Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional De Ciencias Biológicas

Prolongación Manuel Carpio y Plan de Ayala s/n, Miguel Hidalgo, Santo Tomás, 11350 Ciudad de México, CDMX.

Obtención de glucógeno a partir de hígado de rata y su

caracterización química
constante dieléctrica al ser un solvente menos polar
que el agua.
Objetivos
Dejamos en reposo para luego centrifugar.
- Aplicar una estrategia para aislar, purificar
y caracterizar al glucógeno. Ahora desechamos el sobrenadante y
resuspendemos al precipitado con 5mL de agua
destilada y 2 volúmenes de etanol 96°.
Análisis de la técnica
Centrifugamos durante 3 minutos, decantamos y
suspendemos con la menor cantidad de alcohol
Obtención del glucógeno absoluto. Por último, lo dejamos en un recipiente
para dejar secar.
Primero se sacrifica una rata utilizando éter,
teniendo cuidado de no excitarla ya que si esto Una vez seco lo pesamos para determinar el
ocurre el glucógeno empieza a consumirse y el rendimiento.
resultado será un menor rendimiento de este.
Resultados
Se extrae el hígado rápidamente, se pesa y corta Rendimiento.-
en pequeños pedazos para luego colocarlo en un Peso de la charola vacía: 1.4480 g
mortero y triturarlo, añadiendo arena lavada que Peso de glucógeno y charola: 1.7219 g
sirve como superficie de rompimiento para de esta Peso del corte de hígado: 3 g
manera liberar de forma más eficiente el glucógeno Peso de glucógeno: 0.2739 g
que se encuentra dentro de los hepatocitos. *El hígado contiene hasta un 7% de glucógeno
También se añade TCA al 10% en proporción de
1mL/g de tejido; la función de este ácido es
Calculo.-
precipitar muchos compuestos de alta masa
3g ---- 100%
molecular, como son las proteínas y los ácidos
nucleicos, además de desnaturalizar algunas x ---- 7%
enzimas como la fosforilasa, mientras que el x= 0.21g
glucógeno permanecerá en solución. 0.21 g ------ 100%

Una vez que se ha formado una pasta homogénea 0.2739g ----- 131 % rendimiento del glucógeno
la colocamos en un tubo Falcon para centrifugarla
a 2000 rpm durante 5 minutos. Después
decantamos el sobrenadante en un vaso de 250 mL PORCENTAJE
el cual colocamos en baño de hielo. 3g ---- 100 %
0.2739g----- 9.13 % de glucógeno en la porción
Con 10 mL de TCA al 5% lavamos el mortero y de hígado.
pistilo para recolectar el resto del homogeneizado,
y lo transferimos al tubo Falcon que contenía el Tabla 1. Caracterización química del glucógeno
precipitado para resuspenderlo. Nuevamente sin hidrolizar.
repetimos el proceso de centrifugación. Acto
seguido decantamos el sobrenadante en el vaso PRUEBA OBSERVACIÓN
que está en el baño de hielo.
Molish-Udransky +
Añadimos dos volúmenes de etanol de 96° por
volumen de sobrenadante, mezclamos y dejamos
reposar. Puesto que los polisacáridos son Biuret -
considerablemente menos solubles que los
monosacáridos en alcohol diluido, el glucógeno Ninhidrina -
puede separarse de los monosacáridos
contaminantes y de otros compuestos solubles en
agua, precipitándolos con alcohol, tal es el caso de
las proteínas, donde el alcohol disminuye la
Tabla 2. Caracterización química del glucógeno
hidrolizado.
*A: Aldosa NR: No reaccionó
Discusión
Los seres vivos almacenan carbohidratos en forma
de polisacáridos, siendo el glucógeno el
carbohidrato de reserva en la célula animal. El
hígado puede contener un gran porcentaje después
de una ingesta rica en glucosa, representando de
un 7 a 10% de su peso húmedo.
En cuanto al glucógeno muscular rara vez se
encuentra por encima del 2% de su peso húmedo.
Para este caso obtuvimos glucógeno a partir del
hígado de rata, nuestro porcentaje de obtención fue
de 9.13% a partir del peso total de la muestra, lo
que entra dentro del porcentaje teórico reportado.
Sin embargo, para obtener el rendimiento tomamos
como base un 7% de glucógeno (dato teórico), por
ello el rendimiento salió un tanto mayor a un 100%,
también suponemos que este se debe a que la rata
había sido alimentada desde una noche anterior
con galletas marías hasta quizá una hora antes de
su deceso.
En la Tabla 1 se realizaron 3 pruebas para
comprobar la pureza del glucógeno.
La prueba de Molish-Udransky fue positiva, lo que
nos indica que tenemos un carbohidrato. Puesto
que a partir del carbohidrato se forma el furfural el
cual se condensó con el alfa naftol dando un anillo
color violeta en la interfase.
Las pruebas de Biuret y Ninhidrina dieron negativo,
indicando que no hay presencia de tripéptidos en
adelante ni de grupos alfa amino libres, es decir,
descartamos la existencia de proteínas y
aminoácidos en la muestra.
Una vez comprobada la pureza se realiza la
hidrólisis del glucógeno y su posterior
caracterización química.
En los primeros tres tubos se lleva a cabo una
hidrólisis con HCl 1, 2 y 4 N respectivamente. Hay
una rotura al azar de los enlaces glucosídicos, con
la formación de todos los posibles oligosacáridos y
con la conversión final de éstos a glucosa.
En el tubo 4 (testigo) donde solo se agregó agua y
glucógeno no hay hidrólisis, por lo tanto, el
glucógeno sigue intacto como polímero ramificado.
En el tubo 5 y 6 donde al glucógeno se le añadió la
amilasa (contenida en la saliva) se llevó a cabo una
hidrólisis enzimática. Dicha enzima rompe
específicamente enlaces -1,4 entre glucosas,
permitiendo así su liberación.
Prueba de Fehling
Al realizar dicha prueba los tubos de hidrólisis ácida
primero son neutralizados con NaOH al 40%, ya
que la prueba se lleva a cabo en condiciones
alcalinas.
Tanto en estos tubos como en los 5 y 6 se observa
la formación de un precipitado color rojo ladrillo en
el fondo lo cual se interpreta como positivo,
indicando la presencia de azúcares reductores
(reducen los iones cúpricos en medio alcalino) que
en este caso son glucosas, provenientes de la
hidrólisis ácida y enzimática.
El tubo testigo es negativo para Fehling porque el
carbohidrato no sufre hidrólisis.
Prueba de Lugol
- A partir de las pruebas de pureza se
comprobó que la muestra obtenida es un
carbohidrato.
- Este producto es un polímero ramificado
con enlaces α-1,4 cuya hidrólisis genera
un azúcar reductor.
- Obtuvimos glucógeno puro del hígado de
rata.

Bibliografía

Libros electrónicos:

- Véjar, E., “Prácticas de bioquímica

Los tubos con hidrólisis dan negativo, esto porque
se dio el rompimiento de los enlaces glucosídicos,
desapareciendo así la estructura completa del
glucógeno.
descriptiva”, E. UniSon, pp. 151-154,
(2005).
- Peña, A., Arroyo, A., Gómez, A. & Tapia,
R., “Bioquímica”, 2ª Ed. Limusa, pp. 256-
261, (2004).

Por otro lado, en el tubo testigo la estructura del

glucógeno permanece intacta, por ello el yodo
puede entrar dando una coloración rojiza y es así
como interpretamos que el polisacárido es
ramificado.

Prueba de Seliwanoff

Esta prueba se utiliza para diferenciar entre cetosas

y aldosas, las primeras (color rojizo) dan la reacción
más rápido que las segundas (color rosado). En los
tubos con hidrólisis la coloración se dio a partir de
los 25 minutos, por lo que podemos afirmar que se
trata de aldosas, que en este caso hablaríamos de
glucosas (monómeros del glucógeno).

En el tubo testigo no hubo coloración aún después

de los 30 min en el baño maría, debido a que el
glucógeno no está hidrolizado.

Conclusiones