes pasos:

 Se tapiza la placa con el anticuerpo específico frente al antígeno a

determinar.
 Se añade la muestra con el antígeno.
 Se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que en
presencia de su sustrato da un producto coloreado soluble, este
producto es cuantificado mediante el lector de ELISA, e indirecto o
competitivo, se diferencia del caso anterior en que se añaden los
anticuerpos, previamente incubados con la muestra, los anticuerpos que
no se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos
de los pocillos. Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la
galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta técnica se utiliza para la
medida de hormonas, antígenos de la hepatitis y otras muchas
sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones. Una
variante de esta técnica de gran utilidad se conoce como ensayo en fase
sólida y está orientada a la determinación de anticuerpos frente a un
determinado antígeno. Para ello el antígeno se encuentra fijo a un
soporte (por ejemplo tubo de plástico). Al añadir la muestra con el
posible anticuerpo se unirá y podrá ser detectado añadiendo anti-
inmunoglobulinas marcadas con el enzima. (Calderon, R. 2007).

Fig.1. . Principio básico de la técnica de ELISA indirecto o competitivo y directo o no

competitivo
Otra variante de las aplicaciones inmunoenzimáticas es cuando el antígeno se
encuentra fijo en células o tejidos. Al igual que hemos visto en el apartado de
inmunofluorescencia indirecta, en este caso también se emplean dos
anticuerpos. El primero, con actividad frente a los antígenos a estudiar, y el
segundo, que va dirigido frente al primero y que actúa de puente con el
complejo portador de la enzima. Cuando la enzima es la peroxidasa, este
complejo suele ser una peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).

La diferencia principal entre las técnicas de RIA y ELISA es que la primera

utiliza como marcador un isótopo y la segunda la actividad de un enzima, así el
RIA directo y el ELISA competitivo serían equivalentes, y también existiría
ELISA de inhibición y ELISA en sándwich.

El ensayo ELISA tipo sándwich es un ensayo de captura de antígeno y

detección mediante inmunocomplejos. Se trata de un ensayo muy empleado en
el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de
lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se
encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el
primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no
retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno
marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unido a un anticuerpo en
la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este
ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de
señal que permite el segundo anticuerpo. (Fernández, N. 2007).

Fig.2. Técnica de peroxidasa aplicada a tejidos

Existen inmunoensayos que se denominan homogéneos en los cuales no es

necesario la separación de necesario la separación de los inmunocomplejos de
los reactivos libres. Son técnicas muchas de ellas patentadas por diferentes
firmas comerciales. En la tabla 6 se recogen los marcadores enzimáticos más
comúnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para
su revelado y el modo de prepararlos. (Fernández, N. 2007).
OBJETIVOS.

 Ver como la prueba de ELISA es un enzimoinmunoanálisis, así como su

fundamentó y ver qué ventajas nos ofrece a comparación de otros
métodos.
 Realizar una ELISA utilizando IgG de humano.

MATERIALES Y METODOS.

1. Se colocó 10 ul en cinco pocillos de Ag y en otro pocillo el cual será el

blanco. Su concentración del Ag es de 10mg/dl de IgG humano.
2. Posteriormente se taparon los pocillos con plástico y se pusieron en la
estufa a 37°C.
3. Se lavó con agua destilada.
4. Después de añadió 100ui en cada pozo leche descremada al 5% mas
PBS y se incubó durante una hora.
5. Se retiró la leche y se llevaron a cabo tres lavados con PBS tween 20 al
0.1% y se enjuago con PBS solo.
6. Se colocó el primer Ac.
7. Después se cubrió la placa con papel aluminio.
8. Posteriormente se lavó de nuevo con PBS tween 20 al 0,1% y de nuevo
se enjuagó con PBS solo.
9. Se realizaron tres diluciones y se añadió en el primer pozo 200ul del
segundo Ac, el cual tiene una concentración de 4975.7ul/dl, después de
esos 200ul se agregaron 100ul y se colocan en el segundo pozo y así
sucesivamente, todos los pozos llevaron 100ul de PBS/leche.
10. Se lavó de nuevo con PBS tween 20 al 0,1% y de nuevo se enjuagó con
PBS solo.
11. Se colocó por pozo 100ul del segundo Ac.
12. Se dejó incubar a 37°C durante una hora.
13. Nuevamente se lavó con PBS tween 20 al 0,1% y de nuevo se enjuagó
con PBS solo.
14. Después se reveló con 100ul de la solución de OPD.
15. Al obtener la coloración deseada se detuvo la reacción con ácido
sulfúrico 2.5N.
16. Finalmente se leyó a 492 nm de longitud de onda.
RESULTADOS.

Tabla 1. Concentraciones utilizadas de antígeno (albúmina)

Concentración inicial de albúmina: (1g/ml)

Volumen de alícuota/volumen total Concentración (g/mL)

3 ml/10ml 0.3g/ml

1.5ml/10ml 0.15g/ml

0.75ml/10ml 0.075g/ml

0.38ml/10ml 0.038g/ml

Tabla.2. Resultados obtenidos al leer la placa de ELISA a una longitud

de onda 492.

1 2 3 4 5
A 0.101 0.098 0.102 0.094 0.101
B 0.139 0.093 0.089 0.105 0.100
C 0.113 0.102 0.098 0.085 0.106
D 0.111 0.092 0.084 0.100 0.087
E 0.114 0.090 0.102 0.072 0.081
F 0.114 0.217 0.080 0.093 0.084
G 0.114 0.101 0.093 0.092 0.083
H 0.092 0.082 0.076 0.087 0.077

ANÁLISIS DE REUSLTADOS.

Para realizar la prueba de ELISA con todos los integrantes del salón de clases
fue necesario dividir la placa para que cada integrante fuese responsable del
llenado de 4 pozos de la placa, así aparte de realizar la prueba se evaluó el
buen manejo por parte de los integrantes del salón de las micropipetas.

A pesar de que la prueba de ELISA salió bien los resultados obtenidos no

fueron los adecuados debido a que el manejo de las micropipetas dentro del
grupo no es el adecuado, esto se debe a varios factores desde el no saber
cómo tomar la micropipeta hasta como realizar la toma de la muestra.

Se supo que la prueba de ELISA salió bien ya que a pesar de que el color no
se logró observar de inmediato después de

Los valores esperados en la absorbancia al tener un volumen de 100ul eran de

100 (+/-) 2 lo cual nos diría que el llenado de los pozos fue el adecuado, sin
embargo en los valores obtenidos el intervalo fue mayor, esto nos indicó no se
realizó adecuadamente el llenado de los pozos.
CONCLUSIÓN

Gracias a que se realizó la prueba ELISA se pudo comprobar la cantidad de Ag

que se colocó en la placa mediante anticuerpos marcados con una
enzimáticamente.

Al tener el Ac marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte

(inmunoadsorbente) se llevó a cabo una reacción antígeno-anticuerpo la cual
quedó inmovilizada, por tanto fue fácilmente revelada mediante la adición de
un substrato especifico, que al actuar la enzima produjo un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un
colorímetro.

REFERENCIAS.

 Calderón, R. (2007). Técnica de Enzimoinmunoensayo. Abril 2017, de

UNAM Sitio web:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
 Fernández, N. (2007). ELISA. Abril 2017, de Universidad de la República
Uruguay Sitio web:
http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf