Espectrometría y Fluorometría

Esquema general:

1. Radiación Electromagnética. ¿Por qué vemos los colores?

2. Espectrofotometría, conceptos básicos.
3. ¿Qué ocurre cuando una radiación electromagnética atraviesa nuestra muestra?
1. Dispersión, Difracción, y refracción.
2. Transmitancia y Absorbancia.
3. Ley de Lambert-Beer.
4. Instrumentación.
1. Tipos de espectrofotómetros.
2. Espectrofluorímetros.
3. Lectores de placas.
4. Importancia de la resolución del instrumento.
5. Tipos de cubetas.
5. Ejemplos de aplicaciones dentro del laboratorio.
1. Cuantificación de ADN y proteínas. UV-Vis y Fluorescencia.
2. Turbidometria, cuantificación de cultivos de microalgas.
6. ¡Salgamos del laboratorio! técnicas básicas en Ecofisiología Vegetal.
1. Medida de la eficiencia fotosintética (Fv/Fm).
2. Medida de la transpiración celular.
3. Vámonos al espacio. Medidas masivas desde satélites.
 ¿Por qué vemos sustancias coloreadas?

William Herschel Temperatura de Color

Espectro de absorción de disJntos compuestos:

¡Parte del espectro es absorbido y parte es reflejado!
¡Colores complementarios!
Ejemplo de moléculas vegetales que tienen un sistema π de enlaces
conjugados y estructura atómica que emite colores vivos (cromóforo):
Antocianinas Flavonoides Taninos+Flavon. Carotenos

Qué le puede ocurrir a la luz

Dispersión: Al atravesar un material las ondas lumínicas se separan en función de su
longitud de onda. Por ejemplo al atravesar un prisma son más desviadas por la refracción
cuanto menor sea su longitud de onda.

Refracción: cambio de dirección que experimenta una onda al pasar de un medio a otro.
Se produce cuando los índices de refracción de los medios son diferentes y las ondas
inciden de forma oblicua.

Difracción: fenómeno físico por el cual las ondas se desvían al encontrar un obstáculo o
atravesar una rejilla.
Los fenómenos de dispersión y difracción son empleados por el monocromador para seleccionar una longitud de onda.

Dispersión-Refracción Refracción Monocromador

 Espectrometría, conceptos básicos

Esquema de un
espectrofotómetro

Fuente de radiación
• Lámpara de Deuterio o Hidrógeno Lámpara de
Deuterio
(Región UV 160-375 nm)
• Lámpara de Tungsteno
(Región Visible, IR cercano)
• Arco de Xenón Lámpara de
Tungsteno
(Espectro continuo 150-800 nm)

Espectrometría, conceptos básicos

Esquema de un
espectrofotómetro

Selector de longitudes de onda

• Filtros
• Monocromadores
Recipiente para muestra
• Cubetas de cuarzo, sílice, plástico.
Detector de radiación
• Fotodiodos o fotomultiplcadores
¿Qué ocurre cuando la radiación atraviesa nuestra muestra?
Absorción: Al atravesar una solución, los analitos que se encuentran en ella (disueltos o
en suspensión) van a absorber parte de la radiación incidente. Esto ocurrirá de forma
característica para cada molécula, en función de la transición electrónica producida.

Transición electrónica: La luz vis o UV puede ser absorbida por los electrones de valencia,
que son “promocionados” a un estado excitado. Si la energía (frecuencia) de la onda
incidente es correcta, estos electrones ocuparán un orbital vacío. Las diferencias entre
energías absorbidas dependerán de los distintos orbitales. La energía absorbida se
disipará en forma de calor, o de calor + luz de energía más baja (fluorescencia,
fosforescencia).

Tipos de transiciones y energías

¿Qué ocurre cuando la radiación atraviesa nuestra muestra?

Emisión: Proceso por el cual los electrones excitados retornan a su estado

fundamental emitiendo luz. Estas emisiones se denominan radiactivas y pueden ser
fluorescentes o fosforescentes. La energía de la luz emitida siempre es menor a la
longitud de onda incidente (llamada de excitación).

Fluorescencia y
Fosforescencia

Fluorescencia de la clorofila, feofitina, y cPPB Fosforescencia SYBR Green, una molécula fluorescente
al ser expuestas a radiación UV.
Transmitancia y Absorbancia

Transmitancia óptica: Fracción de luz incidente, a una longitud de onda definida, que pasa a través
de una muestra. T = I / I0 I0: Intensidad rayo incidente, I: Intensidad tras pasar por la muestra.
Absorbancia óptica: -Log10(I/I0) = -Log10(T)
Absorbancia y transmitancia son útiles en una región específica del campo electromagnético (160-
780 nm, UV-Vis). No siendo útil en longitudes de onda fuera de ese rango.

• La disolución del analito debe mantenerse en En los estudios espectrofotométricos se

algún Spo de recipiente transparente, o cubeta. suele trabajar con la absorbancia. Puesto
• En las dos interfases aire/pared de la cubeta, así que esta se comporta de manera lineal.
como en las dos interfases pared/disolución
Relación entre Absorbancia y Transmitancia:
Senen lugar reflexiones.
• La atenuación del haz resultante es un factor
importante.

Transmitancia y Absorbancia

Por ejemplo aproximadamente el 8,5% de un haz de luz amarilla se pierde por reflexión en su paso
a través de una cubeta de vidrio rellena de agua.

La atenuación del haz puede ocurrir como consecuencia de la dispersión causada por moléculas
grandes y, a veces, de la absorción por las paredes del recipiente.

Para compensar todos estos efectos la potencia del haz transmiBdo por la disolución del analito se
compara con la potencia del haz transmiBdo por una cubeta idénBca que sólo conBene disolvente.
A esta muestra se la denomina “Blanco”.
0.80
Etinilestradiol (26 mg/L)
Absorbancia

0.60 Gestodeno (5.4 mg/L)

Levonorgestrel (7.2 mg/L)
0.40

0.20

0.00
220.0 240.0 260.0 280.0 300.0
OH
Longitud de onda (nm) CH3
CH3 C CH OH
CH2 C CH

CH3
OH
CH2 C CH
HO
O
ETINILESTRADIOL (ETE) LEVONORGESTREL (LEV)

O
GESTODENO (GTD)
Ley de Lambert-Beer
Además cuando un haz de luz atraviesa un medio absorbente de espesor constante, la can6dad de
energía luminosa absorbida por el medio varia en forma directamente proporcional a la concentración
del absorbente en el medio (Ley de Beer)

A=-Log10(T)=Log10(I/I0)=εbc

Denominándose ε – Coeficiente de ex6nción molar (µg/mL)-1 cm-1 o M-1cm-1

b – distancia recorrida por la luz (estándar 1 cm)
c – concentración

Carácter aditivo de la absorbancia: de una disolución es igual a la suma de absorbancias de sus

componentes
b I0

I0 I I

Límites de la Ley de Lambert-Beer

Limitaciones reales de la ley

-A concentraciones altas (generalmente > 0,01 M), la distancia media entre las moléculas
responsables de la absorción disminuye hasta el punto en que cada molécula altera la distribución de
carga de las molecular vecinas.
-e depende del índice de refracción de la muestra. Como, la magnitud de la interacción depende de
la concentración, la aparición de este fenómeno da lugar a desviaciones de la linealidad entre la
absorbancia y la concentración.

Limitaciones Químicas
Se produce cuando el analito se disocia, asocia o reacciona con el disolvente para dar productos que
presentan propiedades de absorción diferentes de las del analito.

HIn H+ + In-
Color 1 Color 2

Limitaciones Instrumentales
El cumplimiento estricto de la Ley de Beer sólo se observa para radiaciones monocromá7cas
(radiación formada por una sola longitud de onda) y éstas en la prácNca no se consiguen, ya que con
los disposiNvos disponibles (filtros, monocromadores) se obNenen una banda de longitudes de onda
más o menos simétrica entorno a la deseada
Tipos de espectrofotómetros: haz sencillo y doble haz

Tipos de espectrofotómetros: Diodos

El espectrofotómetro de disposi/vo de diodos

El espectrofotómetro de disposi/vo de fotodiodos u/liza una óp/ca inver/da
respecto del convencional: toda la luz de la fuente atraviesa la muestra, luego es
dispersada en un monocromador que en lugar de una ranura de salida /ene en el
plano focal un disposi/vo que integra en un pequeño circuito varios cientos de
detectores /po fotodiodo de silicio. El número de elementos varía actualmente
entre 64 y 4096, siendo los más comunes de 512 y 1024 elementos. La resolución
de estos sistemas es menor (2nm) a la de un espectrofotómetro clásico
 Tipos de espectrofotómetros: Fibra óptica

Tipos de espectrofotómetros: Fluorímetros

Iluminación policromática→ color

Iluminación monocromática → fluorescencia
separada de la reflexion

“Fluorescence quantum yield” (QY) = el número de

Fotones emitidos en relación con el de absorbidos.

QY requiere emisión y cuantificación de excitación

Monocromática.
 Tipos de espectrofotómetros: Lectores de placas (UV-Vis/Fluo)

Esquema de un lector de placas

con capacidad de medir fluorescencia

Importancia de la resolución de un instrumento

0.1nm de resolución 2nm de resolución

Resolución espectra-ancho espectral del instrumento (spectral bandwidth):

Como regla general, el ancho de media banda instrumental debe ser como máximo 1/10 del
ancho de media banda espectral de la banda de absorción a medir. Dado que la mayoría de
las moléculas en solución presentan en fase líquida bandas de absorción con anchos medios
entre 20 y 40 nm, un instrumento con resolución de 2 nm es generalmente adecuado. A
veces encontramos casos particulares (Ej.: vitamina B12) con anchos de banda del orden de
10 nm. En este caso, la cuantificación con un instrumento de 2 nm daría un error por defecto
del orden del 2-3%, mientras que con un equipo de 1nm de ancho de banda el error sería
despreciable.
Cuan%ficación de ADN y Proteínas

CuanFficación: Pureza:
- Lambert-Beer: RaFo 260/280 nm
1 unidad de DO a 260 nm en una solución pura ADN: ~1.8
ARN: ~2.0
de ADNdc corresponde a 50 mg/mL. La misma
densidad de ARN o ADNcs corresponde a una
solución pura a 40 mg/mL. RaFo: 260/230 nm

- Comparar con recta de calibración

(menos usado)

¿Qué ocurrirá si yo quiero cuantificar mi muestra de ADN pero esta no está 100% pura y
se encuentra contaminada con proteínas? O al revés, que ocurrirá si yo quiero cuantificar
proteínas que no se encuentran puras?

Cuan%ficación de Proteínas: Método de Bradford

Compa%bilidad del reac%vo de Bradford

Reac%vo de Bradford: Azul de coomassie

disuelto en Ácido fosfórico y agua.
Cuantificación basada en fluorescencia
Los ácidos nucleicos y las proteínas desnaturalizadas no presentan fluorescencia, pero son
capaces de interactuar con moléculas fluoróforas ofreciendoles un entorno fisico-químico
diferente que modifica sus carácterísticas de emisión.
Por ejemplo el catión eitidio o el SYBR green son agentes poco fluorescentes, que cuando
se intercalan en la hélice de los ácidos nucleicos (especialmente ADNdc, pero también
ADNcs y RNA) emiten fluorescencia.

La emisión de fluorescencia es mucho más

específica, por lo que nuestras medidas serán
mucho mas precisas. Es mucho más caro.

Tinción del ADN bromuro de eMdio SYBR Green, una molécula fluorescente

Cuan%ficación y feno%pado de cul%vos de microalgas

¿Cómo elegir la longitud de onda?

Abs 500 nm
Abs 600 nm
Abs 720 nm
 Las medidas de clorofila son un gran indicador del estado fisiológico
El marcador de estado fisiológico más empleado en plantas es el
cociente Fv/Fm. Esta basado en la medida de la fluorescencia
mínima de la clorofila tras una adaptación a la oscuridad.

Fv/Fm es un ra?o normalizado dividiendo la fluorescencia

variable por la máxima, y representa la eficiencia cuán?ca del
PSII cuando esta no saturado. Las plantas en condiciones
óp?mas presentan valores entre 0.79 to 0.84. Valores menores
indican que la planta está some?da a algún ?po de estrés.

Sistemas de fenotipado masivo a nivel de laboratorio o de parcela:

Los infrarrojos nos permiten cuantificar la transpiración

Vámonos al espacio! Ver vídeo: hKps://www.youtube.com/watch?v=1XilneV3cJI

Envisat – ESA
Las medidas por satélite son vitales para: Un ejemplo de
Monitorizar la vegetación en 7erra firme satélite cuan7ficador
Monitorizar el fitoplancton de clorofila.
Es7mar las tasas de fijación de CO2
Cuan7ficar y desarrollar modelos de
eutrofización y cambio climá7co

Datos enviados por Envisat