Contribution of Single-minded 2

to hyperglycaemia-induced
neurotoxicity

Contribución de Single minded 2 a la neurotoxicidad inducida por la hiperglucemia

Xiaolan Wang, Yi Song, Lu Chen,Guobing

Zhuang, Jing Zhang, Man Li, Xian-Fang Meng

Article history:
Received 13 June
2012
Received in revised
form 5 December
2012
Accepted 6 January
2013
Available online xxx

Daniel Valencia Montoya | Universidad de Antioquia

 Contexto

La diabetes mellitus se ha asociado a daño del

sistema nervioso central, lo que resulta en el deterioro
de las funciones cerebrales y déficit cognitivos y
disminución de la memoria.

El represor transcripcional Single minded 2 (Sim2),

una hélice-bucle-hélice básica (bHLH), se cree que
está involucrado en algunos de los síntomas del
síndrome de Down y otras enfermedades.
 Introducción
La diabetes relacionada con la disfunción cognitiva es principalmente
una consecuencia de los cambios en el sistema nervioso central
(SNC) que son secundarias a la hiperglucemia crónica.

La exposición prolongada a la hiperglucemia crónica da lugar a

diversas complicaciones, tanto en el sistema nervioso central como
en el periférico.

Déficits de aprendizaje y memoria han sido en parte asociada a los

déficits estructurales y funcionales en ciertas regiones del cerebro
como el hipocampo y la corteza cerebral

En los seres humanos, la DM se asocia con alteraciones moderadas

en la función cognitiva y los pacientes presentan un alto riesgo de
trastornos afectivos, demencia y enfermedad de Alzheimer
Además de DM, también hay algunas de las enfermedades que
deterioran el aprendizaje y la memoria, tal como el síndrome de
Down (SD) y enfermedad de Alzheimer.

Se ha demostrado que una sobreexpresión de Sim2 en modelos

de raton con síndrome de Down, contribuye a los síntomas
numerados.

Se ha observado reducción en la ansiedad relacionada con la

exploración en ratones con sobreexpresión de Sim2.
También se ha reportado
un incremento de la
expresión de Sim2 en la
enfermedad de
Alzheimer.
Dada la importante función de Sim2 en déficits
de aprendizaje y memoria, el presente estudio
postula como hipótesis que la glucosa alta
puede inducir daño neuronal mediante el
aumento de la expresión de Sim2, en última
instancia conduciendo a la disfunción neuronal
y déficits de memoria y aprendizaje
posteriores.
Para probar esta hipótesis, se utilizó estreptozotocina
(STZ) en ratas induciendo DM para examinar la
expresión de Sim2 en la corteza y la expresión de
Drebrin, una proteína de la espina dendrítica, que está
regulada negativamente por Sim2.
También se determinó la expresión de Sim2
en cultivos primarios de neuronas tratados
con glucosa alta.
Además, hemos detectado
si la curcumina regula la
expresión de Sim2 y
Drebrin, y a continuación,
alivia la lesión neuronal
 Finalmente, el papel directo de Sim2 en la lesión por
hiperglucemia inducida fue descubierta por silenciar la
expresión de Sim2 con lentivirus.
 Métodos
y materiales
 Inducción de DM en ratas

Adultos (250-280 g) machos

Sprague-Dawley fueron alojados
individualmente y se mantuvieron
en un ciclo de luz-oscuridad en un
periodo de12-12 h, la comida y el
agua ad libitum.

La diabetes fue inducida por una inyección

intraperitoneal de estreptozotocina (STZ, 60 mg / kg,
Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) disuelta en solución
tampón estéril de citrato de sodio (0,1 mol / L de ácido
cítrico y 0,2 mol / L fosfato de sodio, pH 4,5)
 Tres días después de la administración de STZ, los
niveles de glucosa en sangre se determinaron con un
glucómetro de sangre.

Los animales se
consideraron diabéticos
si los niveles de glucosa
plasma excedían 16,7
mmol / L
 Cultivo primario de
células neuronales y
tratamiento

Los cultivos neuronales se prepararon a

partir del día 17 de capas corticales de
embriones de rata.

El tejido cortical se disgrego y fue sembrado

en placas a una concentración de 2 x106
células/placa. Las neuronas fueron
cultivadas en platos de poli-L-lisina y se uso
medio neurobasal.
Medio Neurobasal contiene 25 mmol / L de glucosa,
medida óptima para la supervivencia neuronal y el
crecimiento (grupo control).

25 mmol / L de glucos adicionales se añade a los

cultivos de glucosa alta.

25 mmol / L de Manitol también se usó para crear una

presión osmótica alta imitando la condición de alto
contenido de glucosa.

Las neuronas corticales se cultivaron durante

aproximadamente 5 d (DIV 5) antes del tratamiento
de drogas.
 La transducción de las
neuronas corticales con
vectores lentivirales

Los vectores lentivirales expresan la proteína verde

fluorescente (GFP) y el shRNA de Sim2 fue construido
por Genechem (Shanghai, China).

La secuencia de shRNA que se dirige a fue diseñado

de la siguiente manera: 5'-GCT CAC AGG CAA CAG
TAT T-3'. Una secuencia sin sentido elegida
aleatoriamente (5'-TTC TCG CAA CGT CGC ATG
TGA-3' ) se utilizó como control.

Infección lentiviral se realizó mediante la adición de

solución de virus a las células.
 Análisis PCR de
transcripción inversa de los
niveles de mRNA de Drebrin
RNA total fue aislado de las neuronas por TRIzol.

RNA se cuantificó por determinación de la densidad óptica a

260 nm (DO260).

Se generó cDNA a partir de 2 mg de RNA usando una RT-

Kit.

PCR cuantitativa se realizó utilizando el coloranteSYBR-

Green y haciendo uso del hardware y software de Applied
Biosystems.

Valor de la expresión del gen diana en una muestra dada se

normalizó a la expresión correspondiente de GAPDH
 Tinción de
inmunofluorescencia

La doble tinción inmunofluorescente se realizó usando capaz congeladas

de cortezas de rata.

Después de la fijación, los portaobjetos se incubaron con IgG de cabra

anti-Sim2, IgG de conejo anti Drebrin y anti NueN durante la noche a

Después de la fijación, los portaobjetos se incubaron con IgG de cabra

anti-Sim2, de conejo anti-ratón Drebrin anti-NeuN durante la noche a 4*C.

Después del lavado, los portaobjetos se incubaron con diferentes

anticuerpos fluorescente.

Por último, los portaobjetos se montaron y se sometieron a examen con un

microscopio láser confocal de barrido
 Analisis
Western blot
Cantidades iguales de proteínas se fraccionaron en geles de
poliacrilamida dodecil sulfato de sodio y se transfirieron
electroforéticamente a una membrana de difluoruro de
polivinilideno.

Las membranas se bloquearon con leche sin grasa al 5% en

solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05% de Tween
20 durante 1 hora a temperatura ambiente.

A continuación, la membrana se sondeó con anticuerpos primarios

de anti-Sim2 (1:200), anti-Drebrin (1:200) o anti-b-actina (1:5000)
durante toda la noche a 4*C y después se incubo con peroxidasa
de rábano picante-IgG marcada durante 1 hora.
Las bandas inmunorreactivas se detectaron mediante métodos de
quimioluminiscencia.
 Evaluación de la viabilidad
celular
Las células neuronales se sembraron en 96 plato con
una densidad de grupos de 5x104 células/plato. Los
platos se dividieron aleatoriamente en grupos.

Después de 24 h de incubación a diferentes

condiciones experimentales, las neuronas en grupos
de 96 pocillos fueron procesadas para la detección de
la viabilidad celular por LDH kit.

Después de la incubación, los medios se analizaron

para evaluar la actividad de LDH registrando la
absorbancia a 450 nm
 Tinción con yoduro
de propidio (PI)
La muerte celular se evaluó mediante la absorción o
exclusión del colorante fluorescente PI.

Después las neuronas se sembraron en placas de 12

pocillos durante 2 días, y luego se infectaron con vectores
lentivirales por 3 días.

Luego de tratarse con glucosa durante 24 h, las células

se lavaron con PBS y se tiñeron con PI 10 mg/ml a 37*C.

Después de lavar las células con PBS, las imágenes se

obtuvieron utilizando un microscopio Olympus
Todos los valores se expresaro como media+/-
SEM. Las diferencias significativas entre grupos
múltiples fueron examinadas utilizando ANOVA
seguido por una prueba de Student-Newman-
Keuls. Los valores de p inferior a 0,05 se
consideraron estadísticamente significativos
RESULTADOS
Los niveles de concentración
de glucosa en ratas tratadas
con STZ
Expresión de Sim2 y Drebrin en la corteza de ratas DM
 Efectos de la
hiperglucemia en la
expresión de Sim2 y
Drebrin en vitro neuronas
(B) Representative gel images showing
the expression of Sim2 protein in
response to glucose treatment.

(A) Immunofluorescence staining

shows the expression of Sim2 in
control cells or cells treated with 50
mmol/L glucose for 24 h. Images
are representative of five batches of (C) Quantitative results of
cells for each group immunoblots of Sim2. n = 4 per
group.
 (D) Drebrin expression was
detected by
immunofluorescence staining

(E) Levles of Drebrin mRNA

expression detected by
quantitative RT-PCR
 Los efectos de
la curcumina en
la lesión celular
inducida por la
hiperglucemia
 Los efectos de
la curcumina en
la expresión de
Sim2 y Drebrin
en cultivos de
neuronas
 Bloque del daño
neuronal inducido
por la hiperglucemia
a través del
silenciamiento de
Sim2
Discusión
 El objetivo principal de este estudio es
determinar si la expresión Sim2 está regulado
en la corteza de ratas DM y si media
acciones patológicas por medio de la glucosa
alta induciendo lesión neuronal.

Se haproporcionado evidencia confiable de

que Sim2 puede mediar la neurotoxicidad y la
posterior expresión de Drebrin, afectando el
aprendizaje y la memoria inducida por la
hiperglucemia.