Progresos recientes de la investigación en L-asparaginases microbiano

Abstracto
Las L-Asparaginasas (EC 3.5.1.1) son enzimas que catalizan la hidrólisis de L-asparagina en ácido L-
aspártico y se encuentran en una variedad de organismos desde microorganismos hasta mamíferos.
Sin embargo, son principalmente expresados y producidos por microorganismos. Las L-asparaginasas
microbianas han recibido una atención sostenida debido a su papel irremplazable en la terapia de la
leucemia mielobacteriana y por su inhibición de la formación de acrilamida durante el procesamiento
de los alimentos. En este artículo, revisamos la aplicación de L-asparaginasas microbianas en
tratamientos médicos y mitigación de acrilamida. Además, describimos en detalle los avances recientes
en las fuentes existentes, la purificación, la producción, las propiedades, la modificación molecular y la
inmovilización de la L-asparaginasa.

Introducción
Las L-asparaginasas (L-asparaginaamidohidrolasa; EC 3.5.1.1), que catalizan la hidrólisis del grupo
amida de la cadena lateral de L-asparagina enparticacidandammonia (Figura 1), se distribuyen
ampliamente entre las criaturas vivas, incluidos animales, plantas y microorganismos ( Verma y otros,
2007b). Durante más de cuatro décadas, las L-asparaginasas tienen una marca de los regímenes
quimioterapéuticos multimedicamentos ampliamente utilizados para la
tratamiento de linfocitos del sistema linfoide, linfoblastomiasis infantil, linfoma de Hodgkin, linfosarcoma
y melanosarcoma (Stecher et al., 1999; Duval et al., 2002). Además, las L-asparaginasas se han usado
como un biosensor diagnóstico para L-asparagina debido a la gran cantidad de amoníaco producido
por la reacción enzimática y su correlación directa con el nivel de L-asparagina en la sangre de un
paciente (Verma et al., 2007a). . Además de su uso clínico, las lasparaginasas también se han
caracterizado con éxito como inhibidores de la formación de acrilamida en alimentos calentados
(Kornbrust et al., 2009); la acrilamida está clasificada como probable carcinógeno humano por la
Agencia Internacional para la Investigación del cáncer (IARC1994), lo que sugiere que las L-
asparaginasas tienen un gran potencial para su uso en la industria alimentaria. Aunque la L-
asparaginasa ha sido revisada por Savitri y Azmi (2003) y Verma et al. (2007b), aquí nos enfocamos
en el avance reciente en aspectos tales como las fuentes, purificación y caracterización de la L-
asparaginasa y su aplicación en las industrias farmacéutica y alimentaria. La producción de L-
asparaginasa por fermentación así como su modificación e inmovilización también se revisan en este
documento.

Aplicación de L-asparaginasa microbiana

Aplicación farmacéutica

Las L-asparaginasas son una piedra angular de los protocolos de tratamiento para la leucemia
linfoblástica aguda (L2LA) infantil y se usan para el tratamiento de intensificación e inducción de la
remisión en todos los regímenes pediátricos y en la mayoría de los protocolos de tratamiento para
adultos. Hay tres preparaciones principales de L-asparaginasa en la actualidad; estos incluyen la L-
asparaginasa nativa de Escherichia coli (asparaginasa de E. coli), una forma PEGilada (PEG:
polietilenglicol) de L-asparaginasa (PEG-asparaginasa) y Lasparaginasa derivada de Erwinia
chrysanthemi (Erwinia asparaginasa) (Pieters et al. . 2011). La asparaginasa de E. coli o PEG-
asparaginasa se usa como tratamiento de primera línea de la LLA infantil en los protocolos de
tratamiento actuales. Típicamente, los pacientes que muestran sensibilidad a una formulación de L-
asparaginasa se cambian a un grado suficiente para recibir el tratamiento más eficaz. Erwinia
asparaginasa ha sido adoptada en protocolos europeos y estadounidenses para tratamientos de
segunda o tercera línea. Además de los tres fármacos mencionados anteriormente, una nueva
preparación recombinante de asparaginasa de E. coli se está sometiendo actualmente a evaluación
clínica. Los datos originales muestran que esta enzima recombinante tiene un perfil de eficacia y
toxicidad similar a la asparaginasa de E. coli nativa. Recientemente se ha propuesto que una L-
asparaginasa encapsulada en glóbulos rojos homólogos es un tratamiento apropiado para mantener la
actividad enzimática, al tiempo que reduce la formación de anticuerpos contra la asparaginasa (Agrawal
et al., 2013). Además, una forma PEGilada de Erwinia asparaginasa recombinante se encuentra en
estudio preclínico (Allas et al., 2009). A diferencia de las células normales que pueden sintetizar L-
asparagina mediante Lasparagine sintetasa, las células tumorales requieren abundante L-asparagina
exógena para garantizar un crecimiento rápido (Verma et al., 2007b). Por lo tanto, la presencia de L-
asparaginasa puede producir células tumorales linfáticas de este aminoácido esencial, causando la
muerte (Fig.2). Los efectos de la mayoría de las L-asparaginasas se asocian con sus actividades de L-
glutaminasa, causando una ingesta prolongada de L-glutamina de bajo nivel por las células normales
del hígado y el páncreas, lo que conduce a elevaciones de enzimas hepáticas y pancreatitis (Patil et al.
. 2011). Según Aselinenal. (1989), E. coliasparaginase causa más anormalidades de la coagulación y
produce un mejor antiefecto de la leucemia que la asparaginasa Erwinia debido a su capacidad más
efectiva y sostenida de reducir la L-asparagina.

Purificación y caracterización de L-asparaginasa microbiana

Ocurrencia en microorganismos

Las L-asparaginasas se distribuyen extensamente en los tres dominios de la vida, desde

microorganismos (bacterias, mohos, levaduras, actinomicetos y algas) hasta organismos superiores
(plantas, vertebrados y otros tejidos). La L-asparaginasa desempeña un papel crítico en el metabolismo
de aminoácidos al hidrolizar L-asparagina al ácido laspártico, que puede transformarse en oxalacetato,
que puede entrar en el ciclo de Kreb (Savitri y Azmi 2003). LAsparaginasa también es importante en la
biosíntesis de la familia aspártica de aminoácidos (Martin 1989). La L-Asparaginasa se produce
constitutivamente, y su función puede ser como una enzima de desbordamiento, que descompone el
exceso de L-asparagina en ácido L-aspártico, que es el precursor de la lisina, la treonina y la metionina
(Savitri y Azmi 2003). Además, el producto de la reacción catalítica de Lasparaginasa en plantas, L-
asparagina, se usa para el almacenamiento y transporte de nitrógeno, y es vital para la utilización de
este recurso esencial (Bruneau et al., 2006). Los microbios pueden producir diferentes tipos de
paraginasas que difieren en su ubicación y propiedades celulares, concretamente asparaginasa
periplásmica, asparaginasa extracelular, asparaginasa intracelular y glutaminasa asparaginasa, que
desempeña un papel en el metabolismo básico (Cedar y Schwartz 1967; Hüser et al., 1999). Borek y
Jaskólki (2001) compararon casi todas las secuencias de proteínas conocidas que codifican L-
asparaginasa.
Basados en la conservación filogenética y otros datos bioquímicos y cristalográficos, concluyeron que
las L-asparaginasas podrían dividirse en tres familias diferentes y no relacionadas que denominaron de
tipo bacteriano, de tipo vegetal y de tipo Rhizobium. Existen dos tipos de bacterias designadas: tipo Iy
tipo II. Las laparasinasas tipo T muestran altos valores de Km hacia L-asparagina y también muestran
actividad catalítica hacia L-glutamina, mientras que las L-asparaginasas de tipo II muestran una gran
afinidad por L-asparagina y actividad de baja a negativa hacia L- glutamina (Cedar y Schwartz 1967,
1968; Jerlström y otros 1989).

Nuevas fuentes microbianas.

Los microorganismos se han considerado como la fuente más importante de L-asparaginasa desde
que se informó por primera vez en E. coli (Mashburn y Wriston Jr 1964). Aunque la L-asparaginasa
también se ha aislado de fuentes vegetales y animales, los microorganismos, como bacterias, hongos,
levaduras, actinomicetos y algas, han demostrado ser fuentes abundantes de esta enzima. Aunque las
fuentes de L-asparaginasa se han revisado antes de 2007 (Savitri y Azmi 2003; Verma et al., 2007b),
se han registrado otros microorganismos noveles en los últimos años. Sahu et al. (2007) seleccionaron
seis cepas de actinomicetos (Streptomyces aureofasciculus, Streptomyces chattanoogenesis,
Streptomyces hawaiiensis, Streptomyces orientalis, Streptomycescanus y Streptomycesolivoviridis) de
peces estuarinos. Se informó que dos especies de Helicobacter pylori producen L-asparaginasa
(Shibayama et al., 2011; Gladilina et al., 2008). Basha et al. (2009), usando fermentación sumergida y
de estado sólido, filtraron tres cepas (S3, S4 y K8) de actinomicetos marinos. La L-Asparaginasa se ha
informado de dos especies de Serratia, Serratia marcescens SK-07 (Agarwal et al., 2011) y S.
marcescens NCIM 2919 (Ghosh et al., 2013). Eisele et al. (2011) informaron la primera L-asparaginasa
caracterizada de un basidiomiceto, Flammulina velutipes. Los aislados fúngicos de suelos de rizosfera
se cribaron para la producción de L-asparaginasa utilizando agar CzapekDox modificado que contiene
L-asparagina y fenol como indicador. El análisis de secuencia de 16S rDNA indicó que una de estas
cepas estaba más estrechamente relacionada con Fusarium equiseti (Hosamani y Kaliwal 2011).
Sudhir et al. (2012) proyectaron una nueva cepa, Streptomyces ABR2, que mostró la mayor actividad
l-asparaginasa entre todos los organismos seleccionados. Chlorella vulgaris se identificó como una
nueva fuente de microalgas para la producción de l-asparaginasa (Ebrahiminezhad et al., 2014).
Recientemente, se han caracterizado tres asparaginasas extremadamente heterogéneas a partir de
cepas de archaeon hipertermófilas, que incluyen Thermococcus kodakaraensis KOD1 (Chohan y
Rashid 2013), Thermococcus gammatolerans EJ3 (Zuo et al., 2014) y Pyrococcus furiosus (Bansal et
al., 2010). Sin embargo, estas l-asparaginasas de T. kodakaraensis KOD1 y P. furiosus no mostraron
actividad de L-glutaminasa, mientras que T. gammatolerans L-asparaginasa tuvieron una actividad de
hidrólisis relativamente alta hacia L-glutamina (Zuo et al., 2014).

Purificación y caracterización.

L-Asparaginasa es un medicamento inyectable que se usa para el tratamiento de tumores. La

sensibilidad de la aplicación de esta enzima requiere un alto grado de pureza. La mayoría de las
Lasparaginasas microbianas son intracelulares. La mayoría de los procedimientos de purificación están
compuestos de métodos convencionales, tales como fraccionamiento de sulfato de amonio combinado
con filtración en gel o cromatografía en columna de intercambio iónico, mientras que las Lasparaginasa
recombinante que contiene una etiqueta de hisidina 6x se purificaron hasta homogeneidad usando
cromatografía de afinidad de níquel en una etapa. También se han aplicado varios métodos novedosos
para purificar esta enzima. La extracción de L-asparaginasa intracelular usando un sistema de
separación simultánea de dos fases se comparó con el proceso de extracción de dos fases acuoso
convencional, y la purificación de L-asparaginasa mediante este nuevo método produjo mayor
rendimiento y mayor actividad específica (Zhu). et al. 2007). La recuperación de la enzima se mejoró
aún más cuando Zhu y Liu (2008) combinaron la homogeneización a alta presión con una extracción
acuosa en dos fases para la purificación de E. coli-asparaginasa.Ferraratal (EA) intracelular. (2010)
estudiaron la extracción de L-asparaginasa periplásmica a partir de Pichia recombinante pastoris que
albergan el gen ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Obtuvieron altos rendimientos de extracción y
recuperación de enzimas utilizando ciclos de congelación-descongelación, tratamiento con etanol y
extracción alcalina en presencia y ausencia de cisteína. Las L-asparaginasas de diferentes organismos
varían en sus propiedades bioquímicas. En general, la temperatura óptima para la actividad L-
asparaginasa está entre 30 y 40 ° C; varias especies de Yersinia y Streptomyces tienen temperaturas
óptimas más altas (40-60 ° C), mientras que las Lasparaginasas hipertermófilas de las arqueobacterias
Thermococcus kodakarensis KOD1, T. gammatolerans EJ3 y P. furiosus tienen temperaturas óptimas
a 85, 85 y 80 ° C, respectivamente (Tabla 1). La enzima mostró actividad en un amplio rango de pH,
con una actividad óptima en el rango de 6,0-9,5. La mayoría de las enzimas tienen una alcalinidad
máxima, mientras que las cadenas moleculares tienen una actividad enzimática máxima por debajo de
pH 7,0 (Tabla 1). Streptomyces gulbargensis L-asparaginasa fue más estable a pH alcalino, y retuvo
55% de actividad a 80 ° C durante 1 h (Amena et al., 2010). Las diferencias tuvieron diferentes
influencias en la actividad de Lasparaginasa. Fe3 + inhibió fuertemente la actividad de Bacillus subtilis
B11-06 L-asparaginasa. La actividad de Rhizobiumetli L-asparaginasa se redujo en presencia de Mn2
+, Zn2 +, Ca2 + y Mg2 + (Moreno-Enriquez et al., 2012). Se observó la inhibición completa de la
actividad de Lasparaginasa de P. carotovorum MTCC 1428 en presencia de Cu2 +, Cd2 + y Hg2 +
(Kumar et al., 2011a). La adición del agente quelante de metales EDTA no tuvo ningún efecto sobre la
actividad enzimática, revelando que la enzima no era una metaloproteína (Jia et al., 2013; Kumar et al.,
2011a; Chohan y Rashid 2013; Singh et al., 2013; Kumar y Manonmani 2013). )
Producción de L-asparaginasa por fermentación.

Ha habido muchos informes sobre la producción de Lasparaginasa bajo diversas condiciones por
diferentes mic roorganismos. La L-asparaginasa se produjo normalmente durante la fermentación
sumergida y la fermentación en estado sólido. Se emplearon muchos métodos para optimizar la
producción de Lasparaginasa, como el diseño experimental Plackett-Burman, el algoritmo genético y
los modelos de diseño basados en redes neuronales artificiales, el diseño rotativo compuesto central y
la metodología de superficie de respuesta. Prakasham et al. (2007) describieron la interacción de los
parámetros del proceso de fermentación (fuentes de carbono y nitrógeno, temperatura de incubación,
pH medio, aireación y agitación, y niveles de inóculo) para la producción de L-asparaginasa por
Staphylococcus sp. -6A. La producción de Streptomyces albidoflavus L-asparaginasa bajo
fermentación sumergida se optimizó y el nivel máximo de producción de enzimas se encontró a pH 7,5
y 35 ° C en medio de cultivo suplementado con maltosa y extracto de levadura como fuentes de carbono
y nitrógeno, respectivamente (Narayana et al., 2008). La aplicación del método de diseño experimental
y superficie de respuesta de Plackett-Burman para la optimización de la producción de L-asparaginasa
de P. carotovorum MTCC 1428 en fermentación sumergida fue descrita por primera vez por
Sanjeeviroyar et al. (2010). Se estudió un nuevo aislamiento, S. gulbargensis, para la producción de L-
asparaginasa extracelular en condiciones de fermentación sumergida utilizando extracto de torta de
maní (Amenaetal.2010). Se aplicaron tres tipos de diseño de la superficie de respuesta y el algoritmo
genético artificial ligado a la red neuronal. para optimizar las condiciones operativas para la producción
mejorada de L-asparaginasa mediante la fermentación sumergida de Aspergillus terreus MTCC 1782
(Baskar y Renganathan 2012). La producción de Streptomyces noursei MTCC 10469
Lasparaginasebysubmergedfermentation se llevó a cabo utilizando una aurícula, glucosa y caldo de
extracto de buey (Dharmaraj2011).
La producción de Bacillus circulans MTCC 8574 L-asparaginasa se optimizó bajo fermentación en
estado sólido utilizando diferentes materiales agrícolas, como gramo rojo, gramo de Bengala, coco y
torta de nuez de terreno, con un rendimiento de enzima máximo (Hymavathi et al., 2009). La
optimización de la producción de L-asparaginasa por A. niger usando fermentación en estado sólido en
torta de sésamo se realizó utilizando algoritmos genéticos y modelos de diseño basados en redes
neuronales artificiales (Babu et al., 2010). Diferentes parámetros físicos y químicos fueron optimizados
para condiciones de fermentación de estado sólido para la producción de F. equiseti L-asparaginasa
(Hosamani y Kaliwal 2011). Kumar et al. (2013b) informaron la producción y optimización de
Lasparaginasa de Cladosporium sp. utilizando residuos agrícolas y fermentación en estado sólido. La
metodología clásica de superficie de un factor a tiempo y de respuesta se ha aplicado para optimizar la
producción de L-asparaginasa por S. marcescens (NCIM 2919) bajo condiciones de fermentación en
estado sólido usando torta de aceite de coco (Ghosh et al., 2013). La producción de L-asparaginasa
extracelular a partir de actinomicetos marinos se realizó tanto en estado sólido como en condiciones
de fermentación sumergida (Basha et al., 2009).
Se aplicaron muchos métodos de uso frecuente para optimizar el medio de cultivo y la producción de
fermentación de Lasparaginasa. La producción de L-asparaginasa de P. carotovorum MTCC 1428 se
ha estudiado varias veces desde que se informó por primera vez. El diseño experimental de Blackett-
Burmane se ha aplicado aproximadamente a la producción de L-asparaginasa sin glutaminasa libre de
P. carotovorum MTCC 1428 (Kumaretal.2009). Kumaretal. (2010) aludió al efecto de diversas fuentes
de carbono y nitrógeno en la producción de L-asparaginasa por P. carotovorum MTCC 1428. Entre las
fuentes de carbono probadas, L-asparagina o la combinación de L-asparagina y glucosa fueron las
mejores fuentes de carbono. Kumar et al. (2011b) optimizó las condiciones físicas del proceso
(temperatura inicial, temperatura, velocidad de rotación de la incubadora de agitación y tamaño del
inóculo) para la producción de Lasparaginasa de P. carotovorum MTCC 1428. Se utilizó un diseño
rotativo compuesto central para optimizar los parámetros químicos y físicos para mejorar la producción
de La L-asparaginasa de un novedoso biorreactor aislado de S. marcescens SK-07, y la producción
máxima de L-asparaginasa fue una dosis inicial de 6,5 y un nivel de oxígeno disuelto del 40%
(Agarwaletal.2011) .La producción de L-asparaginasa de E. coli ATCC 11303 se informó utilizando
respuestas de la metodología (Kenarietal.2011) .Nartaetal . (2011) evaluaron la producción de L-
asparaginasa porBacillus brevis cultivada en presencia de tres vectores de oxígeno: parafina líquida,
aceite de silicona y n-dodecano.
Los resultados mostraron que cada uno de los tres vectores de oxígeno estimuló el rendimiento de la
enzima. La producción de L-Asparaginasa por Bacillus cereus MAB5 derivada del manglar se optimizó
mediante la metodología de superficie de respuesta (Thenmozhietal.2011). Se ha optimizado la
producción de L-asparaginasa por Nocardia levis MK-VL_113 aislada de suelos de laterita de la región
de Guntur (Kavitha y Vijayalakshmi 2012). Se descubrió que la metodología de superficie de respuesta
no es tan eficiente como los algoritmos genéticos artificiales ligados a redes neuronales para maximizar
la producción. La metodología de la superficie de respuesta y las técnicas basadas en algoritmos
genéticos también se implementaron para mejorar la producción de L-asparaginasa por
B.aryabhattaiITBHU02 (Singh y Srivastava 2012). Se ha desarrollado la producción de alto rendimiento
de Lasparaginasa utilizando un enfoque basado en el modelo cinético (Singh y Srivastava 2014). La L-
asparaginasa II recombinante de Erwinia carotovora en E. coli se produjo utilizando una técnica robusta
de lote alimentado con tasas de alimentación exponencial predeterminadas (Roth et al., 2013).

L-asparaginasa recombinante y modificada molecular.

La tecnología de ADN recombinante es una estrategia importante para mejorar el rendimiento de

proteína. En los últimos años, muchos investigadores utilizaron la tecnología recombinante para
aumentar el nivel de expresión de L-asparaginasa con éxito. Las L-asparaginasas recombinantes se
resumieron en la Tabla 2. Y la comparación de secuencias de aminoácidos de L-asparaginasas de
diversos microorganismos se mostró en la Tabla 3. La expresión heteróloga del gen ASP3 de S.
cerevisiae en P. pastoris se informó por primera vez por Ferrara et al. . (2006). La L-asparaginasa
recombinante se produjo en frascos de tabaco y biorreactor de 2-Linstrumented. Kotzia y Labrou (2007)
informaron la clonación, expresión y caracterización de L-asparaginasa de E. chrysanthemi 3937 en E.
coli BL21 (DE3) que contiene el plásmido pLysS. Una nueva L-asparaginasa de la cepa patógena H.
pylori CCUG 17874 se ha clonado y expresado en E. coli BL21 (DE3), y se combinó con una planta
como una fuerte preferencia por L-asparagina sobre L-glutamina (Cappelletti et al., 2008). Yano et al.
(2008) informaron por primera vez sobreexpresión de la L-asparaginasa de tipo I de B. subtilis NBRC
3009 en E. coli Rosetta Gami B. El gen ansA de P. furiosus se clonó y expresó en E. coli, y la enzima
recombinante se purificó a homogeneidad ( Bansaletal.2010). Se descubrió que la enzima era
termoestable, dímera en su forma nativa y libre de glutaminasa, con actividad óptima en pH9.0. La Urea
no podía inducir el despliegue y la inactivación enzimática; sin embargo, con hidrocloruro de guanidina
(GdnCl), se observó un patrón de despliegue de dos estados. Dos construcciones de E. coli carotovora
L-asparaginasa II, con y sin el péptido señal, se compararon entre sí, y los resultados muestran que la
enzima tiene menor actividad de glutaminasa (Wink et al., 2010).

Cinco genes de L-asparaginasa de cepas de Streptomyces, Streptomyces thermoluteus subsp. fuscus

NBRC 14270, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis y Streptomyces griseus se expresaron
en Streptomyces lividans utilizando el vector de hiperexpresión: pTONA5a (Hatanaka et al., 2011).
Entre esos genes, solo los genes de S. thermoluteus subsp. fuscus NBRC 14270 y S. griseus fueron
exitosos para la sobreexpresión. Onishi et al. (2011) examinaron la expresión de los genes Zhen
codificando Lasparaginasa II de B. subtilis en E. coli. No se encontró expresión en E. coli transformada
con un plásmido que contiene el gen ansZ de longitud completa. Tres enzimas truncadas N-terminales
se construyeron sobre la base de una comparación con las secuencias N-terminales de las
asparaginasas con IL-li. Todas las enzimas truncadas se expresaron con éxito. El gen ansB que codifica
L-asparaginasa II de E. coli MTCC 739 se expresó con éxito en células E. coli DE3 (Vidya et al., 2011).
Se ha informado de la presencia de lasparaginasa de Rhodospirillum rubrum intracelular con actividad
baja de L-glutaminasa y antiproliferación (Pokrovskaya et al., 2012a). El gen de L-asparaginasa II de
un aislado bacteriano moderadamente termotolerante que pertenece a Enterobacteriaceae se clonó en
el vector pET20b con una secuencia líder pelB (Vidya y Pandey 2012). Pokrovskayaetal. (2012b) ha
clonado a los genes Bgene de Yersinia pseudotuberculosis Q66CJ2 y ha construido un sistema de
expresión estable inducible que sobreexpresa Lasparaginasa de Y. pseudotuberculosis en E. coli BL21
(DE3). Una L-asparaginasa recombinante termoestable de T. kodakaraensis KOD1 exhibió la actividad
enzimática más alta jamás reportada (Chohan y Rashid 2013). El gen que codifica L-asparaginasa de
una cepa no patógena de B. subtilis B11-06 se expresó con éxito en B. subtilis 168 (Jiaetal.2013). El
gen de L-asparaginasa no fúngica de Rhizomucor miehei se clonó y se expresó en E. coli (Huang et al.
2014). Su secuencia deducida de aminoácidos compartió solo el 57% de identidad con las de otras
Lasparaginasas informadas.
Se encontró una variante de la enzima E. carotovora con actividad de glutaminasa indetectable. El
análisis de secuencia mostró que esta variante contenía una única mutación puntual que daba como
resultado una única sustitución de aminoácido (Leu71Ile).

Inmovilización de L-asparaginasa.

La inmovilización es un método útil para modificar la L-asparaginasa para aumentar la vida media y
disminuir la reactividad inmune (Tabla 4). Kotzia et al. (2007), utilizando la técnica de mutagénesis
dirigida al sitio seguida de acoplamiento covalente del éster de metoxipoli (etilenglicol) succinato N-
hidroxisuccinimida (mPEG-SNHS) a las L-asparaginasas de E. carotovora 1526, encontraron que la
enzima modificada retiene la mayor parte de su actividad original (82%), muestra una resistencia
mejorada a la degradación de la tripsina y muestra una estabilidad térmica mayor que la enzima de tipo
salvaje. La enzima recombinante de E. chrysanthemi 3937 se ha inmovilizado en Sepharose CL-6B
activada con epoxi, y la enzima inmovilizada conserva el 60% de su actividad original y exhibe una alta
estabilidad a 4 ° C (Kotzia y Labrou 2007). Este método ofrece la posibilidad de diseñar un biorreactor
que pueda operarse durante un largo período de tiempo con alta eficiencia, que puede usarse para
terapia de leucemia. Zhang et al. (2008) describieron un método de preparación de nanopartículas de
fibroína de seda y utilizaron con éxito el método para inmovilizar la L-asparaginasa mediante la
reticulación de glutaraldehído. La estabilidad térmica de la enzima inmovilizada aumentó
marcadamente, y el rango de pH óptimo se hizo más amplio. La temperatura óptima de la enzima
modificada también aumentó aproximadamente a 10 ° C. Más tarde, Zhang et al. (2011) informaron
otro método novedoso y altamente eficiente para procesar bioconjugados de fibroína de seda fina
nanopartícula-L-asparaginasa de seda en presencia de disolventes orgánicos en exceso.
Los bioconjugados podían resistir temperaturas más altas, eran más resistentes a la digestión con
tripsina y tenían una mejor estabilidad en el suero. No se encontraron fugas de la enzima de las
nanopartículas. Ghosh et al. (2012) describieron una nueva matriz de inmovilización de nanofibras de
polianilina para la enzima anti-leucemia L-asparaginasa. Lasparaginasa inmovilizada mostró una mayor
estabilidad hacia la descomposición o la desnaturalización en un rango de temperaturas y condiciones
de pH en comparación con la enzima libre. L-Asparaginasa de Cladosporium sp. se modificó con
albúmina de suero bovino, ovoalbúmina mediante reticulación utilizando glutaraldehído,
Nbromosuccinimida y mono-metoxi polietilenglicol (Kumar et al., 2014a, b).

Futuro
A pesar de la amplia aplicación de L-asparaginasa en el tratamiento médico y la mitigación de la
acrilamida en la industria alimentaria, también existen deficiencias y problemas que quedan por
resolver. Los efectos secundarios, la corta vida media y los bajos niveles de producción de enzimas
son las principales preocupaciones para el uso clínico. En primer lugar, se necesita un cribado adicional
de los microorganismos para mejorar el rendimiento de la enzima, la actividad y la especificidad de L-
asparagina para reducir las características hidrolíticas de L-glutamina. En segundo lugar, se deben
aplicar modificaciones, evolución dirigida y técnicas recombinantes para mejorar la estabilidad frente a
la proteólisis, aumentar la vida media de la enzima y reducir la inmunogenicidad. Además, las
condiciones de fermentación deben optimizarse para producir una mayor actividad enzimática. Para su
aplicación en la industria alimentaria, mejorar la termoestabilidad de la L-asparaginasa y su actividad
en un amplio rango de pH sigue siendo el problema más importante a superar. Queda mucho por
explorar sobre esta útil enzima.
OTROS ARTÍCULOS

Efectos positivos en las terapias

El motivo por el cual es tan importante esta acción de L-ASP se debe a que la mayoría de las células
blasticas de la LLA, no posee la enzima para sintetizar la asparagina, dependiendo casi
exclusivamente de la que se encuentra en la sangre, así vemos que los blastos que presentan la
translocación TEL-AML1 o blastos con hiperdiploidias (ambos factores de buen pronóstico) son muy
susceptibles a esta deplesión, pero las LLA- de células T y los que poseen la translocación BCR-ABL
son menos sensibles a los efectos de esta enzima 7-9. Al contrario muchos de los tejidos contienen la
asparagina-sintetasa, evitando que los efectos de la L-ASP sean intensos en el cuerpo4. La
asparagina es un aminoácido importante para formar proteínas, motivo por el cual cuando
disminuye este aminoácido los blastos entran en apoptosis1, aunque esta disminución de asparagina
para activar la apoptosis es aceptado, hay factores que tiene importancia en la respuesta y pueden
incluso modificarla, así vemos que la producción de asparagina por la células mesenquimales de la
medula ósea producen un efecto protector para los blastos8. Hay blastos de LLA que contienen la
enzima para sintetizar asparagina, motivo por el cual es una razón para la resistencia a este
medicamento. La depleción de asparagina también influyen a nivel del sistema nervioso central
(SNC), considerándose un medicamento profiláctico para la recaída del SNC a pesar que no traspasa
la barrera hematoencefalica, pero esta depleción sistémica también afectara a los blastos en el
SNC7,9. Ver figura #1.

.,

Efectos negativos en las terapias

Reacciones de hipersensibilidad: se considera como un evento tóxico de mayor frecuencia,

debido a que producirá reacciones inmunitarias, induciendo la formación de anticuerpos que irán a
inactivar la enzima administrada, que por lo general se acompaña de reacciones alérgicas clínicas
cuando el número de anticuerpos ya es elevado. Esta reacción inmunitaria con formación de
anticuerpos producirá una inactivación de la enzima que incluso puede ser de forma silenciosa1,5,9.
Este evento se incrementa cuando el número de administraciones es mayor. Las reacciones van
desde leves alergias como eritema en el sitio de inyección, urticaria, broncoespasmo hasta
reacciones anafilácticas en un 20 a 40%5-17. Los anticuerpos se reportan en un 30 a 70% de los
pacientes pediátricos que reciben L-ASP de E. coli, siendo menores estas reacciones con la PEG-ASP
y mucho menor con la L-ASP proveniente de Erwinia1,5. El mayor problema con esta reacción es que
hay una mayor inactivación de la enzima, pero las reacciones adversas aumentaran conforme
continúe la administración de L-ASP1. La única manera de continuar con este esquema de terapia
es el cambio de L-ASP producida de E. coli a la producida por Erwinia o a la PEG-ASP1.

Inhibición de síntesis de proteínas: esta acción es la más extendida de L-ASP y con mayor
repercusión desde el punto de vista del paciente y las terapias. Se pueden observar alteraciones en
la coagulación (trombosis, hemorragias), hipoalbuminemia, elevación de enzimas hepáticas,
pancreatitis e hiperglicemia1,2. Estos eventos se incrementan en porcentaje cuando se asocia con
otros medicamentos, como los corticoides, vincristina, daunorrubicina, o asociados a otros factores
como el sexo, edad, índice de masa corporal etc

Acción farmacológica y mecanismo de acción

El fármaco es utilizado en oncología para tratar la leucemia aguda linfoblástica y el linfoma no Hodgkin. Es una
enzima que causa hidrólisis de la asparagina para formar ácido aspártico y amoníaco lo que disminuye los
niveles de asparagina circulante. En virtud de que ciertos tipos de células tumorales utilizan la asparagina como
nutriente esencial y la L-asparaginasa evita que se forme este aminoácido se induce la inhibición del
crecimiento de los tumores por desnutrición. Se ha observado que la L-asparaginasa actúa como agonista
plaquetario in vitro y podría conducir a un estado de reactividad plaquetaria incrementada. Actúa como
agregante plaquetario en la leucemia linfoblástica aguda infantil. El fármaco en forma inyectable puede ser
combinado con otros medicamentos antileucémicos para inducir a una acción sinérgica en los esquemas de
tratamientos antineoplásicos. La L-asparaginasa derivada de cultivos de E. coli posee de un 2% al 10% de
actividad de glutaminasa.

ASPARAGINASA Indicaciones.
Leucemia linfocítica aguda. Se usa principalmente en combinación con otros agentes antineoplásicos, en la
inducción de remisiones de la enfermedad en niños. No se recomienda como tratamiento de mantenimiento.
Como coadyuvante en el tratamiento de la leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfoblásticas aguda
resistente a otros tratamientos.

ASPARAGINASA Dosificación.
Los regímenes recomendados incluyen combinaciones de prednisona, vincristina y asparaginasa. Régimen 1:
prednisona 40mg/m 2/día durante 15 días, luego discontinuar reduciendo la dosis a la mitad cada dos días; la
última dosis administrada debe ser de 2,5mg/m 2/día; vincristina 2mg/m 2 de superficie corporal (la máxima
dosis individual no debe superar los 2mg) en los días 1, 8 y 15 desde el inicio de la administración de
prednisona; y asparaginasa vía IV 1.000UI por kg/día por 10 días sucesivos a partir del día 22 del inicio del
tratamiento. Régimen 2: prednisona 40mg/m 2/día durante 28 días, luego discontinuar reduciendo la dosis
gradualmente en un período no menor de 14 días; vincristina 1,5mg/m 2 de superficie corporal (la máxima dosis
individual no debe superar los 2mg) en los días 1, 8, 15 y 22 desde el inicio de la administración de prednisona;
y asparaginasa vía IM 6.000UI/m 2 de superficie corporal en los días 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 y 28 a partir del
inicio del tratamiento con prednisona.

ASPARAGINASA Modo de uso.

La administración de asparaginasa vía IV debe realizarse por infusión en un período no menor de 30 minutos.
La administración de asparaginasa vía IM debe realizarse a razón de 2ml por sitio de inoculación.

ASPARAGINASA Reacciones adversas.

Reacciones alérgicas: erupciones, urticaria, artralgia, distrés respiratorio, anafilaxia aguda, hipertermia fatal;
pancreatitis, incluso pancreatitis fulminante; hiperglucemia, glucosuria, hipofibrinogenemia, disminución de los
factores plasmáticos de coagulación VIII, VII y IX: sangrado, coagulopatía. En algunos casos se ha observado
somnolencia, fatiga, depresión, coma, confusión, agitación, alucinaciones, hipoalbuminemia, alteración de las
enzimas hepáticas séricas, síndrome de malabsorción. Raramente: depresión de la médula ósea. Náuseas,
vómitos, escalofríos y fiebre.

ASPARAGINASA Precauciones y advertencias.

No se recomienda realizar la prueba de dependencia a la asparagina como base de selección de pacientes
para el tratamiento. Las reacciones anafilácticas a la asparaginasa pueden aparecer durante el primer curso de
tratamiento; estas reacciones no son completamente predecibles por las pruebas intradérmicas. No usar en
mujeres embarazadas a menos que el beneficio para la madre supere el riesgo potencial para el feto. El
amamantamiento debe suspenderse si la madre debe recibir asparaginasa.