Sunteți pe pagina 1din 458

Controlul analitic

al medicamentelor
Analiza
medicamentului
Generalităţi
Metodele controlului 2

Motivele controlului - (organoleptice)


- producţie ; - fizice
- depozitare ; - control radioizotopic ;
- comercializare ; - controlul proprietăţilor ;
- cercetare/dezvoltare ; - separarea componentelor ;
- litigii - identificarea componentelor ;
- dozarea componentelor
- chimice
- controlul proprietăţilor ;
Obiectul controlului - (separarea componentelor) ;
- identificarea componentelor ;
- materiile prime ; - dozarea componentelor
- intermediarii ;
- produsul finit ; - biologice
- ambalajul - identificarea componentelor ;
- (dozarea componentelor)
3
Metode fizice (controlul proprietăţilor fizice)
Controlul proprietăţilor fizice (fără scanarea unei mărimi)
solubilitatea, punct de topire, punct de fierbere, punct de
picurare, interval de distilare, indice de refracţie, putere
de rotaţie, studiul formei de cristalizare (polimorfism),
vâscozitate (dinamică, cinematică, intrinsecă etc.), …
Controlul proprietăţilor fizice (cu scanarea cel puţin a unei
mărimi fizice sau geometrice)
spectrofometrie optică de absorbţie (IR, UV, VIS, AAS),
spectrofotometrie de emisie (Raman, de fluorescenţă, AES),
difracţie de raze X (diferite tehnici), rezonanţa magnetică
nucleară (NMR), rezonanţa electronică de spin (ESR),
spectrometrie de masă (diferite tehnici), metode termice de
analiză (TGA, DTA, DSC), specrofotometrie ORD şi CD,

4
Separarea componetelor

- cromatografie (TLC, HPLC, GC)


- electroforeză (capilară, CE)
- focalizare izoelectrică (IEF)
- izotachoforeză (ITP)
- cromatografie electrocinetică micelară (MEKC)
- extracţie
- extracţie solidă (SPE)
- extracţie fluidă supercritică (SFE)
- recristalizare (fracţionată)
- distilare (simplă sau la vid)
- rectificare
- distilare moleculară, …etc.
5
Metode fizice şi fizico-chimice de control
prezentate în Farmacopeea Europeană
- determinarea potenţiometrică a pH-lui
- determinarea pH-lui pe baza culorii indicatorilor
- densitate relativă
- indice de refracţie
- rotaţie optică
- vâscozitate
- interval de distilare
- punct (temperatura) de fierbere
- determinarea apei prin distilare
- punct (temperatura) de topire
- punct (temperatura) de picurare
6
Metode fizice şi fizico-chimice de control
prezentate în Farmacopeea Europeana

- punct de solidificare
- titrare amperometrică
- titrare potenţiometrică
- fluorimetrie
- spectrometrie de emisie atomică (AES, ICP etc.)
- spectrometrie de absorbţie atomică (AAS)
- spectrofotometrie de absorbţie în infraroşu (IR)
- spectrofotometrie de absorbţie în ultraviolet şi vizibil (UV, VIS)
- cromatografie pe hârtie
- cromatografie pe strat subţire (TLC)
7
Metode fizice şi fizico-chimice de control
prezentate în Farmacopeea Europeană

- gazcromatografie (inclusiv tehnica “head space”) (GC)


- cromatografie lichidă (LC, TLC, HPLC etc.)
- cromatografie de excludere sterică (gel-filtrare)
- electroforeză (gel, capilară) (CE)
- pierdere de greutate la uscare
- spectrometrie de rezonanţă magnetică nucleară (NMR)
- analiza termogravimetrică (TGA)
- presiune osmotică / osmolalitate
- determinarea concentraţiilor cu electrozi ion-selectivi
- spectrometrie de fluorescenţă cu raze X (XRF)
8

Metode fizice şi fizico-chimice de control


prezentate în Farmacopeea Europeană
- conductibilitate electrică
- spectrofotometrie în infraroşu apropiat şi mijlociu (NIR, IR)
- spectrometrie de dicroism circular (CD)
- spectrometrie de masă (MS)
- carbon organic total
- cromatografie fluidă supercritică (SFC)
- tehnici de separare cromatografice
- spectrometrie Raman
- focalizare izoelectrică (IEF)
9
Metode fizice şi fizico-chimice de control suplimentare
prezentate în alte lucrări de specialitate

- calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)


- analiză termică diferenţială (DTA)
- rezonanţă electronică de spin (ESR , EPR)
- difracţie de raze X (diferite tehnici, probe policristaline sau
monocristaline)
- spectrometrie Mössbauer
- extracţie solidă (SPE)
- cromatografie fluidă supercritică (SFC)
- cromatografie electrocinetică micelară (MECC)
- tehnici analitice cu legare specifică competitivă (RIA ,
DELFIA , ELISA etc.)
- tehnici tandem (GC/MS , HPLC/MS , HPLC/FTIR etc.)
10

Procedee de control chimic


- reacţii de identificare calitativă
- metode titrimetrice de dozare specifică a componentelor
- metode titrimetrice de determinare a unor parametri globali
(indice de aciditate, indice de ester, indice de hidroxil, indice
de iod, indice de peroxid, indice de saponificare, substanţe
nesaponificabile)
- determinarea azotului aminic din amine aromatice primare
- determinarea azotului prin dezagregare cu acid sulfuric
- titrare complexonometrică
- determinarea apei
- determinarea aluminiului şi calciului în vaccinuri adsorbite
- determinarea fenolului în imunoseruri şi vaccinuri
11
Procedee de control chimic

- determinarea proteinelor şi acizilor nucleici în vaccinuri cu


polizaharide
- determinarea proteinelor, acizilor nucleici, fosforului,
grupării O-acetil, hexozaminelor, metilpentozelor, acizilor
uronici, ribozei şi acidului sialic în vaccinuri cu polizaharide
- determinarea monoxidului şi dioxidului de carbon în gaze
- determinarea monoxidului şi dioxidului de azot în gaze
- determinarea oxigenului şi apei în gaze
- determinarea dioxidului de sulf în gaze
- determinarea substanţelor oxidante
- determinarea proteinelor totale
- determinarea acidului acetic în peptidele sintetice
12
Procedee de control chimic
- controlul limitelor (amoniu, arsen, calciu, cloruri, fluoruri,
magneziu şi alte metale alcalino-pământoase, metale grele, fier,
plumb, fosfaţi, potasiu, sulfaţi, aluminiu, formaldehida, steroli
în uleiuri grase, solvenţi reziduali, oxid de etilenă, dioxan,
N,N-dimetilanilină, acid 2-etilhexanoic)

Procedee ale controlului farmacognostic


- cenuşa insolubilă în acid clorhidric
- indice de umidificare
- apa şi esteri străini în uleiuri esenţiale
- acizi grasi şi uleiuri sicative în uleiuri esenţiale
- 1,8-cineol în uleiuri esenţiale
- uleiuri esenţiale în preparate vegetale
- reziduul uscat al extractelor
13

Secvenţa operaţiilor de control

- prelevarea unei probe (semnificative)


- efectuarea testelor preliminare (deseori organoleptice)
- separarea probei (amestec) în componente individuale
- identificarea componentelor
- determinarea cantitativă a componentelor
- calificarea probei şi eliberarea buletinului de analiză

În funcţie de problema concretă urmărită, etapele


de mai sus sunt parcurse integral sau numai parţial
14

Prelevarea probelor
în vederea efectuării
controlului analitic
15
Prelevarea probelor
« Probele prelevate pentru identificarea calitativă şi determinarea
cantitativă a componentelor produselor farmaceutice trebuie să constituie
o imagine semnificativă a lotului sau a seriei analizate » (FR-X)
Noţiuni definite şi utilizate în FR-X, referitoare la prelevare:
- lot (o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară, din
care se obţin una sau mai multe serii de produse)
- serie (totalitatea unităţilor de produs obţinute în condiţii
identice, într-un singur ciclu de operaţii)
- recipient (conţine unităţile de produs care constituie o serie,
ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.)
- ambalaj (conţine recipientele grupate adecvat)
FR-X formulează reguli privind prelevarea din:
- depozit
- din farmacii
- din industrie
- din puncte farmaceutice
16
Prelevarea probelor

Acid salicilic (materie prima) O cantitate precizata: lot

sublimare, acetilare, recristalizare – un ciclu de operatii

Acid acetilsalicilic cristalin Cantitatea obtinuta: serie

comprimare, includere in “blister” (ex. 10 compr./blist.)

Comprimate grupate intr-un “blister” recipient


gruparea unui numar de “blisrere (ex. 2) intr-o cutie
impreuna cu descrierea produsului
“Blistere” grupate in aceeasi cutie, impreuna cu
accesorii (ex. descrierea produsului). ambalaj

Protocoalele de analiza contin reguli specifice privind prelevarea de


proba din unitatile mentionate (lot, serie, recipient, ambalaj)
17
Prelevarea probelor dintr-un depozit

Prelevarea dintr-un lot: Cantitate: de 4 ori cea


- probe lichide (omogenizare) necesară din care:
- probe solide sau păstoase - 2 părţi: proba propriu-zisă
(diferite adâncimi) - 2 părţi: contraproba

Probele/contraprobele: ambalate, sigilate, etichetate


Eticheta cuprinde:
- denumirea produsului
- numărul de ordine al lotului
- provenienţa materialului
- data prelevării probei
- numărul procesului verbal întocmit
- cantitatea prelevată
- semnătura celui care a prelevat proba
18
Prelevarea probelor dintr-un depozit
Prelevarea dintr-o serie (poate fi distribuita in recipiente diferite)

Se prelevează din recipiente diferite:


probă reprezentativă pentru seria respectivă

Condiţiile de prelevare sunt stabilite de producător, în


conformitate cu normativele în vigoare

Cantitatea prelevată din unităţi:


- alese aleator
- de 3 ori cea necesară efectuării analizelor
Numărul de unităţi (necesar analizei) din serie:
- în corelaţie cu monografia individuală
- în corelaţie cu monografia generală a formei farmaceutice
- în corelaţie cu monografia metodei de analiză
Prelevarea probelor din farmacii 19

- identificarea substanţei active (la masa de analiză)


- analiza completă (în laborator de control)

Control la masa de analiză Control de laborator


Cantitatea prelevată: Cantitatea prelevată:
de 3 ori cea necesară pentru
necesară pentru o analiză analiză
- 2 părţi : proba propriu-zisă
- 1 parte : contraprobă

Eticheta probelor/contraprobelor ambalate şi sigilate conţine:


- denumirea produsului
- denumirea unităţii respective
- numărul şi data procesului verbal
- cantitatea prelevată
- semnătura celui care a prelevat proba
20
Prelevarea pentru controlul produselor din industrie

Cantitatea prelevată:
De 3 ori cea necesară pentru analiză
- 2 părti : proba propriu-zisă
- 1 parte : contraprobă

Eticheta probelor/contraprobelor ambalate şi sigilate conţine:


- denumirea produsului
- denumirea unităţii respective
- numărul şi data procesului verbal
- cantitatea prelevată
- semnătura celui care a prelevat proba
21
Prelevare pentru controlul produselor elaborate în farmacii

Cantitatea prelevată:
De 2 ori cea necesară pentru analiză
- 1 parte : proba propriu-zisă
- 1 parte : contraprobă

Eticheta probelor/contraprobelor ambalate şi sigilate conţine:


- denumirea produsului
- denumirea unităţii respective
- numărul şi data procesului verbal
- cantitatea prelevată
- semnătura celui care a prelevat proba
22

Metode de control al
proprietăţilor fizice
simple
23
Controlul culorii
Control vizual (Farmacopeea Română)

substanţele solide - examinate fără prelucrare prealabilă,


pe o suprafaţă mată, albă
substanţele lichide - examinate în comparaţie cu apa sau
cu etaloane de culoare

Etaloane de culoare
- soluţie etalon de cobalt (6,5 % CoCl2 în HCl 1 %);
- soluţie etalon de fier (5 % FeCl3 în HCl 1 %);
- soluţie etalon de cupru (6,5 % CuSO4 în HCl 1%);
- soluţie etalon cu dicromat de potasiu (0,55 % K2Cr2O7
în H2SO4 1 %).
24
Controlul culorii
Control optic (în special pentru probe solide)
- determinarea componentelor de culori de bază;
- determinarea spectrului de reflexie
Culoarea unei suprafeţe se poate exprima (cu aproximaţie
bună) ca un amestec, realizat în raport corespunzător, de trei
culori de bază. Prin amestecarea celor trei culori de bază se
poate obţine o mulţime de nuanţe diferite. Cele trei culori de
bază se pot stabili convenţional.
Unul din convenţii (sistemul R.G.B.) se bazează pe culorile:
roşu ("Red", 700,0 nm), verde ("Green", 546,1 nm) şi albastru
("Blue", 435,8 nm).
Există şi alte sisteme, bazate pe alte nuanţe de bază, de
exemplu sistemul C.I.E.
Determinarea raportului de amestecare a culorilor de bază
se realizează cu aparate optice speciale.
25
Solubilitatea

Volum de solvent (ml) necesar


Expresii pentru dizolvarea a 1 g substanţă
convenţionale (FR) solidă sau 1 ml substanţă lichidă,
la 20  2 oC
foarte uşor solubil cel mult 1 ml
uşor solubil de la 1 ml la 10 ml
solubil de la 10 ml la 30 ml
puţin solubil de la 30 ml la 100 ml
foarte puţin solubil de la 100 ml la 500 ml
greu solubil de la 500 ml la 1000 m
foarte greu solubil de la 1000 ml la 10000 ml
practic insolubil mai mult de 10000 ml
26
Densitatea

Densitatea relativă . . .
. . . raportul dintre masa unui volum de substanţă şi masa unui
volum egal de apă, la 20 oC ( d 2020 ) sau la 4 oC ( 20 ) (mărimi
d4
adimensionale) o
m (subst. 20 C)
20 
d 20
m (apã 20 oC)

Densitatea absolută (masa volumică) . . .


. . . masa unităţii de volum din substanţa examinată. În S.I. se
exprimă în kg/m3 ; unităţi tolerate: g/cm3 ; kg/l

masã
20 
volum (20 oC)
27
Densitatea
Masurarea densitatii (cu picnometru)
Proba lichida
m0 = masa picnometrului gol ;
mr = masa picnometrului umplut cu lichidul de referinta (r)
m = masa picnometrului umplut cu proba lichida () ; V = volumul picnometrului
dr = densitatea relativa a lichidului in raport cu lichidul de referinta

m r  m0 m  m0
V 
r 
m  m0  m  m0
  r  ; dr  
m r  m0 r m r  m 0
28
Densitatea
Masurarea densitatii (cu picnometru)

Proba solida
m0 = masa picnometrului gol
mR = masa picnometrului umplut cu lichidul de referinta (R)
mS = masa picnometrului cu proba solida introdusa
mSR = masa picnometrului continand proba solida si umplut cu
lichidul de referinta
 = densitatea absoluta a probei solide
dR = densitatea relativa a probei solide in raport cu lichidul de
referinta
29
Densitatea
Masurarea densitatii (cu picnometru) – Proba solida

  VS  mS  m 0
VL  R  mSR  m 0
m R  m0
V  VS + VL
R

mS  m 0
  R 
m R + mS  mSR  m 0
 mS  m 0
dR  
R m R + mS  mSR  m 0
30
Densitatea
Masurarea densitatii lichidelor (cu balanta Mohr-Westphal)
31
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)
. . . proprietatea substanţelor optic active de a roti planul de
polarizare al luminii plan-polarizate. Activitatea optică se datorează
asimetriei care se poate manifesta la nivelul:
- molecular (în stare solidă, în soluţie, în stare gazoasă);
- supramolecular (în stare cristalină sau în soluţii de
complecşi intermoleculari)
Asimetrie la nivel molecular:
- cu un (sau mai mulţi) atomi cu configuraţie spaţială "chirală"
("centru de chiralitate") ( în special în cazul atomului Csp3 )
- asimetrie moleculară globală (fără un centru bine definit de
chiralitate)
- asimetrie alenică
- asimetrie spiranică la compuşi organici
- asimetrie atropică
Putere de rotaţie 32
(a planului de polarizare al luminii plan-polarizate)

Plan de simetrie
(oglindire)

W W

Y C Z Z C Y

X X

enantiomer (+) enentiomer (-)

Chiralitate moleculară cu un singur centru de disimetrie:


o singură pereche de enentiomeri (relaţie obiect-imagine în oglindă)
Putere de rotaţie 33
(a planului de polarizare al luminii plan-polarizate)

Omeprazol
(amestec racemic) Esomeprazol

Pantoprazol Rabeprazol
Putere de rotaţie 34
(a planului de polarizare al luminii plan-polarizate)

Omeprazol

atomul de sulf
35
Planul de oscilatie al vectorilor intensitatii de camp
electric si magnetic la o radiatie plan-polarizata
Ansamblul de vectori intensitate
camp electric-intensitate camp
magnetic este chiral
Dextrogir Levogir
(D) (L)

Activitate optica: rotatia planului de oscilatie a



vectorului E in jurul directiei de propagare (axa z)
36
Putere de rotaţie
(a planului de polarizare al luminii polarizate)

Reprezentarea schematică a unui polarimetru

F : filtru cu transparenţă selectivă la l = 589,3 nm


P / A : prisme “nicol” pentru polarizare / analizare
F1 / F2 : fanta de intrare / ieşire a radiaţiei polarizate
S : sursă de lumină “albă”
D : detector (senzor) de radiaţie
37
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)

Măsura activitaţii optice a mediului traversat de lumina


plan-polarizată: unghiul a cu care este rotit planul de
polarizare în jurul direcţiei de propagare OZ.

Unghiul de rotaţie a depinde:


- de lungimea de undă a luminii incide ( l )
- de natura substanţei chirale ( putere "proprie" de rotaţie,
numită şi "putere rotatorie specifică", [a] )
- de grosimea stratului de material chiral ( d ), traversat de
lumina polarizată
- temperatura materialului chiral

a  [a]D  c  d
20
Pentru soluţii :

a  [a]D d
20
Pentru lichide :
38
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)

Unitatea de măsură pentru puterea rotatorie specifică :

În unităţi SI
a(rad)
[a]SI  ; [a ]  rad  m 2  kg 1
d(m)  c(kg / m )
3 SI

α(rad)
[α]SI  ; [α ]  rad  m 2  kg 1
d(m)  ρ(kg/m )
3 SI

În unităţi tolerate
a(grade)
[a ]  ; [a]  grade  cm3  dm 1  g 1
d(dm)  c(g / cm )
3

a(grade)
[a ]  ; [a]  grade  cm3  dm 1g 1
d(dm)  (g / cm )
3
39
Putere de rotaţie (a planului de polarizare al luminii)

Conversii între cele două sisteme de unităţi:


[a]SI = 5729,578.[a] ; [a] = 0,17453.10-3.[a]SI

Dacă în sistemul tolerat concentraţia este exprimată în procente


(m/V, adică grame /100 ml), atunci relaţiile de conversie devin:
[a]SI = 57,29578.[a] ; [a] = 1,7453.10-2.[a]SI

Unghiul de rotaţie a se măsoară frecvent la lungimea de


undă a radiaţiei de rezonanţă a vaporilor de sodiu (linia “D” a
sodiului, l = 589,3 nm), la temperatura de 20 oC ; în consecinţă
20
şi rotaţia specifică se exprimă pentru aceste condiţii: [a]D
Putere de rotaţie 40
(a planului de polarizare al luminii polarizate)
Măsurarea unghiului de rotaţie permite:
- identificarea unei componente chirale în amestec cu
alte componente (nechirale)
- determinarea concentraţiei unei componente chirale
în amestec cu alte componente (nechirale)
Mediu (condiţii)
Substanţa chirală Rotaţia specifică
de măsurare
Riboflavină -115 ~ -135 NaOH 0,05 M
Acetat de prednisolonă +112 ~ +119 dioxan
Clorhidrat de noscapină +38,5 ~ +44,0 HCl 0,1 M
Sulfat de morfină -107 ~ -110 apa
Digoxină +10 ~ +13 piridină anhidră
Tetraciclină -260 ~ -280 HCl 0,1 M
41
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

O manifestare indirectă a afinităţii moleculelor de solvent faţă de


cele ale solutului este tendinţa solventului de a pătrunde într-o
soluţie a solutului, micşorând astfel concentraţia solutului în
soluţie.
42
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

Relaţia van’t Hoff


(pentru soluţii diluate, faţă de solvent pur)
P = R.T.C în care P este presiunea osmotică ( Pa )
R este constanta universală a
gazului ideal ( R = 8,311 J/(mol.K) )
C este concentraţia de echilibru a
solutului ( exprimată în nr. de moli/m3 )

Forma relaţiei van’t Hoff, în care apare concentraţia molară ( Cm )


a solutului ( exprimată în nr. de moli/dm3 ) este :
P = R.T.Cm.1000
43
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

Hematiile sunt afectate în mod special de diferenţa de presiune


dintre compartimentul intra- şi extracelular.
Într-un mediu cu presiunea osmotică mai mică decât cea
din interiorul hematiilor (mediu “hipotonic“), hematiile se sparg
(fenomenul de numeşte “hemoliză“).
Un mediu exterior cu presiunea osmotică mai mare decât
cea a compartimentului interior al hematiilor este “hipertonic“.
Mediul exterior, care este în echilibru cu interiorul
hemariilor, în sensul că între cele două feţe ale membranei
hematiilor nu apare diferenţă de presiune, este “izotonic” cu
mediul intern al hematiilor.
44
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

Toate medicamentele administrate în forma de soluţii injectabile sunt


izotonizate, fie la faza de condiţionare, fie chiar înainte de utilizare,
cu componente inerte din punct de vedere farmaceutic (cu NaCl ,
glucoză etc.)
La baza calculării cantităţii necesare de compus izotonizant stă
următoarea observaţie (practică): o soluţie 0,2308 molară a unui solut
nedisociat este izotonică cu serul sanguin. Rezultă că suma
presiunilor osmotice ale componentelor dintr-o soluţie izotonică este
egală cu cea a unei soluţii în care concentraţia unui solut ne-disociat
este 0,2308 mol/litru.
( Cm )i : concentraţia molară a
componentei “i”
K qi + 1
 (Cμ )i  2  0,2308 qi : numărul fragmentelor (ionice) în
i 1 care se disociază o moleculă la
dizolvare
45
Presiune osmotică. Soluţii izotonice
Exemplu
Să se calculeze masele de vitamină B1 (mB1 , clorhidrat de
tiamină) şi clorură de sodiu ( mNaCl ) necesare pentru a prepara
500 ml ( V = 0,5 l ) soluţie izotonică, cu concentraţia de 2,5 %
(m/v) în raport cu clorhidratul de tiamină.

+
.
2Cl H2O

q B1 + 1
g 2
M = 355,29 mol 2
46
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

Concentraţia molară impusă pentru clorhidratul de tiamină este :

2,5 mol
(C ) B1   0,07036
0,1  355,29 l
q NaCl + 1
Pentru clorura de sodiu : M NaCl  58,45 ;  1,5
2
Rezultă :
m NaCl  1,5
0,07036  2 +  0,2308
58,45  0,5
m NaCl  1,7550 g
47
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

Dacă izotonizarea ar fi fost realizată cu glucoză


(substantă care nu disociază în ioni la dizolvare în apă) în
loc de clorură de sodiu, atunci :

q glucoza + 1
M glucoza  180,16 ; 1
2
m glucozã
0,07036  2 +  0,2308
180,16  0,5
m glucozã  8,1144 g
48
Presiune osmotică. Soluţii izotonice
Exemplu
Să se determine masa de clorură de sodiu ( mNaCl ) aflată în 250 ml
soluţie izotonică cu următoarea compoziţie impusă :
clorhidrat de morfină . . . . . . . . . . 10 g
bromhidrat de scopolamină . . . . . 0,2 g
clorhidrat de efedrină . . . . . . . . . . 15,0 g
clorură de sodiu . . . . . . . . . . . . . . . 4.( mNaCl ) g
apă distilată ad . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml

Rezolvare
Mase moleculare : Concentraţiile molare impuse :
clorhidrat de morfină : 375,84 clorhidrat de morfină : 0,02661
bromhidrat de scopolamină : 438,32 bromhidrat de scopolamină : 0,00046
cloridrat de efedrină : 201,69 clorhidrat de efedrină : 0,07437
clorura de sodiu: 58,45
49
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

Mase moleculare : Concentraţiile molare impuse :


clorhidrat de morfină : 375,84 clorhidrat de morfină : 0,02661
bromhidrat de scopolamină : 438,32 bromhidrat de scopolamină : 0,00046
cloridrat de efedrină : 201,69 clorhidrat de efedrină : 0,07437

0,2308  0,02661  1,5  0,00046  1,5  0,07437  1,5


m NaCl   58,45  0,25
1,5
m NaCl  0,7661 g

Deci în 250 ml soluţie izotonică, în care concentraţiile celorlalte


componente sunt impuse, cantitatea de clorura de sodiu este 0,7661 grame.

O soluţie apoasă de clorură de sodiu (unicul solut), este izotonică cu


eritrocitele umane, dacă conţine aproximativ 0,9 % m/v NaCl.
50
Presiune osmotică. Soluţii izotonice

m NaCl  1,5
 0,2308 ; m NaCl  0,89858  0,9
58,4  0,1

Controlul izotonicităţii unei soluţii (de exemplu a unei soluţii


injectabile) în practică se efectuează prin teste experimentale,
iar calculele bazate pe relaţiile descrise au utilizare mai puţin
frecventă.
În vederea controlului izotonicităţii unei soluţii, se introduce în
soluţia studiată o hematie umană sau de iepure şi se urmăreşte,
prin observare la microscop, tendinţa de umflare sau de
restrângere a acesteia.

Atenţie ! Relaţia de calcul din FR-X ( pag. 511 )


este greşită !
51

Metode de separare
aplicate în controlul
analitic al
medicamentelor
52

Metode de separare

- metode de extracţie selectivă – se bazează pe dizolvarea


selectivă a componentelor din amestecul analizat prin alegerea
convenabilă a unor solvenţi potriviţi sau a unor condiţii de pH
adecvate
- metode cromatografice – se bazează pe partiţia diferenţiată a
componentelor probei analizate între două medii nemiscibile
(“faza staţionară” şi “faza mobilă”), fenomen care determină
mobilităţi diferite ale componentelor în faza staţionară
- metode electrocinetice – se bazează pe mobilitatea diferenţiată
a componentelor chimice posedând sarcină electrică (ioni) în
condiţii adecvate de câmp electric, aplicat ca atare sau în
combinaţie cu pH potrivit (sau cu un gradient de pH)
53

Metode de extracţie selectivă (metode mai cunoscute)

- metoda Stas – Otto – Ogier


- metoda Dragendorff
- metoda Florence
- metoda Street (cu wolframat de sodiu)
- metoda Griffon – Le Breton
- metoda Fabre
- metoda Clarke
54

Jean-Servais Stas Friedrich Julius Otto


(fizician si chimist belgian) (chimist si farmacist german)
(1813 – 1891) (1809 – 1870)
Ausmittelung der Gifte (1856)
55
Schema de separare dupa Stas - Otto

250 mg proba + 10 ml H2O + H2SO4 (pH 1) 1

Faza Et2O Extr. 3x20 ml Et2O Faza H2O


4 2

Faza Et2O Extr. 3x5 ml Neutralizare cu NaHCO3 10 %


3 8
Fractia A NaOH 0,5 M Acidulare cu ac. tartric (pH 4-5)

Faza H2O Faza CHCl3 Extr. 3x20 ml


9
Fractia C CHCl3

Acidulare cu 10
5
H2SO4 dil. Faza H2O
7
Faza Et2O
Extr. 3x20 ml Et2O Faza H2O
Fractia B
6 (Reziduu)
56
Schema de separare dupa Stas - Otto

13
Faza Et2O
Faza H2O
Fractia D

Alcalinizare cu NaOH
11 Extr. 3x20 ml Et2O 12
3M (pH 11-14)

Faza H2O
16 15
Faza Et2O Extr. 3x20 ml cu amestec Neutralizare cu H2SO4 dil.
14
Fractia E CHCl3 si i-PrOH (3 + 1) + NH4OH 6M (pH 11-14)

Faza H2O
17
Fractia F
57
Rp. nitrofuranoza (0,23 %), glicerina, alcool cetilic,
1
polietilenglicol, Me-paraben, Pr-paraben

2 Dizolvare la cald in amestec acetona - dimetilacetaldehida


5
Reziduu
3 Agitare cu solutie alcoolica de uree. Filtrare compusi de incluziune:
uree + alcool cetilic
Et2O Reziduu uree + propilenglicol
Filtrat
nitrofuranoza
glicerina Filtrare Filtrat Reziduu de
Me-paraben 6 distilare
Pr-paraben nitrofuranoza
7 Distilare glicerina
acetona
di-Me-acetaldehida Me-paraben
Pr-paraben
4 Distilat
acetona
alcool cetilic
9 (uree)
acetona
di-Me-acetaldehida 8
58

Et2O 11
10 Faza Et2O
8 Extractie Me-paraben
Pr-paraben

Faza H2O
nitrofuranoza
12
glicerina
(uree)

Determinarea cantitativa prin


spectrofotometrie de absorbtie la 13
lungimea de unda 375 nm
59

Proba primara (comprimat) 1


2
Filtrat Triturare, dizolvare (apa 50 oC), filtrare Reziduu
3 4
Na2CO3 Reziduu
Control metale grele Dizolvare (EtOH 50 oC)
5% amidon
filtrare
6 sulf
Filtrat excipienti
Controlul limitei Filtrare
anorganici 5 Filtrat
de anioni (FR X)
7 Reziduu
11 Evaporare la sec
8 Mineralizare 10
Controlul 12 Dizolvare
anionilor
9 Dizolvare
anorganici
si oxizilor 13 Secventa Stas-Otto
60
Metode de separare cromatografice

Metodele cromatografice de separare a componentelor unui amestec


se bazează pe partiţia diferenţiată a componentelor probei analizate
între două medii nemiscibile (faza “staţionară” şi “faza mobilă”),
fenomen care determină mobilităţi diferite ale componentelor.

Mobilitatea diferită a componentelor se manifestă prin deplasare


cu viteze diferite de-alungul “suportului cromatografic” .

Suport cromatografic:
- hârtie poroasă (cromatografie pe hârtie)
- strat subţire depus pe un suport plan (TLC)
- coloană umplută cu faza staţionară
- tub capilar cu suprafaţa internă acoperită cu faza staţionară
61
Clasificarea metodelor cromatografice
Criterii de clasificare:
1) după starea de agregare a fazelor mobilă (FM) şi
staţionară (FS)
2) după polaritatea fazelor (FM şi FS)
3) după mecanismul de interacţiune a componentelor
probei cu FM şi FS

1) După starea de agregare a fazelor


1.1 Faza mobilă gazoasă (gazcromatografie, GC)
1.1.1 Faza staţionară solidă (solid - gaz)
1.1.2 Faza staţionară lichidă (lichid - gaz)
1.2 Faza mobilă lichidă
1.2.1 Faza staţionară solidă (solid - lichid)
1.2.2 Faza staţionară lichidă (lichid - lichid)
62
Clasificarea metodelor cromatografice

2) După polaritatea fazelor


2.1 Cromatografie cu faza normală (FS polară, FM nepolară)
2.2 Cromatografie cu faza inversă (FS nepolară, FM polară)

Exemple

FS polare : silicagel, oxid de aluminiu, celuloză, “Florisil”


FS nepolare : diferite tipuri de silicagel silanizat

FM polare : metanol, acetonitril, etanol, apă, tetrahidrofuran


FM nepolare : diclormetan, cloroform, hexan, benzen, toluen
63
Clasificarea metodelor cromatografice
3) După mecanismul de interacţiune a componentelor cu FM şi FS
3.1 Cromatografie de adsorbţie (adsorbţia componentelor pe FS
solidă, polară)
3.2 Cromatografie de partiţie (partiţia componentelor între FS şi
FM , ambele lichide dar nemiscibile)
3.3 Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni (interacţiuni
ionice între componente şi FS – răşină solidă)
3.4 Cromatografie de gel-permeaţie (gel-filtrare) (potrivire sau
nepotrivire sterică a moleculelor componentelor în cavităţile
unui gel - FS - inert; separare după criteriul volumelor
moleculare)
3.5 Cromatografie de afinitate (interacţiuni specifice, de natură
biochimică, între componente şi FS: interacţiuni de tipul
antigen-anticorp, enzimă-substrat, enzimă-coenzimă,
enzimă-inhibitor)
64
Istoric
Friedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867)
farmacist şi chimist - separări pe hârtie de filtru
"Der Bildungstrieb der Stoffe" (1855)
Mikhail Semenovich Tswett (1872 - 1919) botanist rus
în 1903: separarea componentelor din extract de frunze verzi
FS: Al2O3 si CaCO3 (umplutură polară)
FM: eter de petrol (eluent nepolar)
propune (1906) termenul de "Cromatografie"
Zechmeister (1936): apare prima carte care tratează cromatogarfia
Egon Stahl (1956): bazele cromatografiei în strat subţire (TLC) ;
în 1975 firma "Merck" lansează plăci cromatografice de performanţă
Martin & James : bazele teoretice ale cromatografiei ; separarea acizilor
graşi
Martin & Singe - în 1952 - premiu Nobel
Cs. Horvath ~ 1960 - cromatografia lichida de performanţă înaltă (HPLC)
65

Friedlieb Fredinand Runge


(1795 - 1867) Mikhail Semenovich Tswett în 1911
(1872 - 1919)
66

Clădirea Universităţii din Varsovia unde M. S. Tswett a


descoperit metoda cromatografică de analiză (1903)
67

Placa memorială cu inscripţia:


“Între 1901 – 1906 în această clădire a descoperit
Dr. Mikhail S. Tswett cromatografia”
semnătura: “Chimistii analişti polonezi”
68

Laszlo Zechmeister Egon Stahl


(1889 - 1972)
69
Separare cromatografică realizată de M.S. Tswett

Eluent: eter de petrol


Umplutura: CaCO3

Noţiune importantă : timp / volum de retenţie


70
Caracterizarea mobilităţii cromatografice a componentelor

- prin distanţa (xi) parcursă de componenta " i " într-un interval de


timp dat (comun pentru toate componente) - în special la
cromatografia în strat subţire
- prin timpul necesar (ti - timp de retenţie al componentei " i ") pentru
parcurgerea lungimii L a sistemului cromatografic - în special la
cromatografia în coloană

xi
(R F )i   1 ; (hR F )i  (R F )i  100
xF
Literatura de specialitate contine
 
(R M )i  lg  1  1 numeroase valori RF , RM si hRF
 (R )  pentru substante farmaceutice,
 F i 
masurate in conditii de executie
specificate.
71

Caracterizarea mobilităţii cromatografice a componentelor


Mobilitatea cromatografică este exprimată prin valorile RF sau RM
RF este, prin definiţie, mărime pozitivă, subunitară, adimensională
RM are domeniul valorilor (- ∞ , + ∞) (adimensională)
RM a fost propus de Bate-Smith E. C. şi Westall R. G. C. în 1950

Dependenţa valorilor RF şi RM unei


componente de polaritatea ei
Caracterizarea mobilităţii cromatografice a componentelor 72

- prin distanţa (xi) parcursă de componenta " i " într-un interval de timp dat
(comun pentru toate componente) - în special la cromatografia în strat subţire
- prin timpul necesar (ti - timp de retenţie al componentei " i ") pentru parcurgerea
lungimii L a coloanei cromatografice
73
Cromatografie în strat subţire cu zona de preconcentrare
74

Cromatografie în strat subţire bidimensională


75
Separarea TLC a unor analgezice

FS: ADAMANT UV 254


FRONT (70 mm) FM: CHCl3 / acetat de etil (1 : 1 v/v)
Volum aplicat: 1 ml

Ibuprofen (1 %) ; Rf = 0,57

Naproxen (0,5 %) ; Rf = 0,42


Diclofenac (0,5 %) ; Rf = 0,30
Acid acetilsalicilic (0,5 %) ; Rf = 0,12
Tolmetin (1 %) ; Rf = 0,05
START (0 mm)
76
Separarea TLC a unor barbiturice
FS: ADAMANT UV 254
FRONT (73 mm) FM: CHCl3 / acetona (95 : 5 v/v)
Volum aplicat: 1 ml

Tiamilal (0,5 %) ; Rf = 0,69


Tiopental (1 %) ; Rf = 0,65

Hexobarbital (5 %) ; Rf = 0,41

Pentobarbital (1 %) ; Rf = 0,26
Fenobarbital (1 %) ; Rf = 0,18

START (0 mm)
77
Cromatografia cu coloana (umpluta sau capilara)

Reprezentarea tipica a unei cromatograme


78
Forma şi caracteristicile unui “peak” cromatografic
Forma unui "peak" cromatografic: curbă de distribuţie tip Gauss.

2
1  t t 0 
  
2  σ i 
C i (t)  f(Q v , σ i , m i )  e

mi
La HPLC : f(Q v , σ i , m i ) 
2  π  Qv  σi
Forma şi caracteristicile unui “peak” cromatografic 79

Δt inf  2  σ
Δt inf  0,850  Δt 0,5
Δt b  4  σ
Δt b  1,700  Δt 0,5
Δt e  2  2  σ
Δt e  1,201  Δt 0,5


A   C(t )  dt  2      Cmax  1,065  t 0,5  Cmax

80
Abaterea de la liniaritate a izotermei de retentie cromatografica
81
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic
Caracterizarea performanţei în raport cu componenta ” i ” :
numărul de talere teoretice, Ni , în raport cu componenta
respectivă.

Lungimea sistemului cromatografic L


Ni  
HETPi Hi
82
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic

Valoare mare pentru Ni înseamnă eficienţă bună de separare a


sistemului pentru componenta " i " (în timpul parcurgerii lungimii
L a sistemului, componenta " i "este implicată într-un număr mare
de echilibre de partiţie)

2
 ti 
2 2
 ti   ti 
N i     5,55     8   
 i   (t i )0,5   (t i )e 
2 2
 ti   ti 
 16     4 
 (t i ) b   (t i )int 
83
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic

Eficienţa intrinsecă (independentă de natura componentelor) a


unui sistem cromatografic se exprimă prin numărul limită de
talere teoretice (N)
N  lim Ni
t 
i
Ex. - în gazcromatografie “ N ” este de ordinul 100.000
- în HPLC numarul “ N “ este de ordinul 10.000

“ N ” depinde de :
- natura FM şi FS
- temperatura de lucru
- viteza liniară de deplasare a FM
- lungimea ( L ) parcursă de componente
Performanţa de separare a unui sistem cromatografic 84

Dependenţa “ N ” de viteza liniară de deplasare ( u ) a FM :


ecuaţia v a n D e e m t e r

A,B,C
L B
H   A + + Cu constante caracteristice
N u sistemului cromatografic

A : depinde de factorii geometrici ; [ cm ]


B : determinat de difuzie ; [ cm2/s ]
C : determinat de transferul
componentelor între FM şi FS ; [ s ]

B
u optim 
C
H minim  A + 2  B  C
85

J.J. van Deemter


86
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie )
FS - solidă ( mai rar ) sau lichidă ( mai frecvent )
FM - gaz ( hidrogen, heliu, neon, argon, azot )
În GC se realizează :
- separarea ( analitică sau preparativă ) a componentelor
- identificarea calitativă a componentelor pe baza indicilor de retenţie
- determinarea cantitativă a componentelor din probă
Variante :
- coloană cu umplutură ( scop analitic sau preparativ )
- coloană capilară ( scop analitic )
Temperatura : 80 – 250 oC ( la controlul medicamentelor )
Regim de lucru :
- la temperatura constantă în timp ( regim izoterm )
- la temperatura variabilă în timp ( regim cu programare de
temperatură )
87
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie )
Evenimente realizate în coloană :
- separarea componentelor fără descompunerea termică a
acestora ( eveniment tipic )
- descompunerea termică (piroliza) probei în condiţii strict
controlate şi reproductibile, urmată de decelarea produşilor de piroliză
( "amprentă de piroliză" )

Faza staţionară deseori


este un lichid vâscos,
depus în forma de
peliculă subţire, pe un
purtător solid, inert, sau
pe peretele interior al
unui tub capilar
88
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )

GP : gaz purtător Red : reductor de presiune


DB : debitmetru Inj : injector
Col : coloană de separare Det : detector
IF : interfaţă PD : procesarea datelor
89
Gazcromatograf (Agilent Technologies)
90
Gazcromatograf (Varian)
91
Gazcromatograf (National Physical Laboratory - UK)
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie ) 92

Indici de retenţie
Timpul de retenţie al unei componente depinde :
- identitatea chimică a componentei respective
- natura FS
- debitul de gaz purtător
- temperatura coloanei cromatografice
- caracteristicile geometrice ale coloanei şi umpluturii
Scop : a se defini mărimi alternative, care . . .
- să depindă semnificativ de identitatea chimică a componentei
respective, . . . dar . . .
- să depindă în măsură minimă de ceilalţi factori
indici de retenţie în locul timpilor de retenţie
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 93

Indici de retenţie
- indice Kováts ( I ) ( E. Kováts , 1958 )
- indice liniar de retenţie ( J )
- - - - etc - - -
Indice Kováts
Observaţie : în seria omoloagă a n-alcanilor, logaritmul timpilor de
retentie reduşi ai membrilor seriei variază liniar cu numărul atomilor
de carbon ( n ) din molecula alcanului, dacă măsurările sunt făcute în
condiţii identice de lucru
S-a impus (arbitrar) : indicele Kováts al unui n-alcan, cu " n "
atomi de carbon în moleculă, să aibă valoarea:

Iz = 100.n
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 94

Kováts Ervin
ervin.kovats@epfl.ch
95
Cromatografie în faza gazoasă ( indici de retentie )

Relatia dintre timpul de retentie si numarul


atomilor de carbon in molecula n-alcanilor
96
Indice Kováts

Relatia dintre timpul


de retentie si numarul
atomilor de carbon in
molecula n-alcanilor

(1) Coloana polara SCOT 06


(2) Coloana nepolara SCOT 09
(3) Coloana polara SCOT 06
(cu Carbowax 20M/KOH)
(4) Coloana nepolara SCOT 09
(cu Apiezon L/KOH)
97

AD ED

AB BC
98

AD ED

AB BC

lg(t x  t 0 )  lg(t n  t 0 ) Ix  In I x  100  n


 
lg(t n +1  t 0 )  lg(t n  t 0 ) I n +1  I n 100
lg( t x  t 0 )  lg(t n  t 0 )
I x  100  n + 100 
lg( t n +1  t 0 )  lg( t n  t 0 )
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie ) 99

Indice Kováts

Exerciţiu
Într-o coloană gazcromatografică se injectează un amestec care
conţine n-heptan (C7H16), n-octan (C8H18), n-nonan (C9H20),
n-decan (C10H22), fenacetină. În condiţiile separării indicele
Kováts al fenacetinei este 1250. Semnalul cromatografic al
fenacetinei este situat . . .
a) . . . înaintea "picului" heptanului
b) . . . între "picurile" heptanului şi octanului
c) . . . între "picurile" octanului şi nonanului
d) . . . între "picurile" nonanului şi decanului
e) . . . după "picul" decanului
Răspuns : e
100
Indice Kováts al stimulantilor SNC la diferite coloane

Coloană (Apiezon-L/KOH) ; 150 oC


Stimulant al SNC
SCOT03 SCOT04 SCOT05
Dexamfetamină 1144,3 ± 1,3 1138,3 ± 1,7 1141,3 ± 2,3
Metilamfetamină 1197,7 ± 1,3 1194,3 ± 1,5 1196,8 ± 2,2
Mefentermină 1275,1 ± 1,6 1272,1 ± 0,9 1275,1 ± 2,3
Fenilpropanolamină 1331,3 ± 1,5 1320,6 ± 2,2 1332,0 ± 3,4
Nicotină 1350,3 ± 2,6 1341,3 ± 2,1 1346,3 ± 2,7
Efedrină 1370,1 ± 2,0 1360,7 ± 1,4 1368,3 ± 2,2
Clorfentermină 1383,0 ± 2,2 1375,4 ± 1,5 1380,4 ± 1,0
Niketamidă 1462,6 ± 3,7 1459,3 ± 0,9 1469,9 ± 2,8
101
Dependenta indicelui Kováts de temperatura

Faza staţionară
Stimulant al SNC Carbowax 20M/KOH Apiezon-L/KOH
150 oC 190 oC 150 oC 190 oC
Tranilcipromină 1852 1915 1248 1271
Nicotină 1876 1926 1353 1392
Clorfentermină 1916 1950 1380 1422
Modalină 1969 2015 1473 1499
Cipenamină 1976 2022 1419 1456
Fendimetrazină 2009 2057 1475 1505
N-metilefedrină 2022 2108 1405 1437
Efedrină 2072 2179 1358 1400
Pseudoefedrină 2191 2217 1362 1398
Fenilpropanolamină 2212 2295 1339 1369
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie ) 102

Indice liniar de retenţie


t  tz Notaţiile corespund celor din relaţia
J +z de definiţie a indicelui Kováts.
tz +1  tz
Exemple de valori ( I ) şi ( J )
I J
322 K 340 K 359 K 322 K 340 K 359 K
1,2-dimetil-
536,0 540,7 537,9 5,247 5,301 5,287
butan
Benzen 636,8 640,3 644,9 6,256 6,299 6,348
3-metil-hexan 676,5 676,0 676,4 6,667 6,672 6,688
Toluen 746,9 752,8 755,8 7,347 7,415 7,459
3-metil-heptan 772,0 772,6 773,0 7,613 7,629 7,646
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 103

Indici de retenţie
Exerciţiu
Într-o coloană gazcromatografică se injectează un amestec care
conţine metan (CH4), n-nonan (C9H20), n-decan (C10H22), şi tri-n-
propilamină. Componentele se eluează la următorii timpi de retenţie :
nonan la 1,8 minute , decan la 6,6 minute , tri-n-propilamina la 3,4
minute , metan (componentă neretardată) la 0,2 minute. Identificaţi
domeniile de valori în care se incadrează indicele Kováts (I) şi
indicele de retenţie liniar (J) pentru tri-n-propilamină.
a) I < 800 şi J < 8,250
b) I : între 800 - 900 şi J = 8,533
c) I : între 900 - 1000 şi J = 9,333
d) I : între 1000 - 1100 şi J = 8,250
e) I > 1100 şi J = 8,533 Răspuns : c
104
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )

Indicii de retenţie depind într-o oarecare măsură de temperatura


coloanei. Dependenţa de temperatura coloanei a indicelui de
retenţie Kováts, pentru o componentă oarecare, este descrisă
frecvent cu ecuaţia Antoine.

B
IT  A +
T+C

IT este indicele Kováts la temperatura absolută “T”, iar A , B şi C


sunt constante (independente de temperatură) specifice componentei
în cauză şi fazei staţionare.
105
Analiza cantitativa cu etalon extern
106
Analiza cantitativa cu etalon intern (I)

SI – substanta de interes
IN – ingredienti
SD – semnal detector
107
Analiza cantitativa cu etalon intern (II)
m EI k EI  A*T k EI  A*P
 
mSI k SI  A T k SI  A P
k SI  A P
mSI  m EI 
k EI  A*P

SI – substanta de interes
IN – ingredienti
EI – etalon intern
SD – semnal detector
108
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Modalităţi de analiză cantitativă (etalon intern)

Prin folosirea unui etalon intern, ales adecvat, se pot compensa unele erori
(pierderi) de analiză, efectuate la operaţiile de prelucrare prealabilă a probei
(operaţii de extracţii, purificări, diluări, derivatizări, concentrări etc.).
Cerinţe pentru un etalon intern bun:
- să prezinte proprietăţi asemănătoare cu componentele de interes
din probă (să fie afectate de aceleaşi tipuri de erori la operaţiile de
prelucrare premergătoare injectării în coloana gazcromatografică)
- să nu interacţioneze chimic cu nici una din componentele probei în
condiţiile de prelucrare şi separare gazcromatografică
- să genereze "peak" cromatografic separat clar de "peak"-urile tuturor
componentelor din probă.
Caz particular de utilizare a unui etalon intern: metoda adaosurilor
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 109
Modalităţi de analiză cantitativă
c) Metoda adaosurilor
Se recomandă în acele cazuri în care prezenţa unei componente (de interes
sau nu) modifică sensibilitatea de detectare a unei componente de interes
("efect de matrice") sau eficienţa operaţiilor de prelucrare prealabilă a
probei.
Esenţa metodei : Se adaugă probei cantităţi cunoscute din componenta de
interes, afectată de efectul de matrice şi se injectează amestecurile în
coloana GC. Se reprezintă grafic semnalul detectorului (aria), asociat cu
componenta de interes dependenţă liniară.
Se extrapolează dreapta până ce intersectează axa pe
care sunt reprezentate cantităţile adăugate. Acest punct de intersecţie se
găseşte pe semiaxa negativă a axei cantităţilor adăugate. Cantitatea
corespunzătoare segmentului definit de punctul de intersecţie şi originea
axelor este egală cu cantitatea de componentă de interes prezentă în proba
originală.
110
Modalităţi de analiză cantitativă (metoda adaosurilor)
Condiţie necesară : posibilitatea măsurării unui semnal de detector care se
datorează exclusiv componentei de interes ("peak"-ul componentei de
interes să fie separat satisfăcător de "peak"-urile altor componente din
probă) (EM=efect de matrice).
111
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare : transformarea chimică, în condiţii controlate, a
componentelor probei înainte de injectarea probei
în gazcromatograf
Motivaţia:
- prin derivatizarea grupelor funcţionale polare molecule cu
polaritatea diminuată interacţiune mai intensă cu faza staţionară
(frecvent) nepolară accentuarea eficienţei de separare
- prin derivatizare creşte volatilitatea componentelor volatilizare la
temperaturi mai mici scade pericolul descompunerii termice
şi creşte eficienţa de separare a coloanei GC
- prin derivatizarea selectivă a unor grupe funcţionale se obţin deseori
informaţii suplimentare despre structura moleculară a componentelor
112

Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC

Tipuri de reacţii implicate (mai frecvent) :


- silanizări
- acilări cu derivaţi ai acizilor carboxilici
( pe gruparea -NH2 , -NH- sau –OH )
- acilări cu acizi boronici
- transformare în O-alchiloxime
113
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC

Derivatizare prin trimetilsilanizare

a) cu clor-trimetil-silan (CTMS) şi hexametil-disilazan (HMDS)


Grupe funcţionale afectate: -OH , -NH2 , -NHR , -SH
CTMS se utilizează în combinaţie cu HMDS şi cu piridină, în
N,N-dimetilformamidă (DMFA) sau dimetilsulfoxid (DMSO).
Separat, nici CTMS, nici HMDS nu are eficienţa de silanizare
corespunzătoare.
3R-OH + Cl-Si(CH3)3 + (CH3)3Si-NH-Si(CH3)3 3R-O-Si(CH3)3 + NH4Cl

(CTMS) (HMDS)
114
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare

b) cu t-butil-dimetil-clorsilan
Grupe funcţionale afectate: -OH , -NH2 , -NHR , -SH

[imidazol]
R-OH +
DMFA ; - HCl
Temperatura camerei

Volumul mare al grupării t-Bu-di-Me-silil permite uneori


silanizarea diferenţiată a grupelor -OH .
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 115
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare

Exemplu :

- grupele -OH secundare din poziţia 3 şi gruparea -OH primară din


poziţia 21 se silanizează rapid şi cantitativ ;
- gruparea -OH ( 20b ) se silanizează extrem de greu din cauza împie-
dicării sterice ;
- gruparea -OH secundară din poziţia 11 şi gruparea -OH terţiară din
poziţia 17 nu se poate silaniza deloc cu acest reactiv.
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 116

Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC


Derivatizare prin trimetilsilanizare

c) cu N,O-bis -(trimetil-silil)-acetamidă (BSA)


BSA este un agent de silanizare eficient pentru grupările
-OH şi -NH2

Un reactiv înrudit cu (BSA) este N-(trimetilsilil)-acetamida


(TMSA), utilizat în special pentru derivatizarea glucidelor.
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 117
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare

d) cu N-(trimetilsilil)-acetamida (TMSA), utilizat în special


pentru derivatizarea glucidelor.

+ R-OH R-O-Si(CH3)3 +

( TMSA )
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 118
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC

e) cu (izopropeniloxi)-trimetil-silan (IPOTMS)
- IPOTMS este un reactiv asimilat mai recent în GC
- IPOTMS este folosit cu succes mai ales pentru silanizarea
acizilor carboxilici, alcoolilor alifatici şi fenolilor
- atât agentul (IPOTMS) cât şi produsul secundar de
reacţie sunt volatili se recomandă pentru
silanizarea compuşilor hidroxilici volatili (excesul de
IPOTMS şi acetona formată se îndepărtează uşor)
119
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare

f) cu N-(trimetil-silil)-dimetilamină (TMSDMA)
- TMSDMA este utilizat mai ales pentru silanizarea aminelor
şi aminoacizilor
- în prezenţa (CTMS) (catalizator) se poate folosi şi pentru
silanizarea grupelor hidroxilice
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 120
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
g) cu N-(trimetilsilil)-imidazol (TMSIM)

TMSIM este utilizat mai ales pentru derivatizarea grupelor -OH.


Particularităţi:
- în absenţa catalizatorului, TMSIM nu reacţionează cu grupări aminice bazice
- în prezenţa BSA sau TCMS agentul TMSIM devine extrem de eficient chiar şi
în cazul grupelor -OH cu împiedicare sterică (din acest motiv se foloseşte pentru
derivatizarea totală a hidroxisteroizilor şi a altor compuşi polihidroxilici)
- TMSIM este agentul de silanizare al compuşilor cu grupări -OH care poate fi
utilizat şi în prezenţa apei (de exemplu silanizarea glucidelor din siropuri se
poate realiza chiar la un conţinut de 30 % apă în probă)
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 121
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin dimetilsilanizare

Derivaţii dimetil-silil sunt mai volatili decât derivaţii trimetil-silil


corespunzători separarea GC a derivaţilor dimetil-silil se
realizează la temperaturi mai mici
- scade pericolul descompunerii termice a componentelor din probă;
- la temperaturi mai mici creşte puterea de separare a coloanei GC
Particularităţi:
- dimetilsilanizarea se aplică mai ales în cazul compuşilor
polihidroxilici
- derivaţii dimetilsilanizaţi sunt mult mai susceptibili la reacţii de
hidroliză decât derivaţii trimetilsilanizaţi dimetilsilanizarea
se execută în condiţii strict anhidre.
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 122
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin dimetilsilanizare
a) N,O-bis-(dimetilsilil)-acetamidă (DBSA)

b) amestec de clordimetilsilan (CDMS) şi tetrametil-disilazan (TMDS)


Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 123

Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC


Derivatizare prin clormetilsilanizare

Proprietăţile derivaţilor (clormetil)-dimetilsilil:


- prezenţa atomului de clor în compusul derivatizat detectare la
sensibilitate foarte mare, prin captură de electroni (ECD)
- (clormetil)-dimetilsilil-derivaţii au timpi de retenţie considerabil mai mari
decât derivaţii trimetilsilanizaţi corespunzători separare GC mai bună
a componentelor din probă
Reactiv : cloro-(clormetil)-dimetilsilan în combinaţie cu bis-(clormetil)-
tetrametil-disilazan, în piridină sau în N,N-dimetil-formamidă drept solvent
124
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)
a) cu cloruri acide (reacţie Schotten - Baumann)
Alcoolii, fenolii şi aminele reacţionează cu cloruri acide cu
formare de derivaţi acilaţi. Dacă se utilizează clorura unui acid
aromatic, greu hidrolizabil, atunci acilarea se poate realiza chiar
în mediu apos (soluţie alcalină, ex. NaOH 10 %).
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 125
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)
b) cu halogenuri de bor BX3 + 3R-OH B(OR)3 + 3HX
( BF3 , BCl3 )

c) cu dialchilacetalii N,N-dimetilformamidei
În gazcromatografie a fost utililzat prima dată de Horning
(derivatizarea acizilor graşi şi a amino-acizilor)
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 126
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)

d) cu acizi alchilboronici

Domeniu de utilizare : compuşi care conţin în moleculă două sau mai multe
grupe funcţionale (aminoacizi, glucide, catecolamine), dar şi în cazurile
probelor cu acizi graşi, prostaglandine, sfingozine, steroizi etc.
127
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie ) 128
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilări pe atomul de oxigen)

Compuşii ciclici (alchilboronaţi) - proprietăţi GC excelente:


- sunt stabili faţă de agenţii de acetilare, de trimetilsilanizare şi de metilare
- reacţiile de alchilboronare decurg la temperatura camerei
- raportul molar de utilizare a reactivului de derivatizare este 1 : 1 (sau un mic
exces de acid alchilboronic)
- reacţia decurge în câteva minute
Reactivi folosiţi frecvent :
acid metilboronic ( R = -CH3 ) sau acid n-butil-boronic
129
Cromatografie în faza gazoasă ( gazcromatografie )
Tehnici şi reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin transformare în O-alchiloxime

Reactivi: O-alchil- Utilizare: compuşi carbonilici,


-hidroxilamine compuşi hidroxi-carbonilici

Procedeul se utilizează pentru derivatizarea cetosteroizilor şi a


derivaţilor de prostaglandine
În cazul în care molecula de interes conţine grupare cetonică şi
grupare -OH , gruparea cetonică se transformă în prealabil în
O-alchil-oximă (de exemplu în cazul aldolilor / cetolilor)
130
Cromatografie în fază gazoasă ( gazcromatografie )
131
Anaesthetics (GC-packed column)
Column: 4 m x 2 mm I.D. glass
SF: 3 % SE-30 , Chromosorb W HP 100/120
T: 160 oC to 260 oC ( 6 oC/min )
Carrier gas: N2
Detector: FID

1) Benzocaine
2) Lidocaine
3) Procaine
4) Oxyprocaine
5) Tetracaine
6) Oxybuprocaine
7) Cinchocaine
Separation of TMS-derivatives of steroids (capillary GC) 132
1) androsterone ; 2) etiocolanolone ; 3) dehydro-epiandrosterone ; 4) dS-androstene-3b, 17b-
diol ; 5) 11-keto-etiocolanolone; 6) oestradiol ; 7) 11-hydroxy androsterone ; 8) 11-hydroxy-
etiocolanolone ; 9) epiprednonalone ; 10) 16-a-OH-dehydro-epiandrosterone ; 11) allopregna-
nediol ; 12) pregnanediol ; 13) pregnanetriol ; 14) 16-keto-androstenediol ; 15) dS-androste-
ne-3b,16a, 17b-triol ; 16) & 17) by-products ; 18) 17-keto-pregnanetriol ; 19) 16a-OH-preg-
nenolone ; 20) pregnene-3b, 17a, 20a-triol ; 21) tetrahydrocortisone ; 22) tetrahydrodioctyl-
phtalate ; 23) tetrahydrocorticosterone ; 24) tetrahydrocortisol ; 25) allotetrahydrocortisol ;
26) a-cortolone ; 27) b-cortolone ; 28) choloesterol ;
29) a-cortol ; 30) methyldesoxycholate (I.S.)

Column: 25 m x 0.22 mm
SF: CP-Sil 5 (0.12 mm)
T: 100 oC to 210 oC in 25 min
then 1.5 oC/min to 265 oC
Carrier gas: He
Detector: FID
133
Cromatografie cu faza mobilă lichidă

FS - solidă (mai rar) sau lichidă (mai frecvent)


FM - lichidă (solvent unic sau amestec de solvenţi)
În cromatografia lichidă se realizează :
- separarea (analitică sau preparativă) a componentelor unei probe
- identificarea calitativă a componentelor pe baza mobilităţii cro-
matografice (timp de retenţie, valoare RF sau RM etc.)
- determinarea cantitativă a componentelor din probă
Variante :
- FS în forma de strat subţire, întins pe un support plan (TLC)
- coloană cu umplutură (scop analitic sau preparativ)
Regim de lucru :
- cu compoziţie constantă în timp a FM ( regim "izocratic" )
- cu compoziţia variabilă în timp a FM ( regim cu "gradient" )
134
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografie în strat subţire (Thin Layer Chromatography - TLC)
. . . este tehnica citată frecvent în Farmacopeea Română şi în cele ale
altor ţări (inclusiv Farmacopeea Europeană).
Avantaje :
- rezoluţie bună (mai ales cu variantele actuale, performante);
- posibilitatea analizării mai multor probe în condiţii strict identice;
- posibilitatea separării "bidimensionale" a componentelor din probă;
- se realizează prin operaţii simple (nu necesită specializare deosebită);
- literatura de specialitate conţine multe informaţii privind condiţiile de
lucru
- dotarea cu tehnica TLC nu presupune efort financiar deosebit
Stratul subţire (FS):
- silicagel
- oxid de aluminiu (Al2O3) cu umiditate controlată
- celuloză
- acetat de celuloză
135
Cromatografie cu faza mobilă lichidă

Tipul de interacţiuni cu FS (şi cu FM) în care sunt implicate


componentele probei :

- adsorbţie pe suprafaţa solidă a FS (cromatografie de adsorbţie);


- partiţia între două faze lichide nemiscibile
(cromatografie de partiţie);
- potrivire / nepotrivire sterică a moleculelor componentelor
cu cavităţile FS (cromatografie de gel-permeaţie / cromatografie
de gel-filtrare / cromatografie de excludere sterică);
- interacţiuni ionice (cromatografie cu răşini schimbătoare de ioni);
- interacţiuni specifice de tip biochimic
(cromatografie de afinitate)
136
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografie în strat subţire (Thin Layer Chromatography - TLC)

Identificarea / vizualizarea componentelor pe placa cromatografică :


- prin mărimile RF şi RM (vezi la partea generală a metodelor
cromatografice);
- prin răzuirea spotului, urmată de extracţia componentei şi
identificarea prin metode fizico-chimice (ex. IR);
- prin stropirea plăcii cu reactivi de culoare, universale sau
specifice componentelor;
- prin modificarea fluorescenţei stratului subţire
( ex. plăci cu indicativul F254 )
. . . etc. . . .
137
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografie în strat subţire (Thin Layer Chromatography - TLC)

TLC cu presiune (Overpressure Thin Layer Chromatography - OPTLC)


Eluentul trece prin stratul subţire a FS datorită presiunii de aprox. 25 atm.
- realizarea mult mai rapidă a separării
- separări mult mai performante comparativ cu TLC obişnuit
14 componente separate
OPTLC
138
139
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografia lichidă de performanţă, la presiune înaltă
(High Performance Liquid Chromatography - HPLC)

Faza staţionară : - solidă (mai rar) sau lichidă (mai frecvent)


- deseori fixată chimic de un suport inert
Faza mobilă : - lichidă
- presiune: 80 - 300 atm
- debit FM: 0,8 - 2,0 ml/min.
Date tipice ale coloanelor HPLC :
- lungime 15 - 25 cm
- diametru interior: 3 – 5 mm
- diametrul particulelor : 5 - 20 m
Performanţă : uneori comparabile cu cea a GC
Natura FS : - faza staţionară polară = HPLC cu faza directă (DP)
- faza staţionară nepolară = HPLC cu faza inversă (RP)
140

Cromatografia lichidă de
performanţă, la presiune
înaltă (HPLC)
( Horváth Csaba - părintele
metodei analitice HPLC )
1966 – realizarea tehnicii
HPLC
1970 – recunosterea
potentialului analitic deosebit
al fazei stationare inverse
(nepolare)
Horváth Csaba
(1930 - 2004)
141
Cromatografie cu faza mobilă lichidă - HPLC

Reprezentarea
schematică a unui
sistem HPLC
142
Cromatografie cu faza mobilă lichidă - HPLC
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 143
HPLC
Mărimi derivate caracteristice în HPLC

t  t t0 – timpul de retenţie al
Factor de capacitate k 'i  i 0
componentei neretardate
t0
k 'j
Factor de separare αi, j   1 ; ( k 'j  k i' )
k i'

1,18  (t j  t i )
Rezoluţie R i, j  0
Δt 0,5; j  Δt 0,5;i
t 0,5;i reprezintă lăţimea "peak"-lui nr. " i " la semi-înălţime
(exprimata ca interval de timp)
144
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
HPLC

Derivatizarea componentelor din probă


Scopul :
- modificarea (frecvent reducerea) polarităţii moleculelor
- obţinerea diastereoizomerilor unei perechi de enantiomeri în
vederea rezolvării unui amestec racemic în antipozi optici
- introducerea unui cromofor cu scopul detectării optice a unei
componente
Exemplu : derivaţii acizilor graşi saturaţi prezintă absorbţie slabă
chiar în domeniul spectral UV. Prin derivatizare se introduce în
moleculă un cromofor absorbţie puternică în domeniul optic
ultraviolet detectare convenabilă.
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 145

HPLC

Rolul eterului coroană:


solvatarea puternică a ionilor
metalelor alcaline se
accentuează mult solubilitatea
sării alcaline a acidului carbo-
xilic în solventul aprotic
(acetonitril)
146
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
HPLC

Faza staţionară în HPLC : silicagel sau material polimer (purtător)


cu suprafaţa derivatizată. În urma derivatizării suprafaţă cu
proprietăţi modificate (hidrofobicitate / hidrofilicitate modificată)

150 - 250 oC
3 - 8 ore
+ HO-R
- H2O

+ H2N-R
+ SOCl2
- SO2 - HCl
- HCl
147
Conditii
anhidre
+
- HCl
Conditii
anhidre
+
- HCl

+ H2O
- HCl

+n

+ H2O
n
- (n+1) HCl
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 148

Gruparea Si-NH-R este stabilă la hidroliză însă cea mai stabilă grupare este
Si-O-Si-R . Faza staţionară modificată în această manieră, utilizată cel mai
frecvent, este aceea în care R este un rest octadecilic:
Si-O-Si(CH3)2-(CH2)17-CH3
Această fază staţionară este foarte nepolară.
Alte grupări legate de support :

Octadecil -(CH2)17-CH3 Aminopropil -(CH2)3-NH2


Octil -(CH2)7-CH3 Alchilamino -(CH2)n-NH2
Hexil -(CH2)5-CH3 Nitro -NO2
Dimetilsilil -Si(CH3)2 Nitril -CN
Trimetilsilil -Si(CH3)3 Alchilnitril -(CH2)n-CN
Ciclohexil -C6H11 Propionitril -CH2-CH2-CN
Fenil -C6H5 Oxipropionitril -O-CH2-CH2-CN
Dimetilamino -N(CH3)2 Hidroxi vicinal
-CH(OH)-CH(OH)-
Amino -NH2 (diol)
149

Cromatografie cu faza mobilă lichidă HPLC

Alte tipuri de faze staţionare :


- copolimer stiren - divinilbenzen ;
- răşini schimbătoare de ioni ; oxid de aluminiu ;
- agaroză ; silicat de magneziu ; grafit poros ;
- gel de hidroxi-metacrilat ; sticlă poroasă ; hidroxiapatită ;
- grafit cu suprafaţa procesată chimic
. . . etc. . . .
150
Cromatografie cu faza mobilă lichidă HPLC
Faze mobile utilizate în HPLC
Seria eluotropă a solvenţilor (ordinea crescătoare a polarităţii)
utilizaţi frecvent în HPLC :

Miscibil cu Limita spectrală Vâscozitate la


Solvent
apă . . . de utilizare (nm) 20 oC (cP)

Hexan nu 190 0,31


Izooctan nu 190 0,50
Tetraclorură de carbon nu 263 0,97
Cloroform nu 245 0,57
Diclormetan nu 233 0,44
Tetrahidrofuran da 212 0,55
Dietil-eter nu 218 0,23
Acetat de etil slab 256 0,45
Cromatografie cu faza mobilă lichidă HPLC 151
Faze mobile utilizate în HPLC Seria eluotropă a solvenţilor (continuare)

Limita spectrală Vâscozitate


Solvent Miscibil cu apă . . .
de utilizare (nm) la 20 oC (cP)

Acetat de etil slab 256 0,45


Acetonă da 330 0,30
1,4-dioxan da 215 1,32
Acetonitril da 190 0,37
2-propanol da 190 2,30
Metanol da 190 0,60
Apă da 190 1,00
Acid acetic da - 1,22

Solvenţii utilizaţi cel mai des în HPLC cu fază inversă (hidrofobă) : tetrahidrofuran,
acetonitril, metanol, apă, soluţii tampon cu pH potrivit
În cazul FS polare (fază directă) nu se utilizează solvenţi polari (apa nici chiar în urme!)
deoarece poate dezactiva ireversibil FS (în special silicagelul nederivatizat)
152
Separarea HPLC a unor antibiotice

1) Amoxicilină
2) Benzilpenicilină
3) Feneticilină (sarea de sodiu)
4) Flucloxacilină (sarea de potasiu)

Coloana “ChromSep”; FS: C18


FM: 0,02 M Na2HPO4 (pH 3,3) + MeOH (70:30)
Debit: 0,8 ml/min.
153

Compararea separarii HPLC in regim izocratic si cu gradient


Analiza HPLC a purităţii Aceclofenacului ( Ph. E. ed. V ) 154

C
O COOH Faza staţionară : C18 (5 m, pori de 10 nm)
O
NH Faza mobilă : (A) tampon fosfat cu pH 7,0
Cl Cl (B) acetonitril : apă (9 : 1 ; v/v)
Detectare : 275 nm ; Debit : 1 ml/minut
Aceclofenac

timp A B
(min) (% v/v) (% v/v)
0-25 70 50 30 50
25-30 50 20 50 80
30-50 20 80
50-52 20 70 80 30
52-65 70 30
Analiza HPLC a purităţii Aceclofenacului ( Ph. E. ed. V ) 155
O
O COOH O O O C
C C R C O C O
O O O R N
NH NH NH Cl
Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl
(I) ( II ) ( III )
Aceclofenac (1) – (I) R : H
(2) – Aceclofenac
(3) – (II) R : -CH2-COOH
(4) – (II) R : -CH2-COO-
-CH2-COOH
(5) – (III)
(6) – (II) R : -CH3
(7) – (I) R : -CH3
(8) – (II) R : -C2H5
(9) – (I) R : -C2H5
(10) – (II) R : -CH2-C6H5
156
Determinarea selectiva a impuritatilor de acridona in
Carbamazepina prin suprimarea semnalului Carbamazepinei
(Carter)
157
Determinarea selectiva a impuritatilor de acridona (A)
in Carbamazepina (C) prin suprimarea semnalului
Carbamazepinei (Carter)

Din spectrul Carbamazepinei: eC(256) = eC(307)


in timp ce pentru acridon eA(256) ≠ eA(307)

S(256 )  d  eC (256 )  CC + e A (256 )  CA 


S(307 )  d  eC (307 )  CC + e A (307 )  CA 
S(256 )  S(307 )  d  CC  eC (256 )  eC (307 ) +
+ d  C A  e A (256 )  e A (307 )
S(256 )  S(307 )  d  CA  e A (256 )  e A (307 )
158
159
Separarea enantiomerilor Bendrofluometiazidei.
160
Controlul purităţii Esomepromazolului prin HPLC chirală

Coloana: 10x0,4 cm ; FS: a1-AGP;


FM: fosfat de sodiu (60 mM, pH 6,0) + acetonitril (85:15)
Detectare: 302 nm ; Debit: 1 ml/min.
161
Rezoluţia chirală a Ibuprofenului

Coloana: 25x0,46 cm
FS: polara si chirala “Whelk-01”
FM: C6H14 + i-PrOH + Ac. acetic
(98:2:0,5)
Debit: 0,9 ml/min.
k1’ = 1,13 ; k2’ = 1,40 ; a12 = 1,24
162
Separarea enantiomerilor Colana ”Chiurobiotic T” (FS nepolara)
Clortalidonei F.M.: MeOH + H2O (20:80)
Debit: 1 ml/min
Temp.: 50 oC
Separarea enantiomerilor Naproxenului 163
dintr-un amestec neechimolar (R : S = 3 : 7)
Coloana (25x0,46 cm) cu FS polara (S,S)-ULMO
FM: C7H16 + PrOH (90:10) + 0,1 % acid trifluoracetic
kR’ = 1,54 ; kS’ = 2,065 ; aRS = 1,34
164
Rezoluţia enantiomerilor Colana ”Chiurobiotic T” (FS nepolara)
Bendrofluometazidei F.M.: MeOH + H2O (20:80)
Debit: 1 ml/min
Temp.: 50 oC
165
Separarea enantiomerilor şi
diastereoizomerilor Bemetizidei Coloana: “Chiracel OD-RH”
FM: acetonitril + apa (35:65)
Temperatura: 25 oC
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 166

Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Gel Permeation Chromatography (GPC) - sortarea mecanică a


moleculelor din probă după dimensiunile lor în soluţie

Utilizare : mai ales pentru separarea componentelor cu molecule mari


(oligomeri, macromolecule): proteine (anticorpi, toxine,
enzime), peptide, oligo- şi polizaharide etc.

Mecanism de interacţiune cu FS : în cazul ideal interacţiunile fizico-


chimice dintre FS şi componentele probei sunt neglijabile
Singurul factor de separare: potrivirea / nepotrivirea unor molecule
în cavităţile FS
Molecule mai voluminoase mobilitate cromatografică
mai mare
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 167
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
V0 - volum interstiţial
VT - volum liber total
(accesibil moleculelor)
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 168
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
Într-o primă aproximaţie: volumul molecular este proporţional cu
masa moleculară relativă ; din acest motiv se afirmă că în croma-
tografia de gel-permeaţie componentele sunt separate în funcţie de
masa moleculară relativă a lor
Derularea separării se poate exprima prin timpul de retenţie sau prin
volumul de retenţie. În GPC deseori se utilizează volumul de retenţie
(volumul de FM care a părăsit coloana până în momentul ieşirii unei
componente din coloană). Dacă componentele probei nu sunt implicate
în interacţiuni specifice cu FS (separarea are loc strict după criterii de
potrivire sterică), atunci se verifică relaţia :
VT > V > V0
în care V este volumul de retenţie al componentei care are masa
moleculară relativă egală cu 
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 169
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Între moleculele probei, unele au volumul (masa moleculară relativă


M) suficient de mare pentru ca să nu se potrivească în nici una dintre
cavităţile gelului. Toate moleculele care au volumul molecular egal
cu – sau mai mare decât – acest prag, eluează la volumul de eluţie
egal cu V0.
Între moleculele probei, unele au volumul (masa moleculară relativă
m) suficient de mic pentru ca să se potriveasca în toate cavităţile
gelului. Toate moleculele care au volumul molecular egal cu – sau
mai mic decât – acest prag, eluează la volumul de eluţie egal cu VT.

Dacă o componentă (notată prin X) are volumul de retenţie mai


mare decât VT , înseamnă că aceasta este implicată în interacţiuni
specifice cu faza staţionară (fenomen nedorit în cromatografia de
gel-filtrare).
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 170
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

VT > V > V0
VM > V > Vm

În cazul în care separarea are


loc strict după criterii sterice,
un anumit gel (cu o anumită
extindere a dimensiunilor
cavităţilor) poate separa
molecule cu volum molecular
(şi implicit cu masă molecu-
lară) cuprinsă între o limită
superioară (LS) şi o limită
inferioară (LI)
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 171
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Cromatografia de gel-permeaţie se utilizează şi pentru determinarea masei


moleculare a unor molecule mari, cazuri în care alte metode nu pot fi
utilizate
Migrarea unei componente se caracterizează prin capacitatea de reţinere
(K) sau prin coeficientul de distribuţie al coloanei [ (Kd) ] , date
referitoare la componenta în cauză (având masa moleculară ) :

Vμ  V Vμ  V Vμ  V
Kμ  0 ; (K d )μ  0 0
V V VT  V
0 pori 0
Vpori reprezintă volumul fazei staţionare

(Kd) reprezintă fracţiunea din volumul fazei staţionare care este


disponibilă pentru componenta cu masa moleculară relativă .
172
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
În practică este greu de determinat volumul fazei staţionare Vpori .
Din acest motiv este mai convenabilă utilizarea constantei (Kav)
(constanta de "disponibilitate" – " availability constant " – referitoare
la componentele cu masa moleculară relativă m).
Vμ  V
0
(Kav )μ 
V V
col 0
Vcol reprezintă volumul interior al coloanei, volum egal cu suma
volumelor spaţiului interstiţial, porilor şi miezului solid:
Vcol = Vsolid + Vpori + V0
(Kav) reprezintă fracţiunea din volumul umpluturii colanei,
disponibilă componentei cu masa moleculară relativă .
173
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
(K av )μ
În cazul unui gel dat, raportul este independent de natura
(K )μ
d
sau de concentraţia componentei (cu masa moleculară ). În cazul
componentelor care nu manifestă interacţiuni specifice cu gelul
(numai interacţiuni sterice), se verifică inegalitatea 0 < (Kav) < 1
Pentru gelurile comerciale se dau curbele de selectivitate
(dependenţa constantei Kav de lg ).

Substanţe utilizate drept fază staţionară (gel) : agar-agar, acetat


de celuloză, copolimeri (stiren - divinilbenzen), polimeri
(poliacrilamidă, alcool polivinilic, polistiren, polimetacrilat),
dextran, proteine globulare, silicagel hidratat etc.
174
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Separarea gel-cromatografică
a unor enzime
1: glutamat dehidrogenaza
(290.000 Da);
2: lactat dehidrogenaza
(140.000 Da);
3: enolaz kinaza (67.000 Da);
4: adenilat kinaza (32.000);
5: citocrom C (12.400)
175
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Purificarea crotaminei din


veninul de şarpe (200 mg de
venin de Crotalus durissus
terrificus)

Gel: Sephadex G-100 (2,5x85


cm);
Faza mobilă: tampon formiat de
amoniu (pH 3,0)

1: convulxină; 2: gyroxină;
3: crotoxină; 4: crotamină
176
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)
Separarea proteinelor prin
cromatografie de gel-filtrare
1. IgM de şoarece
(M = 900 kDa);
2. Tiroglobulină bovină
(M = 670 kDa);
3. b-amilază din cartofi
(M = 200 kDa);
4. Seralbumină bovină
(M = 67 kDa);
5. Albumină aviară
(M = 45 kDa)
6. Ribonucleză bovină
(M = 13,7 kDa);
7. Azidă de sodiu
Gel: Dextran (coloana ZORBAX FG-250 (M = 0,067 kDa)
Eluent: NaCl (130 mM) + Na2HPO4 (50 mM) ; pH: 7,0 ; Debit: 1 ml/min.
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 177
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Relaţia dintre logaritmului


masei moleculare şi volumul
de eluţie la cromatografia de
gel-permeaţie.
Curbele individuale sunt
trasate cu fracţii de polistiren
având mase moleculare
diferite.
Cele 7 curbe se referă la
geluri cu diametru diferit de
pori (exprimate în unităţi Å).
Cromatografie cu faza mobilă lichidă 178
Cromatografia de gel-permeaţie (gel-filtrare)

Cromatogramele suprapuse
ale dextranilor având mase
moleculare diferite.
1. Dextran-50 (43,5 kDa)
2. Dextran-25 (21,4 kDa)
3. Dextran-12 (9,98 kDa)
4. Dextran-5 (44,4 kDa)
5. Dextran-1 (1,08 kDa)
179

Cromatograma unei probe de dextran


având componente cu grade diferite
de policondensare (molecule
conţinând un număr variabili de
meri). Masa moleculară medie a
amestecului este 1000 Da. Separarea
este realizată pe un gel de tipul
“Sephadex peptid HR”
(T. Anderson şi colaboratorii:
J. Chromatography 1985:326, 33)
180
Cromatografie cu faza mobilă lichidă
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni . . .
. . . este o tehnică performantă de separare a compuşilor anorganici sau
organici care, în condiţiile de lucru, manifestă caracter ionic (posedă
sarcină electrică).

Faza staţionară :
răşini (stare solidă) în formă de particule, care posedă pe suprafaţa lor
grupări chimice ionizabile, legate chimic ( –SO3H ; –PO3H2 ;
–NH2 ; –NR2 etc.). Grupările pot schimba starea lor de ionizare în funcţie
de pH-ul sau tăria ionică a fazei mobile.

Mecanism de interacţiune :
- interacţiuni electrostatice între speciile ionice din probă şi grupările
ionizate legate pe suprafaţa particulelor de răşină
- echilibre de schimb ionic
- efect salin primar şi interacţiuni de solvatare
181
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Răşinile schimbătoare de ioni se clasifică :
- după natura speciilor ionice schimbate
- cationiţi (schimbă cationi; grupele ionizabile, legate chimic de
răşină, au sarcina electrică negativă)
- anioniţi (schimbă anioni; grupele ionizabile, legate chimic de
răşină, au sarcina electrică pozitivă)
- după tăria acidă (bazică) a grupărilor ionice legate de răşină
- cationit / anionit tare
- cationit / anionit slab
• Un cationit este în " forma H " dacă ionul reţinut pe suprafaţa lui (prin inter-
acţiuni electrostatice cu grupările legate chimic de răşină) este protonul, H+. Dacă
acest ion este dislocat din vecinătatea grupelor legate de răşină cu alţi ioni, de
exemplu cu Na+, atunci cationitul este în " forma Na ".
• Un anionit este în " forma OH " dacă ionul reţinut pe suprafaţa lui (prin in-
-
teracţiuni electrostatice cu grupările legate chimic de răşină) este ionul OH . Dacă
acest ion este dislocat din vecinătatea grupelor legate de răşină cu alţi ioni, de
-
exemplu cu Cl , atunci anionitul este în " forma Cl ".
182
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Ionii (A) imobilizaţi în


zona de imobilizare se pot
schimba cu ioni (B) în
funcţie de preferinţa
grupelor de funcţionale
(F) faţă de cei doi ioni şi
în funcţie de condiţiile
chimice din faza lichidă
(pH, tărie ionică, etc.)
183

Eluarea secvenţiala a
diferiţilor cationi sub
acţiunea progresiv
crescătoare a concentraţiei
eluentului (acidul HX)
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni 184
Exemplu :

Ionii Na+, prezenţi în soluţie,


dislocă protonul din gruparea
sulfonică a răşinii şi sunt fixaţi,
prin forţe electrostatice, în sfera
de solvatare a anionului sulfonat.
Protonul trece în soluţie în forma
disociată (electrolit tare).
Procesul este reversibil.
Echilibrul nu este deplasat pre-
dominant într-un anume sens.

Dacă în urma dislocării proto-


nului, acesta trece în soluţie în
forma de electrolit slab (con-
centraţia de H+ mică), atunci
echilibrul este deplasat spre
" forma Na " a răşinii.
185
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Exemplu :

Dacă răşina aflată în "forma Na"


este plasată într-o soluţie cu
concentraţie destul de mare a
ionilor de K+ (electrolit tare),
atunci ionii Na+ din sfera de
solvatare a anionului sulfo-nat
pot fi dislocaţi (proces reversibil)
de ionii de K+. Răşina aflată în
"forma K" sau în "forma Na" se
poate transforma din nou în
"forma H" dacă este introdusă
într-un mediu cu concentraţia
suficient de mare a ionilor H+
(nu în apă distilată, deoarece aici
concen-traţie ionilor H+ este
-
mică, de ordinul de mărime 10 7
mol/l la 22 oC).
186
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Gruparea ionizabilă activă, legată chimic de răşina de tip cationit, poate fi
alta decât sulfonică, de exemplu poate fi grupare carboxilică. Având în
vedere faptul că acizii carboxilici sunt acizi mai slabi decât acizii sulfonici
(acizii carboxilici disociază în măsură mai mică decât acizii sulfonici),
în " formele H " protonul din sfera de solvatare a grupării sulfonice este
disociat în măsura mai mare decât protonul din sfera de solvatare a grupării
carboxilice.
187
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Exemplu :
Un anionit este capabil să schimbe anionul reţinut în sfera de solva-tare
a grupei active (un cation cu sarcina electrică pozitivă) cu un alt anion,
aflat la concentraţie suficient de mare în mediul cu care răşina este în
contact.

Anioniţii au gruparea ac-


tivă cu caracter bazic (în
funcţie de tăria bazică a
grupei active, anionitul
poate fi tare sau slab).
Răşinile schimbătoare de
ioni reţin ionii în mod di-
ferenţiat.
188
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Câteva răşini schimbătoare de ioni ( I )
Cationit Structura răşinii Gruparea ionogenă
Amberlit IR-100
fenolică -OH ; -CH2-SO2OH
Amberlit IR-105
Amberlit IR-112
copolimer stiren - DVB -SO2OH
Amberlit IR-120
Zeo-Carb 215 fenolică -OH ; -CH2-SO2OH

Zeo-Carb 225 copolimer stiren - DVB -SO2OH

Amberlit IR-50 polimer de acid metacrilic -COOH

Zeo-Carb 216 fenolică -OH ; -COOH


Sephadex SE-25
Dextran -O-CH2-CH2-SO2OH
Sephadex CM-50
189
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Câteva răşini schimbătoare de ioni ( II )

Structura
Anionit Gruparea ionogenă
răşinii
Amberlit IRA-400 copolimer +
Amberlit IRA-410 stiren - DVB -N R3
-OH ; grupare amino pe
Amberlit IRA-4B fenolică
nucleu aromatic
copolimer
Amberlit IR-45
stiren - DVB -N(C3H7)2
Sephadex DEAE A-25 Dextran -O-CH2-CH2-N(C2H5)2
190
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Schema unei instalaţii simple


pentru separare cu coloană
umplută cu răşină
schimbătoare de ioni.
Montajul asigură acoperirea
în permanenţă a răşinii cu
eluent.
191
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Instalatie de cromatografie ionica
192
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Izolarea acizilor slabi (organici) dintr-un amestec ( I )

Acizii slabi (organici, R-COOH), datorită gradului de ionizare redus, sunt


reţinuţi din soluţii apoase sau alcoolice numai pe răşini anionice puternic
bazice, de pe care se eluează cu soluţia unui acid puternic
-
( X H+ , de exemplu acid clorhidric în etanol sau acid acetic ), cu grad de
ionizare avansat.
Exemple în acest sens : derivaţii acidului barbituric, acidul salicilic, acidul
acetilsalicilic, salicilamida, teofilina, teobromina etc.
193
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Izolarea acizilor slabi (organici) dintr-un amestec ( II )


194
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( I )

Bazele organice sunt reţinute pe răşini cationice puternic acide. Eluarea lor
de pe răşină se realizează concomitent cu regenerarea răşinii folosind soluţii
diluate de acizi minerali.
195
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( II )
Bazele organice mai pot fi eluate cu soluţii diluate de hidroxid de sodiu
sau cu amoniac în solvenţi organici (ex. alcooli).

Exemplu : izolarea alcaloizilor din produse vegetale


196
Separarea bazelor organice
din sărurile lor formate cu Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni
acizi tari (sulfat de chinină,
clorhidrat de efedrină etc.).
197
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Separarea bazelor organice din sărurile lor formate cu acizi slabi


(maleat de prometazină etc.).
198
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Separarea amestecurilor de alcaloizi (amestec de morfină şi codeină)


199
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Separarea unui alcaloid de alte principii active


200
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Separarea glucidelor ( I )

Proiectia Fischer
a moleculei de
Glucidele formeză cu acid glucoza
boric complecşi ionizabili
201
Separarea glucidelor ( II )

Acid boric 0,005 M


Complexul zaharozei
Acid boric 0,02 M
Complexul fructozei
Acid boric 0,03 M
Complexul glucozei
202
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Determinarea efedrinei (sulfat) dintr-un sirop


203
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Ordinea de elutie a anionilor de pe un anionit

densitate de sarcina

1 2 3
AcO- OH- F-

1 2 3
- -
Cl- NO 3 NO2

1 2 3
2-
NO3- SO4 -
2
SO3
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni 200

Ordinea de elutie a cationilor de pe un cationit

densitate de sarcina

1 2 3
K+ Na+ Li+

1 2 3
2+ 3+
Ag+ Zn Al
205
Cromatografie pe răşini schimbătoare de ioni

Ordinea de elutie acizilor si bazelor de pe un anionit


respectiv de pe un cationit
Anionit Cationit

taria acida taria bazica


206

Separarea unor anioni Coloana: “Waters IC-Pak Anion HC”


Eluent: borat/gluconat
Debit: 1 ml/min
Detectare: conductometrica
207

Metode de
spectrometrie optică
Spectrofotometrie
Generalităţi
208

Esenţa metodelor de spectrometrie optică :


- descompunerea spectrală a unei radiaţii emise de proba
- modificarea spectrului unei radiaţii electromagnetice ca urmare a
trecerii acesteia prin probă

Clasificarea metodelor : - spectrofotometrie de absorbţie optică


- spectrofotometrie de emisie optică
- spectrometrie de fluorescenţă / Raman
- spectrometrie de rotaţie optică (ORD)
- spectrometrie de dicroism circular (CD)
Mecanismul de generare a spectrelor la nivel molecular / atomic :
- tranziţii electronice între stările staţionare (cuantificate) ale
moleculelor sau ale atomilor
- tranziţii între stările staţionare de vibraţie ale moleculelor
209
Obiective urmărite :
- identificarea unei componente chimice pe baza întregului spectru
- determinarea cantitativă a unei componente pe baza unor
caracteristici locale ale spectrului probei
- depistarea şi studierea cantitativă a unor echilibre chimice
Modul de manifestare a interacţiunii radiaţiei cu proba :
- absorbţie
- emisie
- fluorescenţă UV-A : 320 – 400 nm
Domeniul spectral implicat : UV-B : 280 – 320 nm
- ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm UV-C : 100 – 280 nm
- vizibil (VIS) : 380 - 800 nm
- infraroşu apropiat (NIR) : 800 - 2500 nm
- infraroşu mijlociu (IR) : 2500 - 50000 nm
- infraroşu îndepărtat (FIR) : 50000 - 1000000 nm
210

Corelarea între modul de manifestare al interacţiunii


radiaţiei cu proba şi mecanismul de generare a
semnalului optic util

Modul de manifestare a interactiunii radiaţiei cu proba


Efect Rotaţie
Absorbţie Emisie Fluorescenţă
Raman optică

UV Tranz. Tranz. Tranz.


Tranz. elect. Dispersie
Domeniu

elect. elect. vibr.


spectral

VIS
NIR
IR Tranz. vibr.
FIR
- - - -
211

Spectrometrie optică
de absorbţie
Spectrofotometrie de
absorbţie în domeniul
ultraviolet şi vizibil
212
Esenţa metodelor :
Măsurarea variabilelor de energie ale unei radiaţii monocromatice
la trecerea acesteia printr-un strat de probă, în funcţie o variabilă
de undă a radiaţiei

Variabile de undă : Variabile de energie :


- lungime de undă ( l ) ( nm ) - flux energetic ( F )
- număr de undă ( n ) ( cm-1 ) - intensitate de radiaţie ( I )
- frecvenţă ( f ) ( Hz ) - transmisie ( T ) (transmitanţă)
- viteză de propagare ( v ) - transmisie ( transmitanţă )
procentuală ( T% )
Relaţii între variabile de - absorbanţă ( A )
undă :
1
~
v  λf ; ν
λ
213

Definirea mărimilor
(variabilelor) energetice
caracteristice absorbţiei
optice

A(l)   lgT(l)  2  lg T%(l)


214
Moduri de reprezentare a spectrelor de absorbţie ( I )

Avantaj : domeniu extins pentru reprezentarea comportării optice


a probei
215
Moduri de reprezentare a spectrelor de absorbţie ( II )

Reprezentare potrivită pentru determinări cantitative


216
Moduri de reprezentare a spectrelor de absorbţie ( III )

Reprezentare utilizată pentru cataloage de spectre in


vederea identificării compusilor
217
Schema contructivă a unui spectrofotometru de absorbţie
Spectrofotometru monofascicol
218

Proba este deseori un amestec (ex. substanţa de interes &


solventul) din care interesează absorbţia optică numai a unei
(unor) componente chimice. Componentele chimice, care sunt
prezente în probă dar nu prezintă interes spectrofotometric
(formează numai mediul în care se găseşte substanţa de interes),
constituie "matricea" probei. Pentru a scade automat spectrul
matricei (deseori spectrul solventului) din spectrul amestecului,
se utilizează spectrofotometre cu fascicol dublu.
Spectrofotometru bifascicol
219
220
Relaţii cantitative între variabilele de energie
şi datele de interes analitic

Fie - A(l) - absorbanţa unei probe la lungimea de undă l ;


- d - grosimea probei (stratul de material prin care a
trecut radiaţia) ;
- c - concentraţia molară a speciei chimice care
absoarbe la lungimea de undă l ;

atunci, în condiţii ideale se verifică relaţia (Bouguer - Lambert - Beer)

k (l )d k*(l )d


F (l )  F 0 (l )  e  F 0 (l ) 10

F 0 (l )
k * (l )  c  e (l ) ; A (l )  lg  c  d  e (l )
F (l )
221
Relaţii cantitative între variabile de energie
şi datele de interes analitic
Conform relaţiei Bouguer - Lambert - Beer, absorbanţa este direct
proporţională cu concentraţia molară a speciei chimice răspunzătoare
de absorbţia optică.
Coeficientul e(l) se numeşte coeficient de absorbţie molară (sau
absorbtivitate molară) şi este o caracteristică a speciei chimice care
cauzează absorbţia optică ( depinde de l ).

Relaţia Bouguer - Lambert - Beer (BLB) se verifică cu următoarele


condiţii :
- concentraţia molară să nu fie prea mare ( c < 10-2 mol/l ) ;
- radiaţia difuză în spectrofotometru să fie neglijabilă ;
- speciile chimice răspunzătoare de absorbţie optică, sau matricea
(solventul) să nu fie implicate în echilibre chimice, dependente de
concentraţii.
222

Pierre Bouguer (1698 – 1758)


223

Johann Heinrich Lambert


(1728 – 1777)
224
Relaţii cantitative între variabile de energie
şi datele de interes analitic

La concentraţii mai mari decât 10-2 mol/l , relaţia Kortüm


descrie mai fidel dependenţa absorbanţei de concentraţie ;
A(l) proporţională cu expresia următoare :

ε (λ)  n (λ)
A (λ) ~ c  d  2 2
[n (λ) + 2]
În relaţia de mai sus n(l) este indicele de refracţie al probei la
lungimea de undă l.

Citirile de absorbanţă se efectuează, de regulă, la lungimea de undă


corespunzătoare unui maxim de absorbţie (excepţie de la această
regulă în cazul existenţei în sistemul studiat a unor echilibre
chimice).
Relaţii cantitative între variabile de energie 225
şi datele de interes analitic

Relaţia BLB deseori este utilizată în una din următoarele forme :


A (l )  e(l )  d  C ; A ( l )  A1cm (l )  d  C%
1%

în care:
A(l) este absorbanţa măsurată la lungimea de undă l ;
e(l) este absorbtivitatea molară a speciei absorbante la lungimea
de undă l ;
A11cm
%
(l ) este absorbţia specifică a speciei absorbante la
lungimea de undă l ;
d este grosimea de strat traversată de radiaţia electromagnetică ;
C este concentraţia molară în probă a speciei absorbante ;
C% este concentraţia procentuală (m/V) a speciei absorbante
Relaţii cantitative între variabile de energie 226
şi datele de interes analitic

Unităţi de măsură
(tolerate, utilizate în practica spectrofotometrică):

d tolerat
 cm
mol mol Relaţie între absorbţia
C   specifică şi absorbtivitatea
litru l
molară
gram g
C%  
decilitru dl A11cm
%
 M  10  e
litru l
e tolerat   în care:
mol  cm mol  cm
M este masa moleculară a
decilitru dl
1%
A1cm   speciei absorbante
tolerat gram  cm g  cm
227
Combinaţii de mărimi utilizate în controlul analitic al
medicamentelor
Raportul valorilor de absorbanţă, măsurate în spectrul unei specii chimice la
două lungimi de undă diferite l1 şi l2 , nu depinde (conform relaţiei BLB) de
concentraţia speciei chimice absorbante, deci se poate utiliza pentru stabilirea
identităţii chimice a componentei respective :

A(l1)
nu depinde de concentratie, (c), nici de grosimea de strat (d )
A (l 2 )

Diferenţa valorilor de absorbanţă, măsurate în spectrul unei specii chimice


la două lungimi de undă diferite l1 şi l2 , este direct proporţională
(conform relaţiei BLB) cu concentraţia speciei absorbante, deci se poate
utiliza pentru determinarea cantitativă a speciei chimice respective

A (l1)  A (l 2 )  c  d  [e (l1)  e (l 2 )]
228

Analiza
spectrofotometrică
a amestecurilor
229
Analiza spectrofotometrică a amestecurilor

În cazul amestecurilor absorbanţa se compune aditiv din


contribuţiile tuturor speciilor chimice absorbante prezente în
probă:

S S
A (l )  d   e i (l )  Ci  d   [A1cm (l)] i [C%] i
1%

i 1 i 1

În practica analitică se recurge la măsurarea absorbanţei la


lungimi de undă diferite şi utilizarea unei expresii de corectare
în cazurile în care benzile de absorbţie a două (sau mai multe)
specii chimice se suprapun într-o măsură considerabilă
Analiza spectrofotometrică a amestecurilor 230

A12 e 2 (l1 ) A 21 e1 (l 2 )
r21   ; r12  
A 22 e 2 (l 2 ) A11 e1 (l1 )

A1  A11 + A12  A11 + r21  A 22


A 2  A 21 + A 22  r12  A11 + A 22
Analiza spectrofotometrică a amestecurilor 231

Morton şi colaborării au propus o metodă spectrofotometrică,


practicată în domeniul ultraviolet, pentru determinarea vitaminei A
(în formă de alcool) după saponificarea prealabilă a formelor
esterificate (ex. acetat). La determinarea din soluţii uleioase (pe
baza de ulei din ficat de peşte), absorbţia uleiului interferă cu cea a
vitaminei A; din acest motiv autorii recomandă citirea absorbanţei
la trei lungimi de undă diferite (325 nm , 310 nm şi 334 nm) şi
calcularea unei valori corectate de absorbanţă, A(cor), conform
relaţiei de mai jos.

A(cor) = 6,815.A(325 nm) - 2,555.A(310 nm) - 4,260.A(334 nm)

Cantitatea de vitamină A din probă se determină utilizând valoarea


corectată a absorbanţei.
232

În 1966 E. Farkas a propus, pentru controlul purităţii


tolazolinei, raportul absorbanţelor măsurate la 257 nm şi
250 nm. Pentru o soluţie de tolazolină nedescompusă, acest
raport trebuie să aibă valoarea 0,55.

A(257 nm)
 0,55
A(250 nm)

Drept test de puritate (substanţă nedescompusă) pentru


soluţia etanolică de tolazolină V. Georgescu-Parazina şi A.
Cosmin au propus următorul raport de absorbanţe.

A(257 nm)
1,51   1,53
A(263,5 nm)
Teste de puritate 233

A(268 nm)
Ampicilină  1,10  1,30
A(266 nm)
A(361 nm)
Cianocobalamină  1,54  1,78
A(351 nm)
A(375 nm)
 0,31  0,33
A(267 nm)
Riboflavină
A(444 nm)
 0,36  0,39
A(267 nm)

Benzilpenicilină
sodică
A 0,18%
1cm 264 nm

 A10cm
,18%
 280 nm
 0,72
234
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor
Trasarea spectrelor etalon : pentru tratare mai simpla a problemei se considera
cazul in care fiecare din cele N solutii etalon conţine câte o singura componenta a
amestecului, la concentraţii (Cet)n , ( n = 1, 2 , . . . , N ) cunoscute

Soluţia Soluţia Soluţia Soluţia


--- ---
etalon “1” etalon “2” etalon “n” etalon “N”

(Cet)1 (Cet)2 --- (Cet)n --- (Cet)N


A1(1) A2(1) --- An(1) --- AN(1)
A1(2) A2(2) --- An(2) --- AN(2)
--- --- --- --- --- ---
A1(l) A2(l) --- An(l) --- AN(l)
--- --- --- --- --- ---
A1(L) A2(L) --- An(L) --- AN(L)
235
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor
Fie concentraţiile (necunoscute) celor “N” componente în probă :
C1 , C2 , . . . , Cn , . . . , CN

Conform relaţiei BLB rezultă :


N
Â(l)  A 0 +  d  e (l)  Cn ; (n  1,2,, N ; l  1,2, L)
n
n 1

Pentru cele “N” soluţii etalon (cu concentraţii cunoscute) rezultă :

A n (l)  d  en (l)  (Cet ) n ; (n  1,2,, N ; l  1,2,, L)


A n (l ) N Cn
d  e n (l )  Â(l)  A 0 +   A n (l )
(Cet ) n n 1 (Cet ) n
236
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor
N Cn
Â(l)  A 0 +   A n (l ) Raportul
Cn
exprimă
n 1 (Cet ) n (Cet ) n
de câte ori este mai mare
N concentraţia componentei “n”
Â(l)  A 0 +  p n  A n (l) în probă decât în soluţia etalon
n 1
(n  1,2,, N ; l  1,2,, L )
În practică L > N + 1 pentru a
“pn” reprezintă ponderea soluţiei minimiza efectul erorilor de măsurare
etalon nr. “n” în determinarea asupra rezultatului final al analizei
valorii absorbanţei amestecului sistem de ecuaţii supradeter-
(probei) minat, care se rezolvă cu metoda
celor mai mici pătrate
237
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor

 
L 2
F(A 0 , p n )   A(l)  Â(l) ; (n  1,2,, N)
l 1

L 2
 N

F(A 0 , p n )   A(l)  A 0   p n  A n (l)  min
l 1  n 1 
Condiţia de minim (necesară dar nu şi suficientă) :

F(A 0 , p n ) F(A 0 , p n )
0 ;  0 ; (n  1,2,.N)
A 0 p n
238
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a
componentelor

N L L
A 0  L +  p n   A n (l )   A (l )
n 1 l 1 l 1

L N L L
A 0   A n* ( l ) +  p n   A n ( l )  A n* ( l )   A ( l )  A k* ( l )
l 1 n 1 l 1 l 1
(n*  1,2,, N)

După rezolvarea sistemului de ecuaţii A0 şi pn

Concentraţiile componentelor din probă se calculează astfel :


Cn = pn.(Cet)n ; ( n = 1 , 2 , . . . , N )
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a 239
componentelor
După rezolvarea sistemului de ecuaţii în raport cu A0 şi
pn (n = 1 , 2 , . . . , N) se recalculează absorbanţele probei la cele
L valori de lungime de undă : N
Â(l)  A 0 +  p n  A n (l)
Potrivirea valorilor de n 1
absorbanţă măsurate ale (l  1,2,, L )
probei cu cele recalculate,
se exprimă prin pătratul 2
 L

  [A(l)  A ]  [Â(l)  A ]
coeficientului de corelare
(r2) :
l 1 
0 < r2 < 1 r2  L L
[A(l)  A]  [Â(l)  A]
1 L 1 L l 1 l 1

L l 1
Â(l)   A(l)  A
L l 1
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a 240

Exemplu componentelor
Exemplu L = 17 ; N = 3 ; absorbanţe măsurate la 17 lungimi de undă 241

Amestec (probă) Acid salicilic Cafeină Paracetamol


0 ,4 8 7 8 0 ,0 9 0 1 0 ,2 0 9 7 1 ,7 7 1 5
0 ,4 4 5 4 0 ,0 5 5 0 0 ,2 9 0 6 1 ,4 7 6 1
0 ,4 1 4 0 0 ,0 5 3 4 0 ,3 9 7 5 1 ,11 6 9
0 ,3 9 8 7 0 ,0 7 2 7 0 ,5 0 8 0 0 ,7 8 7 7
0 ,4 0 1 6 0 ,11 4 7 0 ,5 8 7 9 0 ,5 6 0 7
0,4105 0,1 8 1 6 0 ,6 0 1 4 0,4452
0 ,4 0 5 1 0 ,2 7 2 0 0 ,5 2 6 5 0 ,3 8 4 8
0 ,3 7 4 1 0 ,3 7 5 0 0 ,3 7 8 8 0 ,3 1 3 6
0 ,3 2 4 6 0 ,4 6 4 6 0 ,2 0 0 8 0 ,2 3 3 8
0,2793 0,5 1 7 1 0 ,0 7 4 7 0,1551
0 ,2 3 9 1 0 ,4 9 9 8 0 ,0 2 5 7 0 ,0 8 6 0
0 ,1 9 5 2 0 ,4 2 1 4 0 ,0 1 4 9 0 ,0 4 2 3
0 ,1 4 0 1 0 ,2 9 2 9 0 ,0 1 3 0 0 ,0 2 8 8
0 ,0 8 8 2 0 ,1 6 5 8 0 ,0 111 0 ,0 2 4 2
0 ,0 5 5 3 0 ,0 8 4 0 0 ,0 1 0 7 0 ,0 2 2 6
0 ,0 3 5 2 0 ,0 3 7 7 0 ,0 0 8 6 0 ,0 1 9 7
0 ,0 2 8 2 0 ,0 2 0 2 0 ,0 0 9 8 0 ,0 2 0 9
Analiza amestecurilor fără separarea chimică a 242
Exemplu componentelor
L = 17 ; N = 3 Acid salicilic Cafeină Paracetamol
Amestec (probă)
(Cet)1 (Cet)2 (Cet)3
Concentraţii în
soluţii (mg/l)
C1 ; C2 ; C3 20,02 10,03 20,03

17,0000  A 0 + 3,71800  p1 + 3,86970  p 2 + 7,48990  p3  4,72240


3,71800  A 0 + 1,31281  p1 + 0,71305  p 2 + 0,99028  p3  1,04982
3,86970  A 0 + 0,71305  p1 + 1,71985  p 2 + 2,62596  p3  1,53587
7,48990  A 0 + 0,99028  p1 + 2,62596  p 2 + 8,03468  p3  3,13591
A 0  0,01252 ; p1  0,39947 ; p 2  0,39183 ; p3  0,20133
C1  p1  (Cet )1  0,39947  20,02  7,997 mg / l acid salicilic
C2  p 2  (Cet ) 2  0,39183  10,03  3,930 mg / l cafeina
C3  p3  (Cet )3  0,20133  20,02  4,030 mg / l paracetamol
243
A (l ) Â(l)
0,4878 0,4873
0,4454 0,4455
0,4140 0,4144
0,3987 0,3991
0,4016 0,4016
0,4105 0,4103
0,4051 0,4049
0,3741 0,3738
0,3246 0,3237
0,2793 0,2797
0,2391 0,2395
0,1952 0,1952
0,1401 0,1404
0,0882 0,0880
0,0553 0,0548
0,0352 0,0349
0,0282 0,0286 R2 = 0,999994
Supresarea contributiei ingredientilor 244
CARTER, G.T., SCHIESSWOHL, R.E., BURKE, H., YANG, R.
J. Pharma. Sci., (1982) 71: p. 383

ε I (λ 2 )
 R I (λ1, λ 2 ) ε I (λ 2 ) - R I (λ1, λ 2 )  ε I (λ1 )  0
ε I (λ1 )
εS (λ 2 ) εS (λ 2 ) - R I (λ1, λ 2 )  εS (λ1 )  0
 R I (λ1, λ 2 )
εS (λ1 )
A(λ1 )  d  ε I (λ1 )  CI + εS (λ1 )  CS 
A(λ 2 )  d  ε I (λ 2 )  CI + εS (λ 2 )  CS 

ΔA  R I (λ1 , λ 2 )  A(λ1 )  A(λ 2 ) 


 d  CS  R I (λ1 , λ 2 )  εS (λ1 )  εS (λ 2 ) 
 d  CI  R I (λ1 , λ 2 )  ε I (λ1 )  ε I (λ 2 )
Supresarea contributiei ingredientilor 245

Spectrele Lovastatinei si ingredientilor suprapuse

HO O
C
O
O
C
H3C O
H
CH3

H3C
246
Supresarea contributiei ingredientilor

Se observă din spectre că :

A I (246,8 nm) ε I (246,8 nm) 0,5938


   0,9467
A I (243,8 nm) ε I (243,8 nm) 0,6271
AS (246,8 nm) εS (246,8 nm) 1,1186
   1,1270
AS (243,8 nm) εS (243,8 nm) 0,9925

Rezultă că :
AI(246,8 nm) – 0,9467.AI(243,8 nm) = 0
indiferent de concentraţia ansamblului de ingredienţi, în timp ce . . .
AS(246,8 nm) – 0,9467.AS(243,8 nm) ≠ 0
247
Supresarea contributiei ingredientilor

Dreapta de etalonare Semnal corectat vs. Concentratie (mg/ml)


0.2000
y = semnal corectat (d = 1 cm)
0.1800 y = 2.808646x + 0.000086
R² = 0.999879
0.1600

0.1400

0.1200

0.1000

0.0800

0.0600

0.0400

0.0200

0.0000
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070
x = concentratie ( mg/ml )
248
Supresarea contributiei ingredientilor
Rezultatele analizei produsului “MEDOSTATIN”
Blister 1 Blister 2 Blister 3
Semnal Cantitate Semnal Cantitate Semnal Cantitate
optic (mg/comprimat) optic (mg/comprimat) optic (mg/comprimat)
0,1181 21,02 0,1184 21,08 0,1142 20,33
0,1132 20,15 0,1075 19,13 0,1187 21,13
0,1134 20,19 0,1126 20,05 0,1117 19,88
0,1127 20,07 0,1148 20,43 0,1094 19,48
0,1112 19,79 0,1160 20,66 0,1135 20,21
0,1114 19,83 0,1131 20,14 0,1134 20,19
0,1131 20,13 0,1152 20,51 0,1186 21,11
0,1180 21,00 0,1110 19,77 0,1142 20,33
0,1126 20,05 0,1130 20,12 0,1149 20,45
0,1131 20,13 0,1182 21,05 0,1125 20,02
Medie: 20,236 Medie: 20,294 Medie: 20,313
STD: 0,429 STD: 0,590 STD: 0,507
249
Metoda adaosurilor

Spectrul amesteului Aam(l)


(substanta de interes si ingredienti)
Spectrul ingredientilor A0(l)
Fie:
A0(l1) = A0(l2)
250
Metoda adaosurilor

A0(l1) = A0(l2)
251
Spectrofotometrie cu derivare in raport cu lungimea de unda
Exemplu: determinarea prin spectrofotometrie a Diazepamului
si a Bromurii de Otiloniu in amestec
B. Morelli : Fresenius’Anal. Chem., 1997:357, 1179

C2H5 O
O H 3C
O N+ C
C C O
CH3 C2H5
N N
Br
-
NH
C
O

H3C O
Cl
Diazepam Bromura de Otiloniu
(anxiolitic, sedativ, (relaxant al musculaturii netede
anticonvulsant, relaxant intestinale)
al muschilor scheletici)
B. Morelli : Fresenius’Anal. Chem., 1997:357, 1179 252
A.Y.E. Sayed, N.A.E. Salem : Analytical Sciences 2005:21, 595

Determinarea
Diazepamului si
Bromurii de Otiloniu
O O
C C CH3
N N

Cl
C2H5 O
H 3C N+ C
O
C2H5
Br
-
NH
C
O

H3C O
253
Determinarea Paracetamolului si acidului ascorbic din Eferalgan
V. David, Iulia Gabriela David, V. Dumitrescu

Metoda “zero crossing”

Spectre de absorbtie
(1) Paracetamol
(2) Acid ascorbic
(3) Eferalgan

Spectrele de absorbtie ale


constituentilor se suprapun
in toata regiunea spectrala
investigata
254
Determinarea Paracetamolului si acidului ascorbic din Eferalgan
V. David, Iulia Gabriela David, V. Dumitrescu
Metoda “zero crossing”
In spectrul derivat al
Eferalganului la 243,5 nm
contribuie numai acidul
ascorbic (2), iar la 264,5 nm
numai Paracetamolul (1) la
absorbtie globala.
In concluzie:
- la 243,5 nm se poate
determina concentratia
acidului ascorbic (2);
- la 264,5 nm se poate
determina concentratia
Paracetamolului (1)
255
Metoda “First Derivative Ratio Spectrophotometry”
Absorbanta unui amestec de componente X , Y , Z etc., la
lungimea de unda l, este :

A(l)  d  [eX (l)  CX + eY (l)  CY + e Z (l)  CZ + ]

Absorbantele Aet
X , A et
Y , A et
Z etc. ale unor solutii etalon care

contin componentele unice X , Y , Z etc. la concentratii molare


cunoscute Cet
X , Cet
Y , Cet
Z etc. sunt :

A et
X ( l )  d  e X ( l )  C et
X

F. Salinas, J.J. Berzas, A. Espinosa A et


Y ( l )  d  e Y ( l )  C et
Y
Talanta, 1990:37,347 A et
Z ( l )  d  e Z ( l )  C et
Z

256
A(l)  d  [eX (l)  CX + eY (l)  CY + e Z (l)  CZ + ] (*)

A et
X ( l )  d  e X ( l )  C et
X
A et ( l )  d  e ( l )  C et Termenii incadrati in
Y Y Y (*) acest semn nu depind
A et
Z ( l )  d  e Z ( l )  C et
Z de lungimea de unda

A (l )  C X C Y e Y (l ) C Z e Z (l ) 
 d   et + et  + et  + 
A X (l )  C X C X e X (l ) C X e X (l )
et

A (l )  C X e X (l ) C Y C Z e Z (l ) 
 d   et  + et + et  + 
A Y (l )  C Y e Y (l) C Y C Y e Y (l )
et

A (l )  C X e X (l ) C Y e Y (l ) C Z 
 d   et  + et  + et + 
A Z (l )  C Z e Z (l ) C Z e Z (l ) C Z
et


 C X C Y e Y (l ) C Z e Z (l )  257
A (l )
 d   et + et  + et  + 
A X (l )  C X C X e X (l ) C X e X (l )
et
 Dupa derivare
 C X e X (l ) C Y C Z e Z (l )  termenii marcati
A (l )
 d   et  + et + et  +  (*)
A Y (l )  C Y e Y (l) C Y C Y e Y (l )
et

cu dispar
A (l )  C X e X (l ) C Y e Y (l ) C Z 
 d   et  + et  + et + 
A Z (l )  C Z e Z (l ) C Z e Z (l ) C Z
et



d  A (l )   C Y d  e Y (l )  C Z d  e Z (l )  
D1X    et   d   et    + et    + 
dl  A X (l)   C X dl  e X (l)  C X dl  e X (l)  
d  A (l )   C X d  e X (l )  C Z d  e Z (l )  
D1Y    et   d   et    + et    + 
dl  A Y (l)   C Y dl  e Y (l)  C Y dl  e Y (l)  
d  A (l )   C X d  e X (l )  C Y d  e Y (l )  
D1Z    et   d   et    + et    + 
dl  A Z (l)   C Z dl  e Z (l)  C Z dl  e Z (l)  
                                 
258

d  A (l )   C Y d  e Y (l )  C Z d  e Z (l )  
D1X    et   d   et    + et    + 
dl  A X (l)   C X dl  e X (l)  C X dl  e X (l)  
d  A (l )   C X d  e X (l )  C Z d  e Z (l )  
D1Y    et   d   et    + et    + 
(*)
dl  A Y (l)   C Y dl  e Y (l)  C Y dl  e Y (l)  
d  A (l )   C X d  e X (l )  C Y d  e Y (l )  
D1Z    et   d   et    + et    + 
dl  A Z (l)   C Z dl  e Z (l)  C Z dl  e Z (l)  
                                 

Se observa :
D1X nu depinde de concentratia molara CX a componentei X in amestec
D1Y nu depinde de concentratia molara CY a componentei Y in amestec
D1Z nu depinde de concentratia molara CZ a componentei Z in amestec
---------------------------------------------------------
259
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
N.K. Vipul, M. Rajshree : Anal. Sci., 2007:23, 445

O
OH
C OH
N O
N
H
Atorvastatin :
C
OH
reduce in special
colesterolemia serica
Cl F

Fenofibrat :
reduce in special
C O C O concentratia trigliceridelor
O O serice
260
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
(1) 12 g/ml sare calciu a Atorvastatiei
(2) 12 g/ml Fenofibrat
(3) Amestecul celor doua solutii
261
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
4 , 8 , 12 , 16 , 20 si 22 g/ml Atorvastatin-Ca in MeOH
Divizor : 16 g/ml Fenofibrat in MeOH
262
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
2 , 4 , 8 , 10 , 12 , 16 , 18 , si 20 g/ml Fenofibrat in MeOH
Divizor : 12 g/ml Atorvastatin-Ca in MeOH
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului 263
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”

4 , 8 , 12 , 6 , 20 si 22 g/ml Atorvastatin-Ca in MeOH


Divizor : 16 g/ml Fenofibrat in MeOH
Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului 264
cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”

2 , 4 , 8 , 10 , 12 , 16 , 18 , si 20 g/ml Fenofibrat in MeOH


Divizor : 12 g/ml Atorvastatin-Ca in MeOH
265

Analiza
spectrofotometrică
a sistemelor cu
echilibre chimice
266
Determinarea numărului de echilibre chimice independente
Într-o soluţie componentele chimice X şi Y, prezente în momentul preparării
soluţiei, interacţionează chimic în diferite rapoarte stoechiometrice şi prin
procese de echilibru formează M compuşi chimici noi :

a b a b
Importanţa în controlul
medicamentului:
a b a b numeroase substanţe active for-
mează complecşi de transfer de
a b a b sarcină (complecşi moleculari)
fie cu substanţele active ale altor
medicamente, fie cu unii
a b a b ingredienţi este afectată
biodisponibilitatea medicamen-
tului
a b a b

Scopul urmărit este determinarea numărului de echilibre chimice


independente din sistem
267
Determinarea numărului de echilibre chimice independente

Se vor nota în continuare :


eX , eY absorbtivitatea molară a speciilor X respectiv Y ;
CX concentraţia analitică (iniţială) a componentei X ;
CY concentraţia analitică (iniţială) a componentei Y ;
[X] , [Y] concentraţiile de echilibru ale speciilor X respectiv Y ;
[(XY)m] concentraţia de echilibru a speciei XamYbm

Bilanţul speciilor chimice X şi X se exprimă astfel :

CX = [X] + a1.[(XY)1] + a2.[(XY)2] + . . . + am.[(XY)m] + . . . +


+ aM.[(XY)M]

CY = [Y] + b1.[(XY)1] + b2.[(XY)2] + . . . + bm.[(XY)m] + . . . +


+ bM.[(XY)M]
268
Determinarea numărului de echilibre chimice independente

Totalitatea speciilor chimice prezente în sistem verifică aditivitatea


absorbanţelor. Absorbanţa amestecului, măsurată la lungimea de undă
l după stabilirea echilibrului, este :
A(l) = d.{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + e1(l).[(XY)1] + . . . + eM(l).[(XY)M]}

După exprimarea concentraţiilor de echilibru [X] şi [Y]


în funcţie de concentraţiile analitice cX şi cY , rezultă:

A(l) = d.{eX(l).(CX - a1.[(XY)1] - . . . - am.[(XY)m] - . . . -


- aM.[(XY)M] ) + eY(l).(CY - b1.[(XY)1] - . . . -
- bm.[(XY)m] - . . . - bM.[(XY)M] ) + e1(l).[(XY)1] + . . . +
+ em(l).[(XY)m] + . . . + eM(l).[(XY)M]}
269
Determinarea numărului de echilibre chimice independente

În cazul în care componentele iniţiale X şi Y nu ar fi implicate în


nici un echilibru chimic, absorbanţa soluţiei, A*(l), s-ar compune
aditiv numai din contribuţiile acestor două componente.

A*(l) = d.(eX(l).CX + eY(l).CY)


Diferenţa dintre absorbanţa de echilibru a sistemului şi absorbanţa A*(l)
este absorbanţa de exces Aex(l) ; aceasta se poate atribui modificărilor
din sistem cauzate de echilibrele chimice.

Aex(l) = A(l) – A*(l) = A(l) – d.(eX(l).CX + eY(l).CY)


Înlocuind expresiile pentru A(l) şi A*(l) în relaţia de mai sus, rezultă :
M
Aex(l) = d .
m=1
S [(XY)m].(em(l) – eX(l).am – eY(l).bm)
270
Determinarea numărului de echilibre chimice independente
Se prepară s = 1 , 2 , . . . , S soluţii care se deosebesc prin valorile de concentraţii
analitice CX şi CY . Se măsoară pentru fiecare soluţie, la acelaşi set de lungimi de
undă l1 , l2 , . . . , lL convenabil ales, absorbanţa de exces Asex(l) ; (s = 1 ,
2 , . . . S). Se impune ca atât numărul S al soluţiilor preparate cât şi numărul L de
lungimi de undă să fie mai mare decât numărul de echilibre M prognostizat. Valorile
Asex(l) ; (s = 1 , 2 , . . . S) , (l1 , l2 , . . . , lL) obţinute se organizează într-o matrice :

 A1ex (l1)Asex (l1)ASex (l1) 


 
    
A   A1ex (li ) Asex (li ) ASex (li ) 
e x Prin determinarea rangului matricii se
     poate preciza numărul M al speciilor
 ex  chimice care coexistă în soluţie ca
 A (l )A ex (l )A ex (l ) 
 1 L s L S L  urmare a echilibrelor, în afara speciilor
X şi Y, deci numărul speciilor ale
căror concentraţii de echilibru se pot modifica independent prin modificarea
concentraţiilor analitice CX şi CY.
Determinarea numărului de echilibre chimice independente 271
Măsurarea absorbanţei de exces

Soluţie stoc X Soluţie stoc Y Soluţie stoc X Soluţie stoc Y


(CX)0 (CY)0 (CX)0 (CY)0

(VX)s (s = 1, . . . , S) (VX) (VX)s (s = 1, . . . , S) (VX)s


s
solvent

amestecare
V (CX)s V (CY)s
solvent
[X]s
A* Xs(l) A* Ys(l) [Y]s V
[XaYb]s
însumare

A*s(l) = A*Xs(l) + A*Ys(l) scădere As(l)

Aesx(l) = As(l) - A*s(l)


Determinarea numărului de echilibre chimice independente 272
Măsurarea absorbanţei de exces

Scadere
Amestecare
Punct izosbestic 273

a b a b CX = [X] + a.[XaYb]

A(l) = d .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXY(l).[XaYb]}


Se va admite, că eY(l) este neglijabilă în domeniu spectral
investigat ; în acest caz rezultă :

A(l) = d .{eX(l).[X] + eXY(l).[XaYb]}

Dacă în domeniul spectral există cel putin o lungime de undă (l*)


pentru care eXY(l*) = a.eX(l*) = e(l*) atunci rezultă :

A(l*) = d .{eX(l*).[X] + a.eX(l*).[XaYb]}=

= d .{e(l*).[X] + a.e(l*).[XaYb]}=
= d . e(l*) .{ [X] + a.[XaYb]} = d . e(l*).CX
Punct izosbestic 274

Exemplu : componenta Y (a cărei absorbţie este neglijabilă) poate fi


protonul ( H+ ) ; de exemplu echilibrul protolitic al eugenolului
(protonul nu absoarbe în ultraviolet)

Apariţia unui punct izosbestic poate fi cauzată nu numai de un


echilibru, dar şi de un proces ireversibil, cu condiţia ca în sistem
să se desfăşoare un singur proces

Spectrele suprapuse, înregistrate în momentele diferite ale desfăşu-


rării procesului, pot prezenta punct izosbestic cu condiţia să existe
o lungime de undă (l*) pentru care eX(l*) = eY(l)
275
Punct izosbestic (la procese ireversibile)

Acid acetilsalicilic (Aspirină) Anion salicilat

1,4-dihidro-2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil)- 1,4-dihidro-2,6-dimetil-
-3,5-piridin-carboxilat de dimetil -4-(2-nitrozofenil)-3,5-
(Nifedipin) piridin-carboxilat de dimetil
276

Fototransformarea compusului Nifedipin


277
Fototransformarea acetatului de retinil (iradiere: 300 – 400 nm)
1.20

1.00

289 nm
0.80
Abszorbanta (d = 1 cm)

0.60

0.40

0.20

0.00
264 274 284 294 304 314 324 334 344 354
lungime de unda (nm)
278
Determinarea raportului stoechiometric. Metoda Job.
( metoda variaţiei continue )
În cazul în care într-un sistem componentele iniţiale (X şi Y) se implică
într-un singur echilibru chimic de tipul celui de mai jos, se poate determina
raportul coeficienţilor stoechiometrici asociaţi cu speciile iniţiale X şi Y
prin prelucrarea convenabilă a datelor de absorbţie optică.

a b a b
Metoda variaţiei continue 279

Concentraţiile speciilor X şi Y în una din soluţiile preparate :

VX VY
CX  C  ; CY  C 
VX + VY VX + VY
Fracţiile molare ale substanţelor dizolvate în amestecul obţinut
sunt:
nX C  VX VX
xX    x
n X + n Y C  VX + C  VY VX + VY
nY C  VY VY
xY    1 x
n X + n Y C  VX + C  VY VX + VY

Concentraţiile molare CX şi CY se exprimă în funcţie de


variabila introdusă (x) astfel:
CX = C.x ; CY = C.(1-x)
Metoda variaţiei continue 280

Concentraţiile molare de echilibru ale speciilor prezente, X , Y şi


XaYb , satisfac relaţiile :
[X] = CX – a.[XaYb] = C.x – a.[XaYb]

[Y] = CY – b.[XaYb] = C.(1 – x) – b.[ XaYb]

[X]a.[Y]b = K.[XaYb]

Dacă se prepară o serie de soluţii de lucru amestecând volume diferite


(VX)i şi (VY)i , (i = 1 , 2 , . . . , S) ale soluţiilor stoc, astfel încât la
fiecare soluţie de lucru suma volumelor amestecate să fie aceeaşi,
(VX)i + (VY)i = V ; i = 1 , 2 , . . . , S, atunci valorile xi şi concentraţiile
de echilibru [X]i , [Y]i , [XaYb]i vor fi diferite.
Metoda variaţiei continue 281

Fie x0 valoarea variabilelei x pentru care concentraţia de echilibru


[XaYb] are valoare maximă ( [XaYb]0 = max ) . . .
. . . atunci în soluţia respectivă concentraţiile de echilibru corespun-
zatoare ale celorlalte specii se vor nota [X]0 şi [Y]0 , iar derivata
concentraţiei [XaYb] în raport cu variabila x , pentru x = x0 , este nulă.

 d[X a Yb ] 
  0
 dx  x
 0

a x0
Se poate demonstra faptul că : 
b 1 x0
În caz concret, valoarea x0 se poate determina din date spectrofo-
tometrice.
Metoda variaţiei continue 282

Dacă la amestecarea celor două soluţii stoc componentele X şi Y ar


coexista fără a participa la echilibru, atunci absorbanţa (măsurată la
lungimea de undă l) soluţiei de lucru (caracterizată de valoarea “ x ”
a variabilei de echilibru) ar fi A*(l,x) :

A*(l,x) = d .{eX(l).C.x + eY(l).C.(1-x)} + Asolv(l)


Dacă componentele X şi Y interacţionează chimic şi se realizează
starea de echilibru, atunci absorbanţa soluţiei de lucru este A(l,x):

A(l,x) = d .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXaYb.[XaYb]} + Asolv(l)


A(l,x) = d .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXaYb.[XaYb] –
– eX(l).C.x– eY(l).C.(1-x)}
Metoda variaţiei continue 283

Se poate demonstra că :
 d A ( l ) 
  0
 dx  x 0

Absorbanţa de exces are


valoare extremă tocmai
pentru x = x0

modalitatea de
determinare experi-
mentală a valorii x0.
284

Aspecte calitative ale


analizei spectrofotometrice
în domeniul spectral
ultraviolet (UV)
şi vizibil (VIS)
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 285

Mecanismul cuantic de producere a spectrelor de absorbţie - tranziţii


de electroni din stările staţionare inferioare (fundamentală) în stările
staţionare superioare.
Domeniul de lungimi de undă: - ultraviolet de vid : l < 200 nm ;
- ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm ;
- vizibil (VIS) : 380 - 800 nm.
Absorbţia - la probele aflate în starea condensată - se prezintă în forma de
benzi mai mult sau mai puţin largi.
Lungimea de undă a maximului benzii de absorbţie este cu atât mai
mare cu cât este mai mică diferenţa de energie între stările staţionare
(fundamentală şi excitată) implicate (conform relaţiei Max Plank).
Intensitatea absorbţiei, deci şi valoarea coeficientului molar de absorbţie
e(l), este proporţională cu probabilitatea tranziţiei electronice şi cu
modificarea momentului de dipol electric al moleculei în timpul tranziţiei
electronice.
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 286
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 287

În cazul moleculelor substanţelor organice, cele mai frecvente tipuri


de tranziţii electronice moleculare sunt:
- tranziţii de tipul  - * se realizează de pe un orbital molecular de
legătură  pe un orbital molecular de antilegătură * ;
- tranziţii de tipul   * se realizează de pe un orbital molecular de
legătură  pe un orbital molecular de antilegătură * ;
- tranziţii de tipul n - * se realizează de pe un orbital molecular de
nelegătură n pe un orbital molecular de antilegătură * ;
- tranziţii de tipul n - * se realizează de pe un orbital molecular de
nelegătură n pe un orbital molecular de antilegătură *.
Tranziţiile   * sunt caracteristice moleculelor care posedă numai legături
 (în special alcanii, izoalcanii, cicloalcanii). Deoarece energia tranziţiei este
în general mare, benzile de absorbţie produse de acest tip de tranziţie sunt
situate în domeniul ultraviolet de vid ( importanţă analitică redusă).
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS ( IV ) 288

Tranziţiile   * sunt caracteristice moleculelor nesaturate care


posedă, pe lângă legături , şi legături chimice de tip  (în special la
alchene, poliene, hidrocarburi aromatice, dar şi la molecule nesatura-
te în care un heteroatom este implicat într-o legătură ).
Energia tranziţiilor de acest tip este mai mică decât în cazul tranziţiei
  *, deci banda de absorbţie produsă apare la lungimi de undă
mai mari (accesibile spectrofotometrelor obişnuite).
Extinderea conjugării electronilor  în starea fundamentală, depla-
sează maximul benzii de absorbţie spre lungimi de undă mai mari
("deplasare batocromă").

Reprezentarea simplificată
a unei tranziţii   *
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 289

Tranziţiile n - * sunt caracteristice moleculelor saturate care conţin un heteroa-


tom cu electroni neimplicaţi în legătură chimică în starea fundamentală a moleculei
(alcoolii saturaţi, eterii saturaţi, aminele saturate, derivaţii halogenaţi saturaţi).
Benzile de absorbţie asociate cu acest tip de tranziţie apar în domeniul ultraviolet,
la lungimii de undă mici. Maximul de absorbţie se deplasează batocrom odată cu
accentuarea electronegativităţii heteroatomului.

Tranziţiile n - * sunt caracteristice moleculelor nesaturate care posedă heteroatom


cu electroni neimplicaţi în legătură chimică. Aceste tranziţii produc în general benzi
de absorbţie intense, la valori relativ mari ale lungimii de undă, domeniu accesibil
uşor de spectrofotometrele obişnuite, motiv pentru care aceste tranziţii au cel mai
însemnat rol analitic. Extinderea conjugării n -  sau    în starea fundamentală
a moleculei cauzează deplasarea batocromă a benzii de absorbţie.

Reprezentarea simplificată a
unei tranziţii p - *
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 290

Factorii care influenţează poziţia şi intensitatea benzilor :


- conjugarea electronică în starea fundamentală a moleculei
determină intensificarea absobţiei şi deplasarea batocromă a
maximului benzii de absorbţie ;
- pH - ul mediului poate influenţa atât poziţia cât şi intensitatea
benzilor de absorbţie în cazul în care molecula absorbantă
este implicată în echilibre protolitice ;
- mediul influenţează poziţia maximului benzii de absorbţie
prin solvatarea diferenţiată a moleculei în starea fundamentală
şi starea excitată (solvatocromie) ;
- într-o oarecare măsura temperatura poate influenta poziţia
şi/sau intensitatea benzii de absorbţie (termocromism).
291
Influenţa solventului asupra poziţiei benzii de absorbţie

Efect hipsocrom Efect batocrom


Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 292

Influenţa factorilor structurali asupra poziţiei şi intensităţii


benzilor de absorbţie
Realizarea unor tranziţii electronice de anumite tipuri este legată de existenţa
unor fragmente structurale specifice în constituţia moleculei absorbante.
Aceste fragmente structurale sunt cromoforii moleculei. Din forma spectrelor
de absorbţie se pot formula concluzii privind natura cromoforilor. Cromoforii
tipici sunt părţile moleculei peste care se întind electronii  delocalizaţi.
Modificări structurale sau de mediu pot modifica atât poziţia maximului de
absorbţie (deplasare spre lungimi de undă mai mari - deplasare batocromă -
sau deplasare spre lungimi de undă mai mici - deplasare hipsocromă) cât şi
intensitatea absorbţiei (diminuarea absorbţiei - efect hipocrom - sau sporirea
absorbţiei - efect hipercrom).
Grupările de atomi din moleculă care nu constituie cromofor dar care, grefate
de un cromofor, pot induce deplasări batocrome sau hipsocrome, se numesc
grupări auxocrome.
293
Influenţa factorilor structurali asupra
poziţiei şi intensităţii benzilor de absorbţie
294
Influenţa conjugarii  si a solventului asupra spectrului de absorbtie
in UV-VIS

n = 1 l ≈ 30 nm
(efect batocrom)

n = 1 ef ≈ (1,5-2)xei
(efect hipercrom)

Cresterea polaritatii solventului


determina ...

... efect batocrom la -*;

... efect hipsocrom la n-*;

... efect hipsocrom la n-*


295

Spectrometrie de
fluorescenţă
Spectrometrie de fluorescenţă 296

Moleculele unei probei, în urma absorbţiei unei radiaţii, se pot ajunge în


stări excitate de diferite tipuri: - stări singlet (este posibilă revenirea în
starea fundamentală) ;
- stări triplet (revenirea este "interzisă" în
starea fundamentală).
Revenirea în starea fundamentală :
- prin proces radiativ (energia stării excitate se emite în forma de radiaţie
electromagnetică);
- prin proces neradiativ (energia stării excitate este disipată în formă de
căldură prin ciocniri cu alte molecule din probă).
În modul de revenire radiativ se emite o radiaţie caracteristică probei.
Revenirea radiativă în starea fundamentală este desemnată prin denumirea
comună: luminescenţă
Revenirea radiativă dintr-o . . .
- stare excitată de tip triplet: - fosforescenţă Denumire comună :
- stare excitată de tip singlet: - fluorescenţă luminescenţă
Spectrometrie de fluorescenţă 297

Schema constructivă a
unui spectrofluorimetru

Randamentul F F (l 2 ) F F (l 2 )
cuantic al fluorescenţei :  (l1, l 2 )  
F ab (l1) F 0 (l1)  F (l1)
Spectrometrie de fluorescenţă 298
Condiţii necesare pentru apariţia fluorescenţei utilizabile în scopuri analitice:
- proba să prezinte absorbţie puternică la lungimea de undă de excitare l1
( prezenţa unor cromofori adecvaţi ) ;
- molecula să se întoarcă în starea fundamentală printr-un proces radiativ ;
- deplasarea Stokes ( vezi mai jos ) să fie suficient de mare
299

George Gabriel Stokes


(1819 – 1903)
300
Determinarea fluorimetrica a antibioticului Gatifloxacin
K. Venugopal si colab., Indian J. of Pharm. Sci., 2006:68 (6), 726-730

O O
F C C
OH

N N
HN O

Gatifloxacin: antibiotic
de generatia a patra a
fluorochinolonelor

Spectrele de absorbtie si de emisie ale solutiei (10 mM HCl) de Gatifloxacin


Determinarea fluorimetrica a antibioticului Gatifloxacin 301
K. Venugopal si colab., Indian J. of Pharm. Sci., 2006:68 (6), 726-730
6000

y = 36.084615x + 7.730769
5000 R2 = 0.999991

4000

3000

2000

1000

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
302

H H
+
N

O O -
Cl
O

Clorhidrat de Paroxetin
Absorbţie / Emisie 400 l1 300
1 H H
+
350 l2 N

2 O O -
300
l3 Cl
O
3
250 l4
200 l5 4 F
Clorhidrat de Paroxetin
l6 5
150 Abs Fluo
6
100

50

0
250 300 350 400 450 500
Lungime de undă (nm)
Spectrometrie de fluorescenţă 304

Explicarea deplasării Stokes


305
Spectrometrie de fluorescenţă

Structurile heterociclice, capabile de conjugare n - , prezintă absorbţie pu-


ternică, deci în multe situaţii sunt capabile să genereze fluorescenţă semnifi-
cativă. Modificările structurale care amplifică absorbţia, deseori determină
creşterea fluorescenţei (această regulă însă nu este universal valabilă).

Multe substanţe ionizabile prezintă fluorescenţă numai în una din


formele de ionizare - fluorescenţa este dependentă de pH-ul mediului
indicatori de fluorescenţă acido-bazici.

Exemplu :

a a
306
Spectrometrie de fluorescenţă
Dacă concentraţia substanţei fluorescente în probă este mare, atunci lumina
incidentă este absorbită în cea mai mare parte de primul strat de substanţă,
la straturile următoare ajungând flux de radiaţie mai mic.
Fluorescenţa probei este neuniformă şi fluxul de radiaţie emis de
probă ( FF(l2) ) nu este proporţional cu concentraţia speciei chimice
fluorescente. Din acest motiv măsurătorile de fluorescenţă se execută cu
concentraţii mici ale speciei fluorescente.
 e ( l 1 ) d C
F ab (l1 )  F 0 (l1 )  F (l1 )  F 0 (l1 )  (1  10 )
 e ( l 1 )  d C
F F (l )  (l1 , l 2 )  F ab (l1 )  (l1 , l 2 )  F 0 (l1 )  (1  10 )
 e ( l 1 ) d C Dacă e(l1).d.C < 0,05 ,
10 1 ln(10 )d e ( l1 )C
eroarea relativă < 0,12 %

F F (l 2 )  (l1 , l 2 )  F 0 (l1 )  ln(10)  d  e (l1 )  C


307
Spectrometrie de fluorescenţă

F F (l 2 )  (l1, l 2 )  F 0 (l1 )  ln(10)  d  e(l1 )  C


Această relaţie stă la baza determinărilor cantitative prin măsurarea
fluorescenţei.
La concentraţii foarte mici fluxul radiaţiei de fluorescenţă este (cu aproxi-
maţie acceptabilă) proporţional cu concentraţia molară a speciei chimice
generatoare de fluorescenţă. Fluxul FF(l2) mai este proporţional şi cu
fluxul de radiaţie incident F0(l2) , deci prin creşterea fluxului de radiaţie
incidentă se poate mări sensibilitatea determinării analitice a concentraţiei
molare a speciei chimice fluorescente (în acest aspect constă diferenţa
fundamentală între determinările analitice cantitative prin spectrometrie
de absorbţie şi prin spectrometrie de fluorescenţă).
Prin spectrometrie de fluorescenţă se pot pune în evidenţă concentraţii
foarte mici (uneori de ordinul a 10-5 M).
Unele impurităţi din probă sunt capabile să diminueze intensitatea
fluorescenţei; fenomenul poartă numele de stingerea fluorescenţei
("quenching").
308
Spectrometrie de fluorescenţă

Exemple de aplicaţii analitice :

a) Chinina este un exemplu clasic pentru un compus determinat la sensi-


bilitate foarte mare prin fluorescenţă: în acid sulfuric de 0,05 M randa-
mentul cuantic al fluorescenţei chininei este 0,3 ; maximul de absorbţie
este la lungimea de undă l1 = 350 nm iar fluxul de radiaţie fluorescentă
emisă are maxim la l2 = 450 nm (fluorecenţă albastră). În mediu de
acid clorhidric intensitatea fluorescenţei chininei este mai redusă decât
în acid sulfuric.
b) Aflatoxinele (substanţe foarte toxice, provenite din unele mucegaiuri)
se depisteaza prin fluorescenţa lor:
Aflatoxina B1 şi B2 (fluorescenţă albastră – “Blue”)
Aflatoxina G1 şi G2 (Fluorecenţă verde – “Green”)

Ordinea toxicitatii: B1 > G1 > B2 > G2


309
Structura
aflatoxinelor

Aflatoxina B1 Aflatoxina B2

Aflatoxina G1 Aflatoxina B2
Spectrometrie de fluorescenţă 310

Exemple de aplicaţii analitice :


c) vitaminele sunt adesea identificate sau determinate cantitativ pe baza
fluorescenţei lor:
Spectrometrie de fluorescenţă 311
Exemple de aplicaţii analitice :
d) Farmacopeea Europeană (ediţia 6) prevede, la capitolul ”Control al limi-
telor de impurităţi”, controlul cantităţii de formaldehidă liberă. Formele
farmaceutice vizate sunt vaccinurile de uz uman şi toxoide de uz veteri-
nar. Reactiv : acetil-acetona.

Excitare : 410 nm
Emisie : 510 nm
H3C
O
+
Exemple de aplicaţii analitice : 312
H3C NH Cl
-
O e) Determinarea fluorimetrică a Papaverinei
* (reacţia coralin)
O
CH3 W. Schneider ; K. Schroeter ; O. Boger (1920 – 1921)
(CH3-CO)2O O
CH3
- CH3-COOH Reacţia are loc la încălzire ;
- H2O Clorhidrat de Papaverină după răcire se adaugă 2-3
picături de H2SO4 conc.
O Cl
-
H3C
+
H3C N CH3
O
Coralin (produs de reacţie)

CH3
culoare galbenă
2[H] O fluorscenţă verde
O
CH3

O Cl
-
H3C Pentru ca reacţia sa fie pozitivă, gruparea
+ H
H3C
O
N CH3 metilenică ( * ) trebuie să fie nesubstituită
Reacţia este specifică papaverinei si se pretează
produs făra CH3 chiar la determinare cantitativă. Morfina dă un
O
fluorescenţă produs colorat dar fără fluorscenţă.
O
CH3
Spectrometrie de fluorescenţă 313

Exemple de aplicaţii analitice:


f) Determinarea spectrofluorimetrică a Carnitinei

-
-
45 - 60 oC

Carnitina
HCl
produs fluorescent
l ex = 260 nm
l em = 310 nm

reactiv de derivatizare
g) Determinarea fluorimetrica a agentului fungicid Ciclopirox 314

(a) 70 ng/ml Ciclopirox


(b) 700 ng/ml
Ciclopirox M.I. Walash; M.S. Rizk; M.I. Eid;
M. El-Sayed Fathy
Acta Pharm., 2006:56, 431-440

EDTA: 2,310-5 mol/l

Tb3+: 2,510-5 mol/l

pH: 10 (tampon borat)

lex = 295 nm

lem = 485 nm & 545 nm


315
g) Determinarea fluorimetrica a agentului fungicid Ciclopirox

M.I. Walash; M.S. Rizk; M.I. Eid; M. El-Sayed Fathy


Acta Pharm., 2006:56, 431-440
316
g) Determinarea fluorimetrica a agentului fungicid Ciclopirox

M.I. Walash; M.S. Rizk; M.I. Eid; M. El-Sayed Fathy


Acta Pharm., 2006:56, 431-440

Din raportul pantelor


rezulta raportul molar
de implicare a ionului
Tb(III) si Ciclopirox, 1:3

(1,09/0,39 = 2,79 ≈ 3)
317
g) Determinarea fluorimetrica a agentului fungicid Ciclopirox
HO O
N C OH M.I. Walash; M.S. Rizk; M.I. Eid;
H2N
M. El-Sayed Fathy
CH3 Acta Pharm., 2006:56, 431-440

(6-ciclohexil-1-hidroxi-4-metil-2(1H)-piridon +
+ 2-aminoetanol (amestec in raport molar 1:1)

HOOCH2 CH2COO
-
HO O
3+ O CH3
N C Tb N C
3 Tb N
2- O
H2EDTA N
CH3 +
HOOCH2 CH2COO
-
-3H
3

pH: 10 (tampon borat) ; lex = 295 nm ; lem = 485 nm & 545


nm
318

Spectrometrie de
absorbţie în domeniul
infraroşu mijlociu (IR)
319
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR
Localizare spectrală : 2500 – 50000 nm (4000 – 200 cm-1)
Mecanismul de producere a absorbţiei : tranziţii între stările de vibraţie
ale moleculelor probei
Spectrofotometria IR oferă informaţii despre vibraţiile interne ale
moleculelor sau despre vibraţiile reţelei cristaline (dacă proba este
solidă)
Spectrofotometria IR oferă informaţii despre structura moleculelor
probei
Spectrofotometria IR se utilizează frecvent pentru identificarea unei substanţe
(spectrele IR sunt bogate în informaţii) dar se utilizează mai rar pentru
determinarea cantitativă a componentelor unei probe (radiaţia difuză este
însemnată în IR)
Obs. Spectrometria Raman este o altă tehnică (complementară tehnicii IR)
care permite identificarea unei substanţe datorită vibraţiilor moleculare.
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 320

În timpul vibraţiei unei molecule se modifică, periodic în timp, elementele


geometrice: lungimea legăturilor covalente, unghiul dintre două legături covalente
centrate pe acelaşi atom sau unghiul diedru definit de trei legături covalente
adiacente.
Câteva coordonate interne

La o moleculă biatomică,
numarul de undă al vibraţiei
de alungire a legăturii
covalente este:

~ 1 k a ,b
n 
2    c  a ,b
1 1 1
 +
 a ,b ma mb
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 321

În timpul tranziţiei de vibraţie se modifică geometria moleculelor (modificarea


coordonatelor interne). În principiu, la fiecare tranziţie de vibraţie se modifică
toate lungimile de legătură şi toate unghiurile de legătură şi diedre ale
moleculei. În anumite condiţii însă se poate corela, în măsură satisfăcătoare,
apariţia unei benzi IR cu prezenţa în molecula probei a unor fragmente
structurale (unele tipuri de legături sau unele grupări funcţionale). Aceste
corelări aproximative sunt justificate în urmă-toarele cazuri :

- o legătură covalentă leagă doi atomi dintre care unul are masa mult diferită de masa
majorităţii atomilor din moleculă
(de exemplu legăturile între H şi un atom mai greu) ;
- o pereche de atomi posedă o legătură multiplă (dublă, triplă), cu o constantă de
forţă mult diferită de constanta de forţă a celorlalte legături din moleculă ;
- atomii dintr-o grupare funcţională formează un ansamblu care are stări de
vibraţie oarecum independente de stările de vibraţie ale restului moleculei (de
exemplu, gruparea amidică, nucleele aromatice, grupările alchilice etc.).
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 322

După măsura contribuţiei unor fragmente moleculare la apariţia


unor benzi de absorbţie, frecvent se deosebesc următoarele tipuri
de vibraţii corelate cu tipuri ale benzilor de absorbţie :

- vibraţii "caracteristice" de valenţă ("stretching") ;


- vibraţii "caracteristice" de deformare a unghiului de
legătură ("scissoring") ;
- vibraţii "caracteristice" de deformare ale unor unghiuri
diedre ("rocking", "wagging", "twisting") ;
- vibraţii "caracteristice" de vibraţie ale unor cicluri
("breathing") ;
- " vibraţii caracteristice de grup " ale unor grupări funcţionale
(ex. gruparea amidică)
323
Reprezentarea modurilor normale de vibraţie ale unor grupuri de atomi :
a) gruparea de tipul XY2 ( de exemplu >CH2 , >CCl2 etc. )
Reprezentarea modurilor normale de vibraţie ale unor grupuri de atomi : 324
b) gruparea de tipul -XY3 (de exemplu -CH3 , - CCl3 etc.)
325

Reprezentarea modurilor normale de vibraţie ale unor grupuri de atomi :

- -
c) gruparea XY (de exemplu C H , C Cl etc.)
326
Absorbtiile caracteristice ale unor fragmente moleculare

d) gruparea C-H
327
Absorbtiile caracteristice ale unor fragmente moleculare

e) gruparea C-H
vibraţia de valenţă: 3300 - 3380 cm-1 (fază gazoasă) Banda intensă
caracteristică
3310 - 3320 cm-1 (soluţie de CCl4)
vibraţie de deformaţie: 610 - 680 cm-1 (una sau două benzi intense)

f) gruparea Car H -
vibraţie de valenţă: 3000 - 3100 cm-1 (interpretare dificilă)

vibraţii de deformare: - în cazul benzenului: 671 cm-1


- în cazul derivaţilor substituiţi:
5 H adiacenţi: 730 - 770 cm-1 ; 690 - 710 cm-1 ;
4 H adiacenţi: 735 - 770 cm-1 ;
3 H adiacenţi: 750 - 810 cm-1 ;
2 H adiacenţi: 800 - 860 cm-1 ;
1 H : 835 - 875 cm-1
Bazele teoretice ale spectrofotometriei IR 328
Numere de undă caracteristice de vibraţie ale unor fragmente moleculare

g) alte câteva domenii spectrale de absorbţie corelate cu diferite fragmente de


structură moleculară
329
Absorbtiile caracteristice ale unor fragmente moleculare
330
Absorbtiile caracteristice ale unor fragmente moleculare

Literatura de specialitate conţine multe date referitoare la domeniul


spectral de apariţie a benzilor de absorbţie determinate de vibraţiile
normale ale unor grupe funcţionale
Aspecte practice ale spectrofotometriei IR 331

Starea probelor supuse analizei IR :

- starea gazoasă ( mai rar în controlul medicamentelor )


- starea lichidă ( film lichid )
- stare dizolvată
- starea dispersată ( proba solidă în ulei de parafină – “Nujol” )
- starea solidă microcristalină - comprimat în KBr sau polietilenă
- tehnica ATR
Aspecte practice ale spectrofotometriei IR 332

Tehnica ATR
Includerea probei (Attenuated Total Reflexion)
microcristaline în
comprimat de KBr probă păstoasă
sau de polietilenă
P a)
presiune Prisma ATR
probă păstoasă
3 IR P IR
7 7
spre pompa de vid Prisma ATR n

2 2
5 8 b)
6
4
7 7 IR P IR
1
probă lichidă
333
Domeniu de transparenţă (cm-1)
Solubilitate în apă
Material (pentru transmisie de 10 % la
(g/100 g)
grosimea de 2 mm)
Cuarţ (Infrasil) 50000 – 2220 insolubil
MgF2 (Irtran 1) 10000 – 1087 0,008 (la 18 oC)
ZnS (Irtran 2) 10.000 – 680 insolubil
CaF2 (Irtran 3) 25000 – 870 0,0015 (la 20 oC)
ZnSe (Irtran 4) 10000 – 454 insolubil
MgO (Irtran 5) 40000 – 1175 0,009 (la 30 oC)
Safir (Al2O3) 58820 – 1540 insolubil
As2S3 16660 – 870 insolubil
KRS-5 (TlBr/TlI) 20000 – 250 0,05 (la 20 oC)
KRS-6
47600 – 295 0,32 (la 20 oC)
(TlBr – TlCl)
35,7 (la 0 oC)
NaCl 47600 – 385
39,1 (la 100 oC)
Diamant 40000 – 125 insolubil
Polietilenă 625 – sub 50 insolubil
334
335
336

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
337
338



339
340
341
342
343

Spectrometrie Raman
344

Chandrasekhara Venkata Raman


(1888 – 1970)
Spectrometrie Raman 345
Sursă alternativă de informaţii despre stările de vibraţie ale materiei,
complementară spectroscopiei în infraroşu (IR)
Probele studiate cu această tehnică pot fi gazoase (mai rar), lichide
sau solide (mai frecvent), cristaline sau amorfe.
- radiaţia excitatoare, care delimitează aria investigată a probei, poate fi focalizată
la dimensiuni mai mici în tehnica Raman decât în tehnica IR ;
- emisia Raman este generată prin alt mecanism (alte reguli de selecţie) decât
absorbţia IR, în consecinţă cele două tehnici se completează fericit în privinţa
informaţiilor de structură moleculară sau cristalină ;
- în timp ce la analiza IR a probelor amorfe sau microcristaline se urmăreşte
numai o singură mărime (absorbanţa), la tehnica Raman se poate urmări
atât intensitatea de emisie cât şi gradul de depolarizare în funcţie de numărul
de undă a radiaţiei emise de probă ;
- spre deosebire de tehnica IR, în care chiar urmele de apă pot compromite
analiza, în tehnica Raman probele se pot dizolva chiar şi în apă, deoarece
benzile Raman ale apei sunt slabe şi largi, iar sticla este tranparentă în
domeniul spectral utilizat (materialele transparente în IR deseori sunt
higroscopice)
Spectrometrie Raman 346
Din punctul de vedere al generării semnalului util, spectroscopia Raman este o
tehnică de emisie de radiaţie în contrast cu spectroscopia uzuală IR la care se
sesizează numerele de undă ale radiaţiei incidente la care proba absoarbe
preferenţial radiaţia incidentă.
Din punctul de vedere al informaţiei oferite, spectroscopia Raman oglindeşte
modurile normale de vibraţie ale moleculelor (sau ale reţelelor cristaline în cazul
probelor solide), asemănător cu spectrofotometria IR.
Din punctul de vedere al domeniului spectral utilizat, tehnica Raman se practică
în domeniul ultraviolet (mai rar) sau vizibil (mai frecvent).

Din punctul de vedere al complementarităţii cu spectroforometria IR :


- La două structuri izomere, în spectrul IR al izomerului cu simetria moleculară mai
redusă se pot observa mai multe benzi de absorbţie decât în spectrul IR al
izomerului cu simetria mai avansată ;
- Dacă o moleculă are centru de inversiune, atunci toate modurile normale de vibraţie
IR-active sunt Raman-inactive şi toate modurile normale de vibraţie Raman-active
sunt IR-inactive; cu alte cuvinte, informaţiile provenite din spectrele IR şi Raman
sunt în totalitate complementare în aceste cazuri (“regula de excluziune”).
Spectrometrie Raman 347
Aspecte de construcţie şi de funcţionare

Detector CCD
Laser si Retea de
filtru optic difractie

Oglinda

Div.
Oglinzi

Filtru
Proba Lentila Noch Fanta de intrare ajustabila
Mecanismul de generare a semnalului Raman 348
349
Spectrometrie
Raman

( IE ) – împrăştiere Rayleigh
( S ) – semale (benzi) Stokes
( aS ) – semnale (benzi) anti-Stokes
350
Intensitate în
Grupare chimică Domeniu ( cm-1 ) Asignare
comparaţie cu IR
Mai intens în Raman
R–C C–R 2300 – 2190 ( i ) n(C C)
decât în IR
Mai intens în Raman
R–C C–R 2140 – 2100 ( i ) n(C C)
decât în IR
Mai intens în Raman
>C=C< 1675 – 1600 ( m-i ) n(C=C)
decât în IR
“respiraţie” Mult mai intens în
Aromatic 1010 – 990 ( fi )
de nucleu Raman decât în IR
Mai intens în Raman
Aromatic 1620 – 1580 ( m-i ) n(C=C)
decât în IR
Mai intens în Raman
Nitril 2260 – 2220 ( i ) n(CN)
decât în IR
Mai intens în IR decât
Aldehide 1730 – 1700 ( m ) n(C=O)
în Raman
Mai intens în IR decât
Cetone 1750 – 1650 ( m ) n(C=O)
în Raman
Mai intens în Raman
C–Cl 850 – 650 ( i ) n(C–Cl)
decât în IR
351

Acid acetilsalicilic ( Spectru Raman )


Excitare : 488 nm

Vibratia de deformare a patru


atomi de hidrogen adiacenti
grefati pe nucleu benzenic
352

Paracetamol ( Spectru Raman )


Excitare : 488 nm
Vibratia de deformare a doi
atomi de hidrogen adiacenti
grefati pe nucleu benzenic
353

Metode termice de
analiză
Metode termice de control analitic al medicamentelor 354

Avantajul metodelor termice: permit studierea probelor neomogene din


punct de vedere chimic sau fizic.
Metode termice:
- termomicroscopie ;
- analiză termogravimetrică (ATG - TGA) ;
- analiză termodiferenţială (ATD - TDA) ;
- calorimetrie diferenţială cu scanare
("Differential Scanning Calorimetry" - DSC)

Termomicroscopie: în timpul încălzirii progresive a probei se


observă vizual schimbările produse (topire, sublimare, schimbare a
formei de cristalizare etc.)
Studiile de termomicroscopie se realizează cu microscoape speciale
(ex. de tip Boetius). La unele termomicroscoape proba se poate urmări
cu lumina polarizată.
Metode termice de control analitic al medicamentelor 355

1 – sursă de lumină
2 – masă de probă încălzită
3 – termometru
4 – obiectiv
5 – sursă de lumină
6 – ocular
7 – mâner pentru
poziţionarea probei
356
357
Metode termice de control analitic al medicamentelor

Informaţii obţinute prin termomicroscopie:


- observarea schimbărilor de fază (topire, modificarea formei de
cristalizare) şi a temperaturii la care acestea au loc ;
- formarea “amestecurilor eutectice”, specifice unor amestecuri de
substanţe ;
- decelarea impurităţilor în probe cristaline prin modificarea
(scăderea) temperaturii de topire ;
- evidenţierea formelor polimorfe prin extinderea domeniului de
topire ;
- observarea fenomenului de birefringenţă (în lumina polarizată),
fenomen caracteristic unor substanţe optic active în forma cristalină.
358
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Amestec eutectic binar

TA – temperatura de topire a
componentei pure A
TB – temperatura de topire a
componentei pure B
PE – punct eutectic
TE – temperatura eutectică

În stare lichidă (topitură) substanţele A şi B sunt miscibile în orice proporţie,


dar în stare solidă sunt nemiscibile (la solidificare se formează cristale de
componente A şi B pure)
359
Eutectic binar Fenacetina – acid p-aminobenzoic

xe(Fenacetina) = 0,6359
xe(ac. p-am. benz.) = 0,3641
Te = 116 oC
360
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Amestec eutectic
binar şi compus
stoechiometric

TA – temperatura de topire a
componentei pure A
TB – temperatura de topire a
componentei pure B
PE1 , PE2 – puncte eutectice
TE1 , TE2 – temperaturi
eutectice
361
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Amestec eutectic ternar

TA , TB , TC – temperaturile de
topire ale componentelor
pure A , B respectiv C
EAC , EBC , EAB – puncte
eutectice binare
EABC – punct eutectic ternar

Ex.
ac. acetilsalicilic (60 %)
paracetamol (20 %)
uree (20 %)
Te = 72 oC
362
Exemple de aplicare a termomicroscopiei în controlul
medicamentelor

Aminofenazonã (I) Derivat N-demetilat (II) Diferenţa numai


p. t. 106,4 oC p. t. 106,3 oC de 0,1 oC

Atât compusul (I) cât şi compusul (II) formează amestec eutectic cu acetanilidă
(în raport molar 1 : 1) ; cele două amestecuri eutectice au temperaturi de topire
mai diferite:
amestecul (I - acetanilidă) are p. t. 61 oC
Diferenţa de 2 oC
amestecul (II - acetanilidă) are p. t. 63 oC
363
Exemple de aplicare a termomicroscopiei în controlul
medicamentelor

Fenilbutazona are trei forme de


cristalizare care se pot evidenţia
prin termomicroscopie:
Fenilbutazonã
formele I , II , III .

 La răcirea lentă a topiturii cristalizează formele I şi II


 La răcirea rapidă a topiturii cristalizează formele I şi III

Apariţia formelor caracteristice de cristalizare în condiţii precizate de răcire


permite identificarea compusului în prezenţa altor ingrediente.
364

Exemple de aplicare a termomicroscopiei în controlul


medicamentelor
3

Cristalele individuale de rifampicină


prezintă birefringenţă optică la
iluminarea lor cu lumină polarizată.
(FR-X p. 828)
Rifampicinã

Birefringenţă : proprietatea unui mediu de a manifesta valori diferite de indice


de refracţie în funcţie de orientarea planului de polarizare a unei radiaţii plan-
polarizate în raport cu axele cristalografice (se poate evidenţia cu microscop
prevăzut cu sistem de polarizare).
Formele polimorfe ale Paracetamolului 365

Forma I Forma II
(sistem monoclinic) (sistem ortorombic)
(din solutie) (din topitura)
366

Formele polimorfe ale Paracetamolului

Forma I : monoclinica
Termodinamic forma stabila ; se obtine prin cristalizare din solutii
Nu se poate presa in comprimate decat in prezenta liantilor
Birefringenta: ne – no = 0,124

Forma II : ortorombica
Se poate pastila usor, dar se obtine foarte greu (prin cristalizare din topitura)
Birefringenta: ne – no = 0,349

De regula: din solutie cristalizeaza mai repede forma care este mai putin
stabila din punct de vedere termodinamic.
367
5 b-estradiol cristalizat din acetat de etil (lumina polarizata)

b-estradiol

20 m
368
b-estradiol cristalizat din alcool izopropilic (lumina polarizata)

20 m
369
6 Transformarea solid-solid (recristalizarea in timpul incalzirii
fara topire). Cristalele transparente cresc pe seama celor
netransparente (microscopie cu polarizoare incrucisate)

20 m
370
7
Observarea microscopica a sublimarii. Cristalele se
formeaza pe lamela superioara a probei. Se observa
formarea a cel putin doua feluri de cristale.
(observare cu polarizoare partial incrucisate)

50 m
371
8 Desolvarea hemihidratului de b-estradiol
(observare la 90 oC cu polarizoare partial incrucisate)

100 m
372
Desolvarea hemihidratului de b-estradiol
(observare la 105 oC cu polarizoare partial incrucisate)
Se observa modificarea imaginii suprafetei cristalului
datorita pierderii solventului de cristalizare.

100 m
Depistarea prin microscopie optica a impuritatii cristaline (prezenta 373
in urme) intr-o proba cristalina. Se observa microcristalul de NaCl
lipit de cristalul compusului majoritar. Prin difractie de raze X nu s-a
sesizat prezenta urmelor de NaCl.
9
374
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Analiza termogravimetrică (ATG - TGA)

Esenţa metodei : în timpul încălzirii progresive se urmăreşte modificarea masei


probei analizate.
ATG se pretează la urmărirea proceselor însoţite de modificare de masă
(descompunere termică, deshidratare, volatilizare, sublimare, oxidare etc.) oferind
informaţii asupra temperaturilor la care începe şi la care se termină un proces. Din
modificarea de masă se pot formula ipoteze privind compozi-ţia probei şi natura
procesului.
În controlul de medicamente ATG permite determinarea purităţii, stabilităţii şi
identităţii chimice a substanţelor analizate, determinarea simultană a mai multor
componente chimice şi urmărirea cineticii (neizoterme) a reacţiilor chimice.
Curba termogravimetrică - reprezentarea masei în funcţie de temperatura
probei : m = f(T)
Părţile mai abrupte ale curbelor - procese. Palierele relativ orizontale - specii
chimice distincte, stabile la temperatura respectivă.
375
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Analiza termogravimetrică (ATG - TGA)
Schema unei
termobalanţe

C – cuptor
TC – termocuplu
B – solenoid
M – miez magnetic
P – probă
S – sursă de lumina
O – oglindă
FD – fotodiodă
F1 , F2 – fante
376
Metode termice de control analitic al medicamentelor 377

Descompunerea termică
a monohidratului
oxalatului de calciu

În unele variante ATG :


- se reprezintă grafic derivata
masei probei în raport cu
temperatura, în funcţie de
temperatură ;
Ca(COO)2 H2O Ca(COO)2 + H2O - proba poate fi într-un gaz
Ca(COO)2 CaCO3 + CO inert sau într-un spaţiu vidat
CaCO3 CaO + CO2
378
379
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Analiza termodiferenţială (ATD - TDA)

Esenţa metodei : înregistrarea diferenţei de temperatură între interiorul unei


probe şi interiorul unei referinţe inerte (care în intervalul de temperatură
considerat nu suferă nici un proces chimic), în timp ce temperatura spaţiului
în care ele se găsesc se măreşte progresiv.

La ATD procesele urmărite nu trebuie neaparat să fie însoţite de


modificarea masei probei (spre deosebire de ATG).

Dacă la o temperatură se declanşează în probă un proces exoterm, acesta


grăbeşte încălzirea probei în raport cu referinţa, deci în interiorul probei
temperatura momentană depăşeşte pe cea din interiorul referinţei.
Dacă în probă are loc un proces endoterm, acesta consumă o cantitate de
căldură, deci temperatura în interirorul probei creşte cu viteză mai mică decât
în interiorul referinţei.
Referinţa: deseori este Al2O3 .
380
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Analiza termodiferenţială (ATD - TDA)

ATD oferă informaţii despre procesele chimice şi fizice care sunt


însoţite de modificări de entalpie şi despre valorile de temperatură la
care încep şi la care se sfârşesc aceste procese.

Procese tipice, studiabile prin ATD: uscarea, pierderea apei de


hidratare, modificarea formei de cristalizare, topirea, sublimarea,
adsorbţia, desorbţia, polimerizarea, izomerizarea, descompunerea
termică etc. Pentru fiecare tip de proces se poate măsura variaţia de
entalpie a probei.

Forme posibile de probă: pulberi, film subţire, (micro)cristale,


amestecuri eterogene (ex. comprimate).
Metode termice de control analitic al medicamentelor 381
Analiza termodiferenţială (ATD - TDA)

Schema unui montaj ATD


382
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Analiza termodiferenţială (ATD - TDA)

Termograma
ATD tipica

Intensitatea semnalului este proporţională cu cantitatea speciei chimice


care l-a generat; deci dacă se cunoaşte variaţia molară de entalpie a
procesului asociat cu semnalul detectat, se pot realiza determinări
cantitative ale componentelor de interes conţinute în amestecuri (chiar
eterogene).
383
Metode termice de control analitic al medicamentelor
Calorimetrie diferenţială cu scanare (Differential Scanning
Calorimetry – DSC)

Esenţa metodei : măsurarea energiei (cantităţii de căldură) care trebuie


introdusă în – sau îndepărtată din – proba analizată, pentru a menţine proba la
aceeaşi temperatură cu o referinţă inertă, în timp ce temperatura incintei, în care
se găseşte proba şi referinţa, creşte progresiv (cu viteza prescrisă de
experimentator).
Dacă la o temperatură oarecare în probă se declanşează un proces endoterm,
atunci puterea de încălzire a probei trebuie mărită pentru a menţine la aceeaşi
temperatură cu referinţa. Se reprezită grafic puterea introdusă (sau îndepărtată)
în (sau din) probă în funcţie de temparatura momentană a incintei în care se
găsesc proba şi referinţa.
Diferenţa între ATD şi DSC :
- la ATD semnalul urmărit este o diferenţă de temperatură
- la DSC semnalul urmărit este o putere (cantitate de căldura / unitate de
timp)
Metode termice de control analitic al medicamentelor 384
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)

Forma tipică a unei curbe DSC :

Pentru etalonare:

Indiu
Ttop = 156,4 oC

ltop = 28,47 kJ/kg


Uree
Ttop = 132,7 oC

ltop = 241,89 kJ/kg


385
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Detalii constructive si de functionare
386
387
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Transformari de faza – forma idealizata a traseului DSC
388
Comportarea temodinamica a formelor de cristalizare ale acidului
flufenamic (3 forme din cele 7 cunoscute). Formele I si III sunt
polimorfi enantiotropici (temperatura de transformare 42 oC); formele II
si III sunt polimorfi enantiotropici (temperatura de transformare 104 oC);
formele I si II sunt polimorfi monotropici.

Ttop(I) = 131 oC
Ttop(II) = 128 oC
Ttop(III) = 126 oC
389

Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)


Transformari de faza – topirea acidului acetilsalicilic
endo
390
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Traseul de topire a Carbamazepinei (forma de cristalizare I)

endo
391
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Traseul de topire a Carbamazepinei (forma de cristalizare III)

endo
392
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC)
Traseul de topire a monohidratului de lactoza
endo
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC) 393
Procedeul de determinare a temperaturii de topire
Calorimetrie diferenţială cu scanare (DSC) 394
Decelarea impuritatilor – determinarea puritatii
Determinarea puritatii din curba DSC de topire 395

AF
F
A PQ

F – Fractia transformata in
topitura pana in momentul cand
temperatura este Tm
396
Determinarea puritatii din curba DSC de topire

Relatia (1) rezulta din ecuatia van’t Hoff


R  T02  x2
T0  Tm  (1) T0 reprezintă temperatura de topire a
H top
substanţei pure;
Tm este temperatura de topire a
R  T02  x 2 substanţei impurificate;
T0  TF  F  (2) x2 este fracţia molară a impurităţii;
H top
Htop este entalpia molară de topire a

T0  Tm substanţei pure;
F (3) R este constanta universală a gazului
T0  TF
ideal.

1 R  T02  x 2 La impartirea (1) cu (2) rezulta (3)


TF  T0   (4)
F H top
Eliminand Tm din (1) si (3) rezulta
(4)
Determinarea puritatii din curba DSC de topire 397

Ordonata la origine a dreptei: T0

Val. abs. a pantei: R  T02  x 2


H top
Daca se cunoaste entalpia molara de
topirea componentei dominante, se poate
calcula fractia molara a impuritatii
Determinarea puritatii Sulfapiridinei prin DSC de topire 398

T0 = 428,14 K
H top  (T0  Tm ) J
x2  ; R  8,314 Tm = 427,91 K
R  T02 mol  K Htop = 27,845 kJ/mol
x2 = 0,0042
399

Metode titrimetrice de
control al
medicamentelor
400

Joseph Louis Gay-Lussac


(1778 - 1850)
initiatorul metodelor titrimetrice
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 401

Titrimetrie : adăugarea controlată a unui reactiv (R) la sistemul analizat,


care conţine substanţa de interes (X) într-un solvent adecvat (S). Adăugarea
reactivului de titrare (R) se continuă până se consumă integral substanţa X.
Consumarea integrală a substanţei X (atingerea punctului de echivalenţă) este
indicată printr-o metodă chimică sau fizică adecvată. Volumul solutiei (R),
consumat pana la punctul de echivalenta, este Ve.

Metode chimice : utilizarea unui indicator (I). La consumarea substanţei X


(şi numai atunci), reactivul reacţionează cu indicator transformând dintr-o
formă chimică iniţială (I1) într-o formă chimică nouă (I2). Formele I1 şi I2 se
deosebesc prin proprietăţi vizibile (culoare, fluorescenţă).

Metode fizice : – indicare conductometrică ;


– indicare potenţiometrică ;
– indicare amperometrică ;
. . . etc . . .
402

Metode titrimetrice de control al medicamentelor

X+R  Y+P
I1 + R  Q + I 2

X – analit (compusul care urmeaza a fi determinata cantitativ)


R – reactivul de titrare
(care se adauga controlat in vasul de titrare)
I1 – indicatorul chimic in forma initiala
I2 – indicatorul chimic in forma finala
403
Metode titrimetrice de control al medicamentelor

X+R  Y+P (1) Titrare simpla (directa)


I1 + R  Q + I2 (2)

V
f
Ve
404
Metode titrimetrice de control al medicamentelor

Titrare indirecta
Alura generala a curbelor de titrare (I) 405
Alura generala a curbelor de titrare (II) 406
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 407

Metode de titrare după tipul reacţiei chimice implicate

- titrare acido/bazică (acidimetrie) AH + B


-
A + BH+

- titrare complexonometrică (complexonometrie)


Men+ + H2Na2EDTA [Me(EDTA)](n-2)+ + 2H+
- titrare cu formare de precipitat
- titrare redox (oxidimetrie)
- permanganometrie ( KMnO4 )
- iodometrie ( I2 , KI3 , IBr)
- bromatometrie ( KBrO3 )
- cerimetrie ( Ce(SO4)2.4H2O )
- cromatometrie ( K2Cr2O7 )
- ascorbinometrie ( acid ascorbic )
408
Metode titrimetrice de control al medicamentelor

Reacţii redox implicate în titrările cu schimb de electroni


(oxido-reducere)

Permanganometrie
-
MnO4 + 8H+ + 5e
- Mn2+ + 4H2O

Iodometrie
-
I3 + 2e
- 3I
-

Bromatometrie
-
BrO3 + 6H+ + 6e
- -
Br + 3H2O
-
BrO3 + 6H+ + 5Br
- 3Br2 + 3H2O

Cerimetrie Ce4+ + e
- Ce3+

Cromatometrie
-
Cr2O72 + 14H+ + 6e
- 2Cr3+ + 7H2O

Ascorbinometrie C6H8O6 2H+ + 2e + C6H6O6


-
Acidimetrie 409

Titrarea unui acid monobazic tare cu o bază tare, la 22 oC, pentru


concentraţii analitice diferite ale acidului:
(1) C = 1 M; (2) C = 10-1 M; (3) C = 10-2 M; (4) C = 10-3 M; (5) C = 10-4 M
14
(1)

(2)
12
(3)

(4)
10
(5)

8
pH

PE (pH 7,00)

(5)
4
(4)

(3)
2
(2)

(1)
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
410
Acidimetrie
Titrare ale acizilor slabi monobazici cu o bază tare (NaOH 0,1 M)
Constantele de aciditate: (1) 10-3 M; (2) 10-4 M; (3) 10-5 M; (4) 10-6 M;
(5) 10-7 M; (6) 10-8 M; (7) 10-9 M; (8) 10-10 M
14

12

10 (8)

(7)
8 (6)
pH

(5)
6 (4)

(3)
4 (2)

(1)
2
HCl

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
411
Titrare bazelor tari monoacide cu un acid tare (NaOH 0,1 M)
Concentratia initiala a bazei: (1) 1 M; M (2) 10-1 M; (3) 10-2 M; (4) 10-3 M; (5) 10-4 M
14
(1)

(2)
12
(3)

(4)
10
(5)

8
pH

PE (pH 7,00)

(5)
4
(4)

(3)
2
(2)

(1)
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
Titrare bazelor slabe monoacide cu un acid tare (HCl 0,1 M) 412
Constantele de bazicitate: (1) 10-3 M; M (2) 10-4 M; (3) 10-5 M; (4) 10-6 M;
(5) 10-7 M; (6) 10-8 M; (7) 10-9 M; (8) 10-10 M
14

NaOH 0,1
12 (1) M

(2)

10 (3)

(4)

8 (5)
pH

(6)

6 (7)

(8)

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
grad de titrare (f)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 413

Exemple de determinări titrimetrice :


indici pentru caracterizarea chimică globală a amestecurilor

1. Indice de saponificare , IS (mg KOH/g probă)

IS exprimă cantitatea de acid liber şi cantitatea de esteri din proba


analizată. Punctul de echivalenţă se surprinde cu un indicator care
virează la pH mai ridicat.

R-COOH + KOH
-
R-COO K + H2O

R-COOR' + KOH
-
R-COO K + R'OH
m1 (g) m2 (mg)
probã KOH m2 (mg)
IS =
m1 (g)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 414

Indice de saponificare
2 g probă (m)
25 ml soluţie KOH în etanol (0,5 M)

Refluxare (30 – 60 minute)

25 ml apă de 80 oC (fără CO2)


Soluţie de fenolftaleină (în etanol)

Titrare până la virajul


V ml soluţie HCl în etanol (0,5 M)
roz incolor
(V0 pentru proba martor)

(V0 – V).28,05
IS = 28,05 reprezintă jumătatea masei moleculare a KOH
m
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 415

2. Indice de aciditate , IA (mg KOH/g probă)

IA exprimă cantitatea de acid liber din probă. Punctul de echivalenţă se


surprinde cu un indicator care virează la pH mai scăzut.

- +
R-COOH + KOH R-COO K + H2O
m1 (g) m2 (mg)
probă KOH m2 (mg)
IA =
m1 (g)

FR-X : reactiv de titrare: soluţie KOH (0,1 M) în apă


indicator : fenolftaleină ( viraj : incolor roz )

3. Indice de ester , IE (mg KOH/g probă) IE = IS - IA


Metode titrimetrice de control al medicamentelor 416

3. Indice de hidroxil , IH (mg KOH/g probă)

IH exprimă numărul de miligrame de hidroxid de potasiu echivalent cu


acidul acetic consumat prin acetilarea cantităţii de 1 g probă
417
Metode titrimetrice de control al medicamentelor

4. Indice de iod , II (g iod/100 g probă)

II exprimă numărul de grame de iod fixat de 100 g probă


(iodul poate fi fixat ca urmare a unei reacţii de oxidare sau ca urmare
a adiţiei la partea nesaturată a moleculelor probei)
.
m2 (g) 100
Red - 2e- Ox ; I2 + 2e- 2I - II =
m1 (g)
m1 (g) m2 (g)
probă

FR-X : reactiv de iodurare : monobromură de iod (IBr)


retitratea excesului de iod : cu tiosulfat de sodiu ;
indicator : soluţie de amidon (viraj : albastru incolor)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 418

5. Indice de peroxid , IP . . .
. . . este numărul de militri de soluţie 0,01 M tiosulfat de sodiu oxidat de
iodul eliberat din acidul iodhidric prin acţiunea peroxizilor din 1 gram
probă analizată (FR-X, pag. 994).
. . . este cantitatea de peroxid, exprimată ca număr de miliechivalenţi de
oxigen activ, care se găseşte în 1000 grame probă (DA-IX, pag. 86).

R-O-O-R’ + 2I + 2H+
-
R-OH + R’-OH + 2I2
m (g) probă
+ - 2-
2Na2S2O3 + I2 4Na + 2I + S4O6
V (ml) soluţie V(ml) – V0(ml)
0,01 M IP = 10 .
(V0 la martor) m(g)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 419

Exemple (FR-X)

Probă IS IA IH II IP
Lanolină anhidră 94 - 106 <1 - 18 - 32 <6
Alcool cetilstearilic <2 <1 200 - 220 <3 –
Alcool cetilstearilic
– <1 180 - 220 <3 –
emulgator
Balsam de Tolu 160 - 220 112 - 168 – – –
Unt de cacao 188 - 195 < 2,25 – 32 - 38 –
Cetaceu 115 - 135 <2 – <8 <8
Ulei volatil de lămâie – < 1,5 – – –
Ulei de floarea soarelui 185 - 196 <2 – 119 - 136 < 10
Ulei de floarea soarelui
– < 0,2 – – <5
neutralizat
Polisorbat 80 45 - 60 <2 65 - 85 19 - 24 –
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 420

Titrări in mediu neapos


Solvenţii neapoşi se utilizează în titrările acido-bazice (frecvent) şi în
titrările redox (mai rar)

Din punct de vedere al schimbului de proton, solvenţii pot fi :


- protogenici (acid acetic glacial, acid formic)
- protofili (dioxan, piridină, alcoolii, formamidă, acetonă)
- polari aprotici (dimetilsulfoxid, hexametil-fosfotriamidă)
- indiferenţi (benzen, toluen, tetraclormetan, cloroform)
- amfiprotici (apă)
421
Metode titrimetrice de control al medicamentelor

Titrarea unui acid slab (AH) cu o bază tare (B)


într-un solvent protofil (S)

+ -
AH + B BH + A
422
Metode titrimetrice de control al medicamentelor

Titrarea unei baze slabe (B) cu un acid tare (AH)


într-un solvent protogen (SH)

+ -
B + AH BH + A
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 423

Criterii de alegere a solventului la titrările în mediu neapos


1. Analitul, reactivul de titrare şi produşii de reacţie trebuie să fie solubili în
solventul ales
2. Un solvent protogenic exaltează caracterul bazic (nivelează bazicitatea
substanţelor) şi diferenţiază substanţele cu caracter acid
3. Un solvent protofil exaltează caracterul acid (nivelează aciditatea
substanţelor) şi diferenţiază substanţele cu caracter bazic

În consecinţă :
- un acid slab se titrează într-un solvent protofil (bazic) cu o bază puternică
(KOH, CH3ONa, (C4H9)4NOH etc.)
- o bază slabă se titrează într-un solvent protogenic cu un acid tare (HClO4)
- pentru titrarea diferenţiată a doi acizi slabi se utilizează un solvent protogenic
(cu caracterul acid intermediar celor doi acizi)
- pentru titrarea diferenţiată a două baze slabe se utilizează un solvent protofil
(cu caracterul bazic intermediar celor doua baze)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 424

Exemple de titrare în mediu neapos


1. Titrarea maleatului de mepiramină (Mepyramini maleas) cu
acid percloric în acid acetic anhidru (FE-5)

. 2 CH3COOH -
2 ClO4

. -
2 CH3COO
2 HClO4

1 ml soluţie 0,1 M de acid percloric


corespunde la 20,07 mg C22H27N3O5
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 425

Exemple de titrare în mediu neapos


2. Titrarea fenitoinei (Phenytoinum) cu metoxid de sodiu în
dimetilformamidă (DMFA) (FE-5)

DMFA
CH3OH

-
-
CH3O
DMFAH

1 ml soluţie 0,1 M de metoxid de sodiu


corespunde la 25,23 mg C15H12N2O2
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 426

Exemple de titrare în mediu neapos


3. Determinarea urmelor de apă prin titrare Karl – Fischer (FR-X)
Reactivul : dioxid de sulf, iod şi piridină dizolvat în metanol absolut
Metoda se poate utiliza pentru determinarea apei chiar în urme.
1935 publicarea metodei originale Karl Fischer (cu piridină);
1979 îmbunătăţiri aduse de Eugen Scholz (cu dietanolamină şi mai târziu cu
imidazol);
1980 - 1986 alte îmbunătăţiri ale firmei Riedel-de Haën.

CH3OH + SO2 + B
+
[BH ][CH3SO3 ]
-
+
H2O + I2 + [BH ][CH3SO3 ] + 2B
- + -
[BH ][CH3SO4 ] + 2BHI
( B = bază: piridină, dietanolamină, imidazol)
Reactivul propriu-zis: anionul metilsulfit care se oxidează cu iod la anion
metilsulfat, iar reacţia necesită apă. Conform cercetărilor recente, baza ideală
este imidazolul.
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 427

Determinarea apei prin


titrare Karl – Fischer
(FR-X)

Indicarea punctului
de echivalenţă:
- vizual (indicare nesigură);
- la folosirea piridinei drept bază (pH 4 - 5) – galben maro (SO2 cu I2
formează un complex galben în piridină);
la folosirea imidazolului drept bază (pH 6 - 7) - nu se formează complexul
galben alte metode de indicare.
- electrometrice: biamperometrice, bipotenţiometrice, conductometrice etc.
- fotometrice (525 - 600 nm).
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 428

Determinarea apei prin titrare Karl – Fischer (FR-X)

Vizualizarea
spectrofotometrică
a punctului de
echivalenţă
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 429

Determinarea apei prin titrare Karl – Fischer (FR-X)


Substanţele insolubile în metanol absolut se
dizolvă în etanol absolut, cloroform sau acid
acetic anhidru.

T.(VII – VI) .100


C% = concentraţia de apă în probă (% m/m); C% =
m
VI = volumul de reactiv KF consumat la etapa I a titrării (ml);
VII = volumul total de reactiv KF consumat inclusiv etapa II a titrării (ml);
T = titrul reactivului KF (mg apă / ml reactiv);
m = masa probei (mg)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 430

Determinarea apei prin titrare Karl – Fischer (FR-X)

Ecuaţiile chimice nu reflectă complet evenimentele din sistem,


deci calculele nu se pot baza pe stoechiometria lor. Din acest
motiv se folosesc standarde cu conţinut cunoscut de apă.
Standard solid :
Tartrat de sodiu.2 H2O (15,66 % H2O, se dizolvă relativ
bine în metanol absolut)
Standard lichid :
solvenţi cu conţinut cunoscut de apă, păstraţi în fiole închise
ermetic (sudate)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 431

Determinarea apei prin titrare Karl – Fischer (FR-X)

A = anod
C = catod
SA = spaţiu anodic
SC = spaţiu catodic
F = placă poroasă
EI = electrozi indicator

Amestec anodic şi catodic:


SO2 + imidazol (sau altă substanţă
bazică) + KI în metanol şi cloroform

Proba: în spaţiul anodic (SA)


Generare de reactiv în spaţiul anodic :
-
2I - 2e- I2
Proces de electrod în spaţiul catodic :
+
2H + 2e- H2
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 432

Surse de erori în titrarea Karl – Fischer

a) La titrarea apei din cetone, metanolul poate reacţiona cu


cetona generând apă:

+ 2 CH3OH + H2O

Cetonã Acetal

Remediu: metanolul este înlocuit cu alţi solvenţi


(ex. 2-cloretanol, 2-metoxietanol)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 433

Surse de erori în titrarea Karl – Fischer

b) Dacă proba conţine cantităţi apreciabile de aldehide, se


consumă apă din probă:

Remediu:
tehnici speciale de titrare :"flying start“ ( se reprezintă grafic
viteza de consumare a reactivului adaugat în funcţie de timp
curba de titrare ; prin extrapolarea părţii finale a curbei de
titrare se elimină sursa de eroare – vezi în continuare)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 434

Surse de erori în titrarea Karl – Fischer - Tehnica “Flying Start”

Se reprezintă grafic reciproca vitezei de consum al unei doze de reactiv


adăugat în funcţie de volumul total de titrant adăugat. Cazul (I) : nu există
proces generator de apă ; Cazul (II) : există un proces generator de apă
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 435

Surse de erori în titrarea Karl – Fischer

c) Compuşii organici ai sulfului, prezenţi în probă, consumă iod:


2R-SH + I2 R-S-S-R + 2HI
Remediu: cuplarea tiolilor cu N-etil-maleinimidă

R-SH +
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 436

Surse de erori în titrarea Karl – Fischer

d) Prezenţa peroxizilor şi hidroperoxizilor în probă generează iod:

R-OOH + 2HI R-OH + I 2 + H2O

+ 2HI 2R-COOH + I 2

Remediu: titrare la temperatură scăzută ( - 20 oC )


viteza reacţiilor secundare este mult micşorată
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 437

Exemple de determinări titrimetrice


4. Determinarea titrimetrică a zaharinei (titrare acido-bazică)
Funcţiunea chimică sulfamidică prezintă caracter acid suficient de
pronunţat pentru titrare cu hidroxid de sodiu:

Metoda permite determinarea zaharinei din comprimate ; în acest scop :


- se dizolvă comprimatele în apă acidulată
- se extrage zaharina cu amestec de 9 volume cloroform + 1 volum alcool
- se separă faza organică
- se evaporă la sec
- se redizolvă în apă
- se titrează soluţia obţinută cu soluţie de NaOH (0,1 M)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 438

Exemple de determinări titrimetrice

5. Determinarea titrimetrică a sulfatiazolului


(titrare acido-bazică)

Substanţa se dizolvă într-un amestec neutralizat de acetonă-apă


(1:1 v/v) prin încălzire la 60 oC. După răcire se titrează în prezenţa
timolftaleinei (viraj incolor albastru persistent).
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 439

Exemple de determinări titrimetrice

6. Determinarea titrimetrică
a fenobarbitalului (titrare
acido-bazică)
Indicator : albastru de timol
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 440

Exemple de determinări titrimetrice


7. Determinarea titrimetrică a fosfatului de codeină
(titrare acido-bazică)

Solvent : acid acetic anhidru (exaltarea caracterului slab bazic al anionului


dihidrogen-fosfat) ;
indicator: cristal-violet (se titrează până la coloraţia albastră)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 441

Exemple de determinări titrimetrice

8. Determinarea titrimetrică a
clorhidratului de papaverină
(titrare acido-bazică)

Proba: dizolvată în cloroform


Acetat de mercur: dizolvat în dioxan
Acid percloric: în soluţie de dioxan
Indicator: galben de metanil în dioxan
(titrare până la culoarea violetă)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 442

Exemple de determinări titrimetrice


9. Determinarea titrimetrică a vitaminei B1(titrare acido-bazică)

Solvent: acid acetic anhidru


Indicator: cristal-violet
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 443

Exemple de determinări titrimetrice

10. Determinarea titrimetrică a vitaminei C (titrare redox)

acid ascorbic acid dehidroascorbic

Metoda de lucru: se adaugă iodul în exces, iar după terminarea


reacţiei se retitrează excesul de iod cu soluţie de tiosulfat de sodiu
(indicator: amidon solubil – titrare pâna la dispariţia culorii albastre)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 444

Exemple de determinări titrimetrice

11. Determinarea titrimetrică a cloraminei B (titrare redox)

HClO + 2KI I2 + KOH + KCl

Iodul format se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu


(indicator – amidon solubil)
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 445

Exemple de determinări titrimetrice


12. Determinarea titrimetrică a timolului (titrare redox)

Reactiv de titrare : soluţie de bromat de potasiu (în prezenţa KBr)


Indicator : metilorange
Punct de echivalenţă (nu se mai consumă bromul generat) : decolorarea
indicatorului metilorange
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 446

Exerciţiu: determinarea titrimetrică a timolului

Dacă la titrarea unei probe s-a consumat volumul de 13,31 ml soluţie de


titrare (de concentraţia 0,01667 mol/l), ce cantitate de timol a conţinut
proba analizată ?
Masa moleculară a timolului este 150,2 g/mol.
447

M = 150,2 (g/mol)
V = 13,31 (ml) = 0,01331 (l)
C = 0,01667 (mol/l)

2
1 mol Timol . . . . . . . 2 moli Br2 . . . . . . . . . . . . . . 3 mol KBrO3
m
150,2 mol Timol . . . . . . . . . . . . . . . 0,01667.0,01331 mol KBrO3

0,01667  0.01331  3  150,2


m  0,049989  0,05 (g)
2
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 448

13. Determinarea Amlodipinei

3HBr

Amlodipin
3Br2 Br2
(necesar + exces) (exces)

produsi de degradare
(incolori)
galben de metanil
(roşu în mediu acid) N2

Kanakapura Basavaiah şi colab. (2005)


Metode titrimetrice de control al medicamentelor 449

14. Determinarea Cofeinei prin titrimerie coulometrică


+ - N.N.Chernysheva, I.F.Abdullin,
10KCl 10K + 10Cl
G.K.Budnikov: J. Anal. Chem.
- - 10e 2001:56(7), 663-665
10Cl 10Cl 5Cl2
(anod)
Soluţie KCl : 0,2 M
+ -
H2O H + OH Soluţie H2SO4 : 0,1 M

+ + 10e Titrare: mod galvanostatic


10H 10H 5H2 ( i = 5 mA )
(catod)
Indicare p.e. : amperostatică
( DE = 300 mV )

N-metil uree
Cofeină Alloxan
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 450

15. Determinarea acidului salicilic şi a derivaţilor acestuia prin


titrimerie coulometrică (I) I.F.Abdullin, N.N.Chernysheva,
G.K.Budnikov: J. Anal. Chem.
Electrogenerare de halogen (clor / brom): 2002:57(8), 721-723
Soluţie KCl sau KBr : 0,2 M
Titrare: mod galvanostatic ( i = 5 mA )
Soluţie H2SO4: 0,1 M
Indicare p.e. : amperostatică ( DE = 300 mV )
Indicare p.e. : amperostatică

Acidul salicilic reactionează cu


brom la 25 oC în raport molar 1:1
Cu clor , la temperatura camerei
reacţioneaza în raporturi molare
cuprinse între 1:1 şi 1:2,5
La temperatura de 30 oC raportul
molar al reacţiei este 1:3
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 451

15. Determinarea acidului salicilic şi a derivaţilor acestuia prin


titrimerie coulometrică (II)
I.F.Abdullin, N.N.Chernysheva,
Electrogenerare de halogen (clor / brom): G.K.Budnikov: J. Anal. Chem.
Soluţie KCl sau KBr : 0,2 M 2002:57(8), 721-723

Soluţie H2SO4: 0,1 M Titrare: mod galvanostatic ( i = 5 mA )

Indicare p.e. : amperostatică Indicare p.e. : amperostatică ( DE = 300 mV )

Acidul acetilsalicilic nu reacţionează cu halogenul electrogenerat, în schimb după


hidroliză se poate determina acidul salicilic rezultat posibilitatea determinării
urmelor de acid salicilic în preparate farmaceutice cu s.a. acid acetilsalicilic
15. Determinarea acidului salicilic şi a derivaţilor 452
acestuia prin titrimerie coulometrică (III)
I.F.Abdullin, N.N.Chernysheva,
Electrogenerare de halogen (clor / brom): G.K.Budnikov: J. Anal. Chem.
2002:57(8), 721-723
Soluţie KCl sau KBr : 0,2 M
Titrare: mod galvanostatic ( i = 5 mA )
Soluţie H2SO4: 0,1 M
Indicare p.e. : amperostatică ( DE = 300 mV )
Indicare p.e. : amperostatică

Adidul p-amino-salicilic
reactioneaza cu bromul în
raport molar 1:4.

Cu clorul reacţionează ireproductibil, conform unor rapoarte molare cuprinse între


1:10 şi 1:14, evident datorită desfacerii oxidative a nucleului aromatic.
15. Determinarea acidului salicilic şi a derivaţilor 453
acestuia prin titrimerie coulometrică (IV)
I.F.Abdullin, N.N.Chernysheva,
Electrogenerare de halogen (clor / brom): G.K.Budnikov: J. Anal. Chem.
2002:57(8), 721-723
Soluţie KCl sau KBr : 0,2 M
Titrare: mod galvanostatic ( i = 5 mA )
Soluţie H2SO4: 0,1 M
Indicare p.e. : amperostatică ( DE = 300 mV )
Indicare p.e. : amperostatică

Spre deosebire de acidul p-amino-salicilic, Mesalazina reactioneaza usor şi


reproductibil conform raportului molar de 1:4, atât cu clorul cât şi cu bromul.
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 454

16. Determinarea Acamprosatului de calciu


Răşină ( Ph. E. ed. V )

-
Ca
2+ Acamprosat
de calciu
2

2
2 NaOH (0,1 M)
indicarea
- 2+ potenţiome-
Răşină - Ca
trică a p. e.
2H2O

-
2 + 2Na
Metode titrimetrice de control al medicamentelor 455

17. Determinarea cantitativă titrimetrică a Acetazolamidei ( Ph. E. ed. V )

+ NaOH
( 0,1 M în etanol )

- H2O
indicare
potenţiometrică
a punctului de
echivalenţă

dizolvare în dimetilformamidă
18. Deterinarea Irbesartanului prin titrare spectrofotometrica 456
N. Rahman ; M.R. Siddiqui ; S.N. Hejaz Azumi (India)
Chem. Pharm. Bull. 2006:54(5), 626-631

Irbesartan : antagonist puternic, - -


de lunga durata, a receptorului de 6H+ + IO3 + 5I 3I2 + 3H2O
angiotensina II (selectiv pentru
subspecia AT1) ; este tolerat mai
bine decat alte medicamente cu Produs colorat, titrat
actiune antihipertensiva cu tiosulfat de Na
18. Determinarea Irbesartanului prin titrare spectrofotometrica 457
N. Rahman ; M.R. Siddiqui ; S.N. Hejaz Azumi (India)
Chem. Pharm. Bull. 2006:54(5), 626-631
N. Rahman ; M.R. Siddiqui ; S.N. Hejaz Azumi
Chem. Pharm. Bull. 2006:54(5), 626-631
18. Determinarea Irbesartanului prin titrare si cinetica spectrofotometrica
458