INSTITUTO SUPERIOR DE AGRONOMIA

Licenciatura em Biologia

Bioquímica

A importância das proteínas como inibidores de doenças inflamatórias humanas: o caso particular
da deflamina.

Objectivos:

• Compreender a importância das proteínas como ferramentas no controlo/tratamento de

doenças humanas;
• Aplicar o método para medição da atividade inibidora de três compostos (1,10-
fenantrolina, tremoço e aveia) nas enzimas MMPs presentes em células tumorais do
cólon, HT29.

Enquadramento teórico:
As metaloproteínases de matriz (MMPs) são um grupo de endopeptidases dependentes de zinco
que estão relacionadas com a funcionalidade e estrutura dos tecidos por atuarem na degradação
dos componentes proteicos da matriz extracelular (MEC), bem como das membranas basais das
células dos tecidos. As MMPs são reguladores importantes em vários processos fisiológicos, como
a angiogénese, morfogénese e reparação tecidual, participando também em patologias como
cancro e doenças inflamatórias e, em particular, às associadas ao trato digestivo como cancro do
colo-rectal e colites ulcerativas, respetivamente (Toda et al., 2006; Terzic et al., 2010; Francheschi
et al., 2014). Quando as MMPs são expressas em elevadas quantidades, devido a um desequilíbrio
na sua regulação e/ou excesso de citocinas, estas enzimas degradam outras proteínas para além
daquelas que são o seu substrato, como fatores de crescimento que são essenciais para a
regeneração dos tecidos. Deste modo, o tecido inflamado está constantemente a ser degradado,
impedindo que ocorra regeneração tecidual, perpetuando a inflamação durante meses ou anos
(Gibson et al., 2009), que, por sua vez, pode originar a formação de tumores (Terzic et al., 2010).
Assim, a descoberta de inibidores naturais das MMPs poderá permitir um avanço significativo no
combate a doenças inflamatórias e tumorais.

Procedimento experimental:
Para a medição da atividade inibidora das MMPs, foi utilizado o método fluorimétrico da dye-
quenched (DQ)- gelatina utilizando o kit EnzCheck© (Invitrogen). Este método baseia-se na reação
de proteólise do substrato DQ-gelatina, pelas gelatinases (MMP-9 e MMP-2). O substrato tem uma
fluorescência intrínseca, que é ativada aquando da digestão da gelatina, sendo possível medir a
atividade enzimática das MMPs, na presença ou ausência dos inibidores.
O ensaio da atividade da enzima é realizado em microplacas pretas de 96 poços (Greiner Bio-one).

1. Para um volume final de 160 μL, cada grupo irá adicionar (em μL):

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4

Reagentes
(Controlo) (doxiciclina)* (tremoço)** (aveia)**
MMPs (meio extracelular
40 40 40 40
das células HT29)
DQ-gelatin 40 40 40 40
Amostra 80 (água mili-Q) 80 80 80
*A doxiciclina é um inibidor de metaloproteases
**Extratos de tremoço e de aveia previamente preparados

2. Incubar durante 1 h a 37 °C.

3. Quantificar a atividade da enzima através da fluorescência sendo usado o

espectrofluorímetro, lendo-se a placa a 515 nm.

4. Registar os valores de fluorescência.

Réplica Grupo 1 (Controlo) Grupo 2 (doxiciclina) Grupo 3 (tremoço) Grupo 4 (aveia)

Bibliografia:

Toda, D., Ota, T., Tsukuda, K., Watanabe, K., Fujiyama, T., Murakami, M., Naito, M., Shimizu, N.
(2006). Gefitinib decreases the synthesis of matrix metalloproteinase and the adhesion to
extracellular matrix proteins of colon cancer cells. Anticancer Research, 26(1A), 129-134. PMID:
16475688

Terzic J., Grivennikov S., Karin E., Karin M. (2010) Inflammation and colon cancer.
Gastroenterology, 138 (6),2101-2114. DOI:10.1053/j.gastro.2010.01.058

Franceschi, C., Campisi,,J (2014). Chronic inflammation (inflammaging) and its potential
contribution to age-associated diseases. Journals of Gerontology A. Biological Science Medicine,
69(S1), S4–S9. DOI:10.1093/gerona/glu057

Gibson D, Cullen B, Legerstee R, Harding KG, Schultz G.(2009) MMPs Made Easy. Wounds
International; 1(1),441-447. In: http://www.woundsinternational.com/made-easys/view/mmps-
made-easy-1