FACULTAD DE INGENIERÍAS Y ARQUITECTURA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS EN EL SUELO

CURSO : MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

PROFESOR : Mg JOYO ZAGA, Gilmer

ALUMNO : QUISPE QUISPE GUILLERMO

CICLO :V

AYACUCHO – PERÚ
2016
 INTRODUCCIÓN

La inadecuada disposición final de los residuos sólidos, aguas contaminadas, etc por parte
de los vecinos y otras personas que sin tener conciencia ambiental desechan sus residuos
al río chaqui huaycco en donde se contaminan el agua y sus suelos quedando
contaminados, creando un foco contaminando hacia la atmosfera y a ellos mismos que se
están haciéndose daño. Los lodos contaminados en la rivera del rio con residuos
domésticos, comerciales. Desmontes animales muerto, aguas servidas, heces fecales y la
presencia de microorganismos que muy aparte de existir de forma normal, hay
microorganismos producto de la contaminación.

El aislamiento de microorganismosn de la muestra se lleva a una experimentación

 OBJETIVOS

 A prender a tomar muestras de microorganismos.

 Adiestrarse en técnicas de aislamiento y purificación de microorganismos comunes
en el agua
 Aplicar técnicas de aislamiento para la localización de microorganismos concretos
en muestras contaminadas.
 Aplicar las técnicas del agotamiento y las estrías escocesas como las más
habituales en aislamiento de microorganismos cultivables.
 FUNDAMENTO TEORICO

MICROORGANISMOS DEL AGUA

 BACTERIAS

Aunque son numerosas, debido a su pequeño tamaño, sólo representan menos de la mitad
de la biomasa microbiana total.

Las bacterias son microorganismo unicelulares que presentan un tamaño de unos pocos
micrómetros (entre 0,5 y 5 um, por lo general) y diversas formas incluyendo esferas (cocos),
barras (bacilos) y hélices (espirilos). Las bacterias son Procariotas y, por lo tanto, a
diferencia de las C. Eucariotas (de animales, plantas , hongos, etc.), no tienen el núcleo
definido ni presentan, en general, organúlos membranosos internos

Protozoos

Entre las características comunes a todos los protozoos podemos citar: que son unicelulares,
microscópicos, eucariotas, se mueven gracias a ciertos órganos de tipo permanente, como los
flagelos y los cilios; y otros órganos, que son transitorios llamados seudópodos,
teniendo importancia la temperatura como estimulante de la locomoción.
Habitan en el agua, la tierra o dentro de otros seres vivos, como ya mencionamos, en el caso
de los parásitos. Al contacto con materia sólida, reaccionan, desplazándose. Si bien las
células, tienen cada una funciones no diferenciadas sino que realizan todas las funciones
necesarias, pueden formar grupos, pero jamás llegan a conformar tejidos. Se reproducen en
forma asexuada usando la bipartición, o tienen reproducción sexual

Podemos diferenciar dentro de los protozoos, a:

1. Los flagelados, algunos con nutrición holofítica, si tienen clorofila y pueden realizar
la fotosíntesis, como la Chrysamoeba radians o la Cryptomonas ovata, y otros con nutrición
holozoica, si carecen de clorofila, y toman en forma directa la materia orgánica, como por
ejemplo, las Trichomonas.
2. Los rizópodos, sin flagelos, que comprende a los ameboideos, las tecamebas y los
foraminíferos. Emiten seudópodos y se diferencian dos capas en su protoplasma: el
ectoplasma y el endoplasma.
3. Radiolarios: Están constituidos por el plancton marino y no poseen caparazón, presentando
seudópodos finos y radiantes.
4. Acantarios: Son marinos y en general planctónicos con reproducción sexual.
5. Heliozoos: Habitan en las aguas dulces con seudópodos radiantes.
6. Esporozoos: Son parásitos de otros protozoos, con reproducción sexual.
7. Cnidosporidios: Son organismos parasitarios que inician su existencia con forma de ameba
y luego toman la representación de una espora con pared pluricelular.
8. Cilióforos: Pobladores de aguas dulces, con cilios vibrátiles.

Helmintos

Este término, no corresponde a una clasificación biológica, porque en realidad reune dos
grupos muy distintos de organismos metazoos con diferencias biológicas profundas. Los
helmintos son un grupo de gusanos que la unica característica que comparten, a parte de
ser gusanos y ser invertebrados, es que son parásitos del hombre. A pesar de esto,
podemos generalizar que los adultos son macroscópicos, alargados y presentan simetría
bilateral, no poseen extremidades y afectan a miles de millones de humanos. Los tamaños
de estos parásitos puede oscilar entre milimetros y metros, dependiendo de la especie.

Los helmintos se subdividen en dos grupos a saber:

1-Platyhelmintes o gusanos planos (platelmintos)

2-Nematyhelmintes o gusanos redondos (nematodos).

Dentro de las muchas diferencias que presentan estos dos grupos podemos resaltar:

- Los nematodos son organismos evolutivamente mas "modernos" y presentan estructuras

corporales mas avanzados, por ejemplo, presentan un sistema digestivo completo con boca
y ano y organos internos aislados en un seudoceloma, a diferencia de los platelmintos que
no poseen ninguna de estas estructuras. En el caso de los cestodos, una clase de
platelmintos, estos absorben directamente los nutrientes por su cubierta externa.

- Los nematodos estan cubiertos de una capa externa gruesa y protectora, similar en función
a la epidermis humana, que se denomina cutícula.Los platelmintos por su parte, no poseen
esta protección y tienen una capa mucho menos resistente (tegumento) que esta
especializada en el intercambio de sustancias con el medio externo.

- La reproducción es otra de las grandes diferencias en estos dos grupos, mientras que el
dimorfismo sexual es imperativo en todos los nematodos, en el caso de los platelmintos lo
común es el hermafroditismo.

Virus

Los virus son parisitos intracelulares obligados que solo son capaces de multiplicarse dentro
de la celula huesped. Los virus entericos son aquellos que se multiplican en el conducto
intestinal, expulsandose en los excrementos de la persona infectada.

Los virus entericos humanos mas importantes son:

 los enterovirus ( polio, echo y Coxsackie), los rotavirus, los reovirus, los parvovirus, los
adenovirus y los virus de la hepatitis A. El virus causante de la hepatitis A es el declarado
con mas frecuencia como transmisible a traves del agua contaminada. El unico huesped
que se ha encontrado parar el virus de la hepatitis A es la persona humana. Incluso varios
investigadores han detectado la presencia del virus en aguassubterraneas. A pesar de todo
parece ser que el agua juega un papel muy secundario en la transmision de enfermedades
virales, lo que no quiere decir que se deba subestimar este papel. En principio cualquier
virus excretado y capaz de producir infeccion a travas de su ingestion, puede ser transmitido
mediante un tratamiento inadecuado del agua residual.

Microorganismo Concentracion, numero/ ml.

Coliformes 0.5-1.0 x 1000000

Estreptococus fecales 5-20 x 1000

Shigella Presencia

Salmonella 4-12

Pseudomonas aeruginosa 102

Clostridium perfringens 507

Mycobacterium tuberculosis Presencia

Quistes de protozoos 100

Huevos de helminto 1

Virus entericos 1-492

 ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO

Para estudiar la ocurrencia y desarrollo de los microorganismos en el suelo se puede

recurrir a diferentes métodos. Algunos de los cuales detallaremos a continuación.

Observación microscópica directa.

Forma y ordenamiento de los microorganismos “in situ”

Este tipo de estudios permite establecer la distribución de los microorganismos en relación

con los agregados de suelo, partículas de materia orgánica, raíces de las plantas.

Uno de los métodos más antiguos consiste en la introducción de un portaobjeto en la tierra

y su posterior observación, previa tinción con colorantes adecuados (ácidos, anticuerpos
fluorescentes).

Se han empleado también cortes finos de suelo para alcanzar este objetivo.

Recuento de microorganismos del suelo

Para ello se preparan suspensiones de suelo. Una cantidad determinada de la suspensión

se distribuye en una superficie conocida de un portaobjeto. Luego de coloreado se observa
y recuenta al microscopio. Se puede calcular la cantidad de microorganismos por gramo de
suelo. (Si se realizan las mediciones necesarias se puede calcular el bio volumen y con la
densidad media de los microorganismos establecer la biomasa microbiana estimada).

Actividad biológica del suelo

Las actividades de los microorganismos que se miden son metabólicas y enzimáticas.

Actividad metabólica

La actividad metabólica que se ha medido con más frecuencia es la actividad respiratoria,

la cual puede estimarse a través del consumo de O2 o la producción de

CO2. La medición más frecuente es la de producción de CO2 a través de su absorción en

álcali y posterior titulación. Cabe destacar que al medir CO2 se incluye la actividad
microbiana de fermentación y la estimación se disminuye por acción de los organismos
autótrofos. (En condiciones normales de aerobios tanto la actividad autotrófica como la de
fermentación se consideran despreciables frente a la respiración).

Actividad enzimática

La evaluación de las actividades enzimáticas en el suelo ha sido muy diversa dependiendo

del objetivo del estudio. Existen numerosos trabajos en los que se ha medido: actividad
sacarolítica, amilolítica, lipolítica, celulolítica, lignolítica, etc. Otras enzimas que pueden
cuantificarse son la ureasa, proteasa, fosfatasa, deshidrogenasa.
La cuantificación de esta última enzima es una medida indirecta de la actividad respiratoria
de un suelo.

Actividades degradativas

En algunos estudios se pretende evaluar la velocidad de degradación de un determinado

sustrato. Para ello se suele agregar el sustrato y se mide la aparición del producto. En otros
casos se mide la velocidad de aparición de los productos a partir de la degradación de la
materia orgánica del suelo (ej: mineralización de compuestos orgánicos nitrogenados que
son degradados y entre los productos finales se encuentran el NH4+y NO3- , que se pueden
medir)

Recuento microbiano mediante su cultivo

Recuento poblacional

Micro flora Total es una técnica que en los estudios microbiológicos de suelo tuvo mucha
difusión. La misma consiste en realizar recuento de viables en suspensiones de suelo sobre
un medio general para que desarrolle la mayor cantidad de microorganismos presentes.
Los medios más frecuentemente utilizados son: Agar

Extracto de Levadura Glucosado y Agar Extracto de Suelo. Estos medios son los que dan
los mejores recuentos. Aun utilizando estos medios nunca se logra recontar la totalidad de
los microorganismos presentes. Solo se puede estimar entre un 1 a un 10% de lo obtenido
en recuento microscópico directo. Las algas, los quimo autótrofos y muchos otros no
desarrollan. A su vez desarrollan pocos hongos ya que estos son inhibidos por el desarrollo
bacteriano. Para realizar un recuento de hongos se utiliza un medio selectivo para ellos
como es el Agar Rosa de Bengala Estreptomicina.

Recuento de Grupos funcionales

Se define a los Grupos funcionales o fisiológicos del suelo como grupos de

microorganismos que en el suelo cumplen una determinada función. Por ejemplo el grupo
de celulíticos incluye microorganismos que no están emparentados taxonómicamente pero
tienen en común su capacidad de degradación de la celulosa.

Para su determinación se emplean medios selectivos. A menudo se usan medios que usan
sílice gel como solidificaste, el que se impregna de los nutrientes necesarios para el grupo
funcional que se desea hacer desarrollar.

Hay ciertos grupos fisiológicos que no se desarrollan formando colonias visibles sobre un
medio sólido. Para estos se utilizan los recuentos por NMP (Número Más Probable) en
medios líquidos y su determinación se realiza por agregado de un reactivo.
Estimación de biomasa microbiana

Biomasa microbiana por Fumigación-incubación una de las determinaciones que en los

últimos años ha tenido gran difusión en la investigación relacionada a la población
microbiana global de un suelo es la de Biomasa Microbiana. Esta consiste en aplicar la
acción de un fumigante (cloroformo) a una porción de suelo y luego re inocularlo; finalmente
se mide la cantidad de CO2 que se produce a partir de la muestra. La masa microbiana se
estima por la relación que existe entre el CO2 producido en las muestras fumigadas y en
otras que no se le aplica fumigación. En las muestras fumigadas hay una extra
mineralización de la materia orgánica provocada por la descomposición de los
microorganismos muertos por acción del fumigante.

Como aditamento de esta técnica se puede estimar la porción de N y P contenido en la

masa de microorganismos Medición de ATP

El empleo de la medición de ATP como estimador de la masa microbiana se fundamenta

en que este compuesto está relacionado a células vivas, ya que cuando se libera al suelo
es degradado muy rápidamente. Para estimarlo se realiza una separación de los
componentes sólidos del suelo y se combina con una enzima que en presencia de ATP
emite luz. La intensidad de la luz emitida es medida en un luminímetro. (Cuanto mayor luz
es emitida hay más cantidad de ATP y por lo tanto mayor masa microbiana).

Respiración inducida por incorporación de sustrato

Esta metodología consiste en medir la cantidad de CO2 producido por la respiración en una
muestra de suelo inmediatamente después de la incorporación de un sustrato fácilmente
descomponible (generalmente se emplea la glucosa). Generalmente se realiza la medición
dentro de las tres horas posteriores a la incorporación del sustrato.

Agar nutritivo simple

El agar nutritivo simple está hecho de caldo de carne, peptona, agua, agar y posiblemente
sal. El pH se ajusta al 7,0 y es filtrado o pasado por el autoclave para esterilizarlo. Este agar
nutritivo simple puede servir para que crezcan la mayoría de tipos debacteria y es
especialmente útil si no estás seguro de qué tipo de bacterias buscas.
Agar LB
El agar LB no hace crecer preferentemente un tipo de bacteria sobre otra. Tiene muchas
variaciones diferentes, aunque casi todas contienen extracto de levadura, que
proporcionan vitaminas y restos de elementos, péptidos y peptonas de caseína
proporcionadas por triptona y sal. El "LB" en el nombre se suele identificar como una
referencia al inventor, Giuseppe Bertani, pero se ha establecido que las iniciales son de
"Caldo de Lisogenia"

Agar de sangre
El agar de sangre es creado añadiendo sangre animal a la solución de agar, y para algunos
tipos (como el agar de chocolate), la mezcla es tratada más para fomentar cierto tipo de
crecimiento bacteriano. Recuerda a la sangre fresca o seca y se usa para cultivar una
variedad de microbios. Es útil porque la mayoría de organismos crecerán en sangre, pero
también porque puede ayudar a determinar cómo interaccionan estos organismos con el
cuerpo.
Agar de medio selectivo
El agar de medio selectivo es diseñado para fomentar el crecimiento de un tipo de
organismo y desalentar a otro. Por ejemplo, los agares de crecimiento fúngico son
especialmente ácidos para desalentar el crecimiento bacteriano pero permiten a los
organismos fúngicos florecer. Por otra parte, algunos agares están impregnados con
antibióticos que permiten que las bacterias resistentes a ellos crezcan, mientras excluyen a
otros organismos.

Agares diferenciales
Los agares diferenciales contienen compuestos que cambian de color cuando se exponen a
los productos de desecho de un tipo de organismo, o cambian el color del organismo
mientras crece. El agar MacConkey contiene un indicador de pH que pone las colonias de E.
coli rojas. El agar de sal de manitol se vuelve amarillo cuando un organismo puede
fermentar el manitol que contiene y bajar el pH.

MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL SUELO

Clostridium botulinum
C. botulinum es una bacteria gram-positiva (es decir, una bacteria que da positivo en la
prueba de tinción de Gram) que forma esporas resistentes y duraderas. Cuando las esporas
encuentran las condiciones adecuadas, germinan y comienzan a crecer. Se puede producir
una proteína letal llamada toxina botulínica, que actúa sobre el sistema nervioso en los
seres humanos y otros mamíferos para bloquear la liberación de un neurotransmisor clave
llamado acetilcolina. Las esporas de C. botulinum se encuentran en el suelo y el agua en
muchas regiones del mundo. Son anaeróbicas y sólo crecen en ausencia de oxígeno;
condiciones ácidas inhiben su crecimiento. Aunque C. botulinum causa a
veces casos mortales de una enfermedad transmitida por alimentos llamada botulismo, la
potente toxina producida por la bacteria se ha convertido también en útil para paralizar
tejido muscular en seres humanos como parte de diversos procedimientos médicos o
cosméticos. Cuando se utiliza como un agente terapéutico, la toxina botulínica es conocida
por su nombre comercial, Botox.

Erwinia carotovora
E. carotovora es un patógeno altamente destructivo que causa la enfermedad en una
amplia gama de plantas, incluyendo las patatas y la mayor parte de verduras carnosas. Esta
bacteria gram-negativa, en forma de vara puede invadir los cultivos en el campo o durante
el almacenamiento. La subespecie E. carotovora carotovora sobrevive bien en el suelo y las
aguas superficiales, que puede crecer en las zonas profundas de los cultivos no hospedantes
o incluso malas hierbas, las papas invasoras u otros cultivos vulnerables cuando la
oportunidad se ofrece. Las enfermedades comunes de la papa causada por E. carotovora
incluyen esquirol, tallo aéreo podrido, y la pudrición blanda del tubérculo.

Sarna streptomyces
La sarna Streptomyces es una bacteria gram-positiva que, junto con otras dos especies de
Streptomyces (S. acidiscabies y turgidiscabies S.) pueden infectar las papas y otros
tubérculos como la remolacha, los rábanos, los nabos, las zanahorias y los nabos. Es inusual,
ya que a medida que crece, las células forman filamentos similares a las formadas por
hongos, aunque mucho más pequeños. Los filamentos de la S. Scabies pueden después
romperse para formar esporas. Las bacterias se propagan por la invasión de los tejidos
jóvenes, frescos y entran por el tejido más viejo por medio de heridas o aberturas naturales.

Xanthomonas
El Xanthomonas es un género que incluye muchos patógenos importantes de plantas. A
pesar de que no persisten durante mucho tiempo en el suelo, algunas especies pueden
sobrevivir en el suelo durante el invierno e infectar un nuevo cultivo en el resorte. Al igual
que todas las otras proteobacterias, son gram-negativas. La especie X. campestris causa la
pudrición negra en una amplia variedad de plantas y es quizás el miembro más importante
del género. Irónicamente, la misma bacteria se cultiva comercialmente para producir goma
de xantano, un aditivo alimentario común.

ANALISIS EXPERIMENTAL

Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de

microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos,
aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne
constituyen la fuente de carbono, nitrógenoy aportan nutrientes para el desarrollo
bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es
elagente solidificante.

Puede ser suplementado con sangre ovina desfibrinada estéril para favorecer el crecimiento
de microorganismos exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara
visualización delas reacciones de hemólisis.

LUGAR DEL EXPERIMENTO

Contenido y composición

FÓRMULA

Pluripep tona.................................................................................................................. 5.0 g

Extracto de carne........................................................................................................... 3.0 g

Cloruro de sodio............................................................................................................. 8.0 g

Agar.................................................................................................................................15.0
g

Agua purificada...........................................................................................................1000 ml

pH final: 7.3 ± 0.2

 MATERIALES

 BIOLOGICAS:

Muestra(lodo del rio chaki huaycco)

 MEDIO DE CULTIVO:
 Agar nutritivo
 EQUIPOS

MICROSCOPICO

AUTOCLAVE
BALANZA

MATERIALES DE LABORATORIO

PLACAS PETRI

MATRAZ ERLENMEYER
PROBETA

GUANTES QUIRURGICOS

GUARDAPOLVO
PROCEDIMIENTO

ALGODON

PITA
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
 WEBGRAFÍA

 http://www.slideshare.net/tato762/aislamiento-de-microorganismos.

 ALEXANDER, Martín. Introducción to soil microbiology. 1980. 481 p

 BURBANO, Hernán. El suelo: una visión sobre sus componentes

biorgánicos.1989.423p.

 CIAT - UNDP. Simbiosis leguminosa - rizobio. 1988. 200p.

 GRAHAM, P. H. and HARRIS, S. C. Biological nitrogen fixation. 1982. 768 p.

 INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO. Análisis de suelos, plantas y

aguas para riego. 1984. 253 p.

 PRIMAVESI, Ana. Manejo ecológico del suelo. 1982. 499 p.

 SALAMANCA, Rafael. Suelos y fertilizantes. 1984. 343 p.

 http://www.ehowenespanol.com/tipos-agar-nutritivo-info_77051/