Resumen Química ambiental

Cromatografía Liquida de alta resolución

Esta técnica deriva de una evolución de la cromatografía preparativa en columna, en la que la

cromatografía se realizaba en columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a
500 cm. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose
en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica.

Funcionamiento

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase

estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta
presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas
con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los
componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase
estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un
compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de
cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce
así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes
más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.

Instrumentación general

1. Sistema de suministro de fase móvil.

Todos los equipos de HPLC incluyen un sistema de bombeo de fase móvil de alta presión para
forzar el paso de la fase móvil a través de la columna, cuyo relleno muy compacto, es responsable
de una importante sobrepresión. En algunos detectores las fluctuaciones en el flujo de la fase
móvil dan lugar a fluctuaciones de la señal.

2. Sistema de inyección de muestra

La inyección de un volumen preciso de muestra debe hacerse a la entrada de la columna en un

corto periodo de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de fase móvil
establecido en la columna y el detector. Además, los volúmenes empleados son pequeños. Esto
significa que el factor limitante de la reproducibilidad del método es la reproducibilidad con que
puede introducirse la muestra en la columna. Existen dos válvulas rotatorias de alta presión, la
posición de llenado y la posición de inyección.

3. Columna cromatográfica
Las columnas de HPLC son tubos rectos de acero que miden 3 y 30 cm de longitud. Su diámetro es
de 2 a 5 mm. En HPLC se emplean dos tipos de relleno para las columnas; relleno pelicular: se
utiliza bolitas de vidrio no porosas esféricas de diámetro entre 30-40 um. Sobre su superficie se
deposita una capa delgada de gel de sílice, un cambiador iónico que actúa como fase estacionaria
es líquida se coloca una fina película sobre las esferas no porosas; Partículas porosas: se trata de
macropartículas porosas con tamaños entre 3-10 um de sílice, cambiador iónico que actúa como
fase estacionaria, también pueden recubrirse con películas orgánicas liquidas retenidas por
adsorción.

4. Detector

Un detector ideal en HPLC debe ser sensible a pequeñas concentraciones de analito, dar una
respuesta lineal limpia, tener poco ruido de fondo y ser estable en el tiempo que dura el
cromatograma; Algunos detectores más usados son:

 Detectores espectofotométricos
 Detectores de fluorescencia
 Detectores electroquímicos
 Detectores refractométricos

Funciones

 Campos de Aplicación de HPLC

 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores,
colorantes
 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
 Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
 Separación y purificación de metabolitos
 Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de
orina
 Purificación y separación de enantiómeros
 Purificación de compuestos naturales
 Purificación y caracterización de enzimas y proteínas

Cromatografía de partición

Técnica de separación de moléculas basada en su diferente solubilidad entre dos fases inmiscibles.
La fase estacionaria es revestida o impregnada con una fase solvente y la mezcla a separar se pasa
en la fase móvil.

Cromatografía de adsorción
La cromatografía líquida de adsorción se caracteriza por utilizar una fase estacionaria sólida
(Adsorbente) de carácter polar y una fase móvil líquida (Eluyente) apolar, y se utiliza tanto con
fines analíticos (identificación de sustancias) como con fines preparativos (aislamiento), siendo su
limitación más importante la dificultad de separar sustancias de polaridad parecida.

Cromatografía iónica

En las últimas décadas, la cromatografía iónica se ha convertido en uno de los métodos más
importantes para el análisis de trazas de aniones y cationes. Técnica absolutamente imprescindible
en el análisis de aguas y medio ambiente

Se basa en el uso de resinas de intercambio iónico. Cuando una muestra iónica atraviesa estas
columnas, los iones presentes se separan debido a las diferentes retenciones que sufren al
interactuar con la fase fija de las columnas analíticas. Una vez separada, la muestra pasa a través
de un detector (conductimétrico, amperométrico, UV...) donde se registra la señal obtenida
respecto al tiempo de retención. El resultado son unos cromatográmas donde la posición de los
máximos nos indica el ión presente (carácter cualitativo) y su área nos indica que cantidad
existente de dicho ión (carácter cuantitativo).