Microbiologie Generală - Lucrări practice

Gheorghe PUCHIANU

MICROBIOLOGIE
Lucrări practice

1
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

CUPRINS

Numărul Denumire Pag.

Laboratorului
1. Norme de protecţia muncii în laboratoarele de microbiologie în 3
vederea prevenirii contaminării personalului
2. Sterilizarea şi dezinfecţia 6
3. Mediile de cultură folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii 10
4. Tehnica însămânţării şi a transplantărilor 18
5. Examenul caracterelor culturale 22
6-7 Determinarea Numărului Total de Germeni Aerobi 26
8-9 Determinarea de drojdii şi mucegaiurilor 36
10 Metoda orizontală pentru enumerarea Escherichia coli pozitive la 42
β – glucuronidază.
11 Metoda orizontală pentru numărarea stafilococilor coagulază- 48
pozitivi - Tehnică pe mediu de gar Baird - Parker
12 Determinarea Enterobacteriaceaelor 56
13 -14 Determinarea Salmonella spp. 59
Abrevieri 68
Definiţii 69
Bibliografie 71

2
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

LABORATOR NR. 1

Norme de protecţia muncii în laboratoarele de microbiologie în vederea

prevenirii contaminării

În laborator, microorganismele pot pătrunde în organismul uman prin mai

multe căi:
 mucoasa digestivă: în cursul pipetării cu gura , introducerea în gură a
degetelor sau diferitelor obiecte de pe mesele de laborator (creioane,
ţigări, alimente), inhalare de aerosoli, etc.;
 mucoasa oculară: cum ar fi stropii de material lichid infecţios, sau
ştergerea ochilor cu degetul protejat sau nu de mănuşi.
 calea transcutanată: mai ales în cazul preexistenţei unor plăgi prin
tăiere sau zgârâieturi sau prin înţepături (ex. cu cioburi de sticlă
contaminate).
Evoluţia infecţiilor contactate în laborator poate fi atipică dar uneori şi foarte
gravă. OMS a stabilit 4 niveluri de exigenţă în ceea ce priveşte clasificarea
laboratoarelor. Nivelurile 1 şi 2 corespund laboratoarelor de bază, 3 laboratoarelor cu
regim restrictiv, şi 4 celor cu maximă restricţie.
Pentru învăţământul universitar, din punct de vedere al biosiguranţei
laboratorele de microbiologie trebuie să corespundă nivelului 2 de biosecuritate,
acest lucru presupunând obligativitatea existenţei unor mijloace de protecţie (halate,
semnalizarea riscului biologic, tehnologie microbiologică f. bună), iar pentru locul de
muncă, existenţa unor mese deschise dar şi a unor boxe de siguranţă de clasa I sau
clasa II (pentru activităţile generatoare de aerosoli).
Conform Ghidului Naţional de Biosoguranţă pentru Laboratoarele Medicale,
emis de Ministerul Sănătăţii pentru prevenirea îmbolnăvirii personalului care îşi
desfăşoară activitatea în domeniul diagnosticului de laborator, trebuie respectate
următoarele cerinţe:
Accesul
 Numai persoanele autorizate vor fi lăsate să intre în zonele de lucru ale
laboratorului.
 Uşile laboratorului trebuie să stea închise.
Protecţia individuală a personalului
 Halatele - trebuie purtate tot timpul cât se lucrează în laborator.
 Mănuşi de protecţie - trebuie purtate în timpul tuturor procedurilor care pot
implica contactul direct cu materiale potenţial infectate. După utilizare, mănuşile
se scot aseptic şi se spală mâinile.
 Personalul trebuie să se spele pe mâini după manipularea materialelor infecţioase
şi înainte de părăsirea zonei de lucru a laboratorului.

3
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
 Este interzisă purtarea îmbrăcăminţii protectoare de laborator în afara
laboratorului, de exemplu în cantine, camere de oficiu, biblioteci, toalete, etc.
 Încălţămintea decupată în partea din faţă (sandale) este improprie purtării în
laborator.
 Consumul de alimente, băuturi, machiajul şi manipularea lentilelor de contact sunt
interzise în zonelede lucru ale laboratorului.
 Depozitarea de alimente sau băuturi oriunde în zona de lucru a laboratorului este
interzisă.
 Îmbrăcămintea şi încălţămintea de protecţie ce a fost utilizată în laborator nu
trebuie să fie depozitată în aceleaşi dulapuri cu îmbrăcămintea şi încălţămintea de
stradă.
Procedurile
 Pipetarea cu gura este strict interzisă.
 Nici un material nu trebuie dus la gură.
 Toate stropirile accidentale şi expunerile evidente sau posibile cu material
infecţios trebuie raportate responsabilului laboratorului. Se va păstra o evidenţă
scrisă a acestor accidente şi incidente.
 Se va elabora şi aplica o procedură scrisă pentru curăţarea-inactivarea
substanţelor vărsate.
 Lichidele contaminate trebuie decontaminate (chimic sau fizic) înaintea evacuării
lor în reţeaua de canalizare. În funcţie de riscul evaluat se poate dezvolta un
sistem de tratare a acestor lichide.
Zonele de lucru ale laboratorului
 În laborator trebuie păstrată curăţenia şi ordinea, eliminându-se toate materialele
care nu sunt necesare pentru munca desfăşurată în laborator.
 Suprafeţele de lucru trebuie decontaminate după fiecare vărsare de materiale
potenţial periculoase precum şi la sfârşitul zilei de lucru.
 Toate materialele contaminate, probele şi culturile, trebuie decontaminate înainte
de a fi îndepărtatesau curăţate pentru refolosire.
 Ambalarea şi transportul trebuie să respecte reglementările naţionale şi/sau
internaţionale în vigoare.
 Ferestrele ce pot fi deschise trebuie prevăzute cu plase/ecrane pentru insecte.
Managementul biosiguranţei
 Responsabilul cu activitatea laboratorului (subordonat şefului laboratorului)
trebuie să asigure instruirea periodică a personalului laboratorului în domeniul
siguranţei.
 Personalul trebuie avertizat asupra pericolelor speciale şi are obligaţia să citească
manualul de siguranţă şi operaţiuni şi să respecte procedurile şi practicile
standard. Responsabilul laboratorului trebuie să se asigure că toţi membrii
personalului şi-au însuşit aceste reguli. O copie a manualului de siguranţă şi
operaţiuni trebuie să existe permanent în laborator pentru a putea fi consultată în
orice moment.
 Trebuie să existe un program de dezinsecţie şi deratizare.
4
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
 Trebuie asigurate, în caz de necesitate, pentru toţi membrii personalului, o
evaluare, supraveghere şi tratament, şi trebuie ţinute evidenţe medicale adecvate.
Conceperea structurii şi facilităţilor laboratorului
 În proiectarea laboratorului şi stabilirea efectuării anumitor activităţi în spaţiul
acestuia, se va acorda o atenţie deosebită situaţiilor despre care se ştie că ridică
probleme de siguranţă. Acestea sunt: formarea de aerosoli; manipularea de
volume mari şi/sau de concentraţii ridicate de microorganisme; supraaglomerarea
spaţiului de lucru sau acumularea de prea multe echipamente; infestarea cu
rozătoare şi insecte; accesul neautorizat.
Echipamente esenţiale pentru asigurarea biosiguranţei
 Dispozitive de pipetare, pentru a evita pipetarea cu gura. Sunt disponibile diverse
modele.
 Hotele de biosiguranţă, ce trebuie folosite ori de câte ori: se manipulează
materiale infecţioase; aceste materiale pot fi centrifugate în spaţiul deschis al
laboratorului dacă se folosesc cupe de centrifugă cu dispozitiv de securizare şi
dacă sunt introduse şi descărcate într-o hotă de biosiguranţă există risc crescut
de infecţii aerogene - se folosesc proceduri cu potenţial ridicat de producere de
aerosoli: centrifugarea
 Anse de transfer de unică folosinţă din plastic. Alternativ, în scopul reducerii
producerii de aerosoli, în interiorul hotei de biosiguranţă se pot folosi incineratoare
electrice pentru anse de transfer.
 Tuburi şi flacoane cu capace prevăzute cu filet.
 Autoclave sau alte mijloace folosite pentru decontaminarea materialului infecţios.
 Pipete Pasteur de unică folosinţă din plastic, ori de câte ori este posibil, evitând
utilizarea celor din sticlă.
 Echipamentele precum autoclavele şi hotele de biosiguranţă trebuie validate cu
metode adecvate înainte de a fi introduse în uz. Acestea trebuie revertificate la
intervale regulate de timp, în acord cuinstrucţiunile producătorului (vezi Capitolul
7).
 Riscul de inhalare (ex. producerea de aerosoli) cu ocazia folosirii anselor,
însămânţării plăcilor cuagar, pipetării, etalării frotiurilor, deschiderii recipientelor ce
conţin culturi, recoltării de probe de sânge/ ser, centrifugării, etc.
 Riscul de ingerare, cu ocazia manipulării probelor, frotiurilor şi culturilor.
 Riscul de expunere percutană, prin folosirea seringilor şi acelor.
 Decontaminarea şi eliminarea materialelor infecţioase.
Manipularea deşeurilor
 Se consideră deşeuri toate materialele care se aruncă.
Decontaminarea
 Autoclavarea cu abur este metoda de elecţie pentru toate procesele de
decontaminare.
 Materialele care urmează să fie decontaminate şi eliminate vor fi puse în
containere adecvate (ex. Saci)

5
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

LABORATOR NR. 2
Sterilizarea şi dezinfecţia

Sterilizarea presupune distrugerea microorganismelor indiferent de mijlocul

folosit, cu scopul preântâmpinării contaminării personalului, dar şi pentru a împiedica
difuzarea acestora în mediu.
Sterilizarea se poate realiza prin agenţi fizici şi chimici.
Sterilizarea prin agenţi fizici

Tipuri de Felul Exemplificare

sterilizare
Prin căldură Uscată Flambare
Încălzire la roşu
Aer cald
Umedă Fierbere
Vapori de apă sub presiune (autoclavare)
Tindalizare (încălzire fracţionată)
Pasteurizare
Prin radiaţii Ultraviolete Utilizând lămpi UV sau hote prevăzute cu
Gamma lămpi UV
Prin filtrare Membrane Chamberland
filtrante tip Berkefeld
Seitz
Etc.
Prin agenţi chimici Diferite Acid acetic 1%
substanţe Alcool etilic 70°
Alcool medicinal
Apa oxigenată 1%
Bicromatul de potasiu 5%
Cloramina 5-10%
Tinctura de iod
Hidroxid de sodiu (soda caustică)
Detergenţi diferiţi
Etc.

Sterilizarea prin flambare este cea mai simplă şi constă în trecerea obiectului
sau a suprafeţei de sterilizat prin flacără timp de câteva secunde (3 – 4 secunde) de
mai multe ori. Metoda se foloseşte în cazul extremităţii efilate a pipetelor Pasteur,
gurii eprubetelor şi flacoanelor sau altor recipiente.
Sterilizarea prin încălzire la roşu este folosită în cazul anselor de însămânţare
şi a spatulelor.

6
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
Sterilizarea prin aer cald se realizează în diferite cuptoare pe bază de curent
electric în care aerul este încălzit între anumite limite de temperatură – etuve,
sterilizatoare Poupinel, etc. Etuva este o incintă cilindrică sau paralelipipedică cu
pereţii dubli, din tablă termorezistentă, prevăzută cu rezistenţe electrice care menţin
constantă şi uniformizată temperatura selectată print-un sistem de ventilaţie.
Obiectele care urmează a fi sterilizate trebuie să fie uscate, învelite în hârtie albă,
aceasta având şi rolul de indicator al sterilizării în sensul că aceasta este corectă
când hârtia devine cafenie sub acţiunea căldurii şi aşezate pe rafturi confecţionate din
sită metalică. Timpul de sterilizare este diferit în funcţie de temperatura utilizată şi
anume: la 160°C sunt necesare 2 ore, la 170°C – 1 oră şi la 180°C – 1/2ore. Prin
aceată metodă se sterilizează sticlăria de laborator cum ar fi pipetele gradate, plăcile
Petri, mojarele, baloanele, etc, exceptând materialele plastice, obiectele din cauciuc,
etc.
Sterilizarea prin căldură umedă se poate realiza prin fierbere, mai ales pentru
instrumentele metalice, fiind recomandată utilizarea apei distilate pentru a le proteja
de acţiunea nocivă a unor săruri conţinute de apa de robinet, la care se adaugă borax
sau carbonat de sodiu pentru a împiedica ruginirea. Temperatura de 100°C timp de
½ ore distruge toate formele vegetative şi chiar unele forme sporulate microbiene.
Obiectele sterilizate în acest fel nu pot fi utilizate decât imediat după fierbere.
Sterilizarea prin vapori de apă sub presiune (autoclavarea) se realizează cu
ajutorul unor echipamente speciale numite autoclave. Acestea se închid ermetic şi au
ca sursă de alimentare curentul electric. Cu ajutorul autoclavelor se poate realiza o
atmosferă de vapori încălziţi la 100 - 135°C şi o presiune de 1-2 atmosfere, ştiut fiind
faptul că unei atmosfere îi corespunde o temperatură de 120°C. Presiunea din
interiorul autoclavului se realizează pe seama vaporilor de apă existenţi, care se
elimină printr-o supapă de siguranţă în caz de exces. Durata necesară sterilizării prin
autoclavre este variabilă în funcţie de presiunea realizată şi anume:
 la 0,5 atmosfere (115°C) – 90 de minute;
 la 1,0 atmosfere (121°C) – 30 de minute;
 la 2,0 atmosfere (134°C) – 10 minute.
Prin autoclavare se sterilizează majoritatea mediilor de cultură, sticlăria,
aparatele de sticlă cu garnituri de cauciuc, materialele de protecţie, toate materialele
infectate, etc. Recipientele care conţin lichid pe lângă dop, trebuie să fie legate la
gură şi cu hârtie. Cele ale căror dop a fost aruncat în timpul autoclavării nu se
consideră autoclavate. Verificarea sterilizării se realizează utilizând hârtie indicatoare,
sau prin utilizarea unor substanţe solide la temperatura camerei care se lichefiază la
temperatura de sterilizare (acidul oxalic la 101°C, chinina la 116°C, floarea de sulf la
120°C, acidul benzoic la 121°C şi ureea la 132°C.
În vederea sterilizării materialele trebuie pregătite corespunzător. Ex. plăcile
Petri şi mojarele se împachetează în hârtie de ambalaj, baloanele se astupă cu
dopuri de vată, se înveleşte gâtul cu hârtie şi apoi se leagă cu sfoară; eprubetele se
astupă cu dopuri de vată şi tifon, se învelesc în hârtie şi se pun în coşuri de sârmă,
etc. Autoclavul este un cazan cu pereţi rezistenţi, în care după închiderea

7
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
etanşă cu un capac masiv, fixat pe buloane (pentru a rezista presiunii create), vaporii
de apă se comprimă la presiunea necesară sterilizării.
Sterilizarea prin tindalizare (încălzire fracţionată), se foloseşte când substanţele
care urmează a fi sterilizate prezintă un grad de termolabilitate, care constă în
denaturarea lor la o temperatură de 120°C. În această categorie intră mediile de
cultură care conţin zaharuri sau substanţe proteice macromoleculare cum ar fi oul
(sterillizarea se realizează la 100°C), serul coagulat, (la 70 - 80°C), etc. Ea constă în
încălzirea materialelor de sterilizat la temperatura impusă de compoziţia lor, timp de
30 – 60 de minute, la intervale se 24 de ore, de trei ori consecutiv. În prima zi de
încălzire se distrug formele vegetative ale bacteriilor. Sporii rezistă dar după 24 de
ore la 37°C aceştia se transformă în forme vegetative care vor fi distruse prin
încălzire a doua zi. Încălzirea din a treia zi se face pentru distrugerea ultimelor forme
vegetative, rezultate în urma germinării sporilor.
Sterilizarea prin pasteurizare se foloseşte pentru lichide (lapte, bere, sucuri,
etc.), realizând numai distrugerea formelor vegetative, nu şi a celor sporulate. Ea se
poate realiza la următoarele temperaturi:
 la 60 - 65°C timp de 30 de minute;
 la 70 - 75°C timp de 10 – 20 de minute;
 la 85 - 90°C timp de câteva secunde urmată de o răcire bruscă
(pasteurizare înaltă).
Ultarapasteurizarea (uperizarea) constă în injectarea de vapori supraâncălziţi
(150°C) în masa lichidelor destinate pasteurizării.
Sterilizarea prin radiaţii se poate realiza utilizând razele ultraviolete şi radiaţiile
gamma. Razele ultraviolete care au o lungime de undă cuprinsă între 2400 - 2800Å
se folosesc pentru sterilizarea boxelor sau încăperilor, numărul acestora fiind în
corelaţie cu volumul încăperii de sterilizat. Acţiunea lor bactericidă se limitează la
distrugerea formelor bacteriene vegetative. Lămpile vu UV sunt nişte tuburi de sticlă
specială, în care descărcările electrice într-o atmosferă cu vapori de mercur la joasă
presiune generează radiaţii ultraviolete. Viaţa de funcţionare este de aproximativ 100
de ore.
Sterilizarea prin radiaţii gamma se utilizează în special pentru vasele din
material plastic cum ar fi plăcile Petri.
Sterilizarea prin filtrare se utilizează pentru sterilizarea lichidelor sau gazelor.
Filtrele pot fi de mai multe feluri cum ar fi: Chamberland (confecţionate din porţelan
ars), Berkefeld (fabricate din pământ cu infuzori sau kiselgur) filtre Seitz (fabricate din
amestec de celuloză şi azbest) filtre din sticlă (sub forma unor plăci montate în pâlnii)
şi membranele filtrante (confecţionate din colodiu, celuloză sau material plastic),
utilzate în special în virusologie. În ultimul timp se utilizează în special membranele
filtrante tip „Milipore”. Ele sunt racordate în special la pompe de vid sau la pompe de
presiune şi au capacităţi variabile.
Sterilizarea prin agenţi chimici se realizează utilizând substanţe care au un
efect nociv asupra microorganismelor. Ele pot avea un efect bacteriostatic, atunci
când se utilizează doze reduse sau bactericidă când se utilizează doze

8
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
mari. Substanţele chimice pot avea o acţiune selectivă, bactericidă pentru unii
germeni patogeni sau bacteriostatică pentru alţii. Pe acest principiu se bazează
selectivitatea unor medii de cultură în care sunt înglobate unele substanţe (ex. verde
briliant).
Incinerarea – presupune arderea cu reducerea materialului inţial la stadiul de
cenuşă. Este indicată pentru deşeurile biologice şi materialele consumabile
confecţionate din plastic

9
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

LABORATOR NR. 3

Mediile de cultură folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de

bacterii

Mediul de cultură este o substanţă lichidă, semisolidă sau solidă care conţine
constituenţi naturali sau sintetici capabili să producă multiplicarea (cu sau fără inhibarea
anumitor microorganisme), identificarea sau păstrarea viabilităţii microorganismelor.
Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, care trebuie să asigure
microorganismului ce urmează a fi cultivat, cantitatea necesara de apă, surse de carbon,
azot, substanţe minerale, factori de creştere, substanţe care să îi furnizeze cantitatea de
energie cât şi toate elementele folosite de celulă în procese de creştere, reproducere şi
întreţinerea funcţiilor vitale.
Mediile de cultură sunt utilizate în tehnici microbiologice de laborator, pentru
izolarea, cultivarea şi întreţinerea culturilor pure şi pentru controlul microbiologic al
produselor alimentare. Diversitatea mediilor de cultură este datorată si capacitaţii de
adaptare a numeroase microorganisme întâlnite în habitaturile naturale cât şi de faptul
că prin modificarea compoziţiei mediilor de cultură se pot obţine randamente superioare
în produşi de metabolism microbian cu valoare economică.
Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii
de cultivare corespunzatoare este de o importanţă hotărâtoare. Cunoscându-se
însuşirile germenilor cautaţi, condiţiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie
sa folosească mediile cele mai eficiente şi indicate de izolare, în funcţie de specia
microorganismului în cauză.

Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

- să asigure substratul nutritiv pentru creşterea şi multiplicarea microorganismelor;
- sa aibă un pH care să permită desfăşurarea normală a proceselor metabolice
microbiene (în general 7,2—7,4);

10
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
- să asigure condiţiile de aerobioză sau anaerobioză;
- să aibă o concentraţie a substanţei dizolvate în mediu care să nu influenţeze
negativ schimburile osmotice ale celulei;
- să nu conţină substanţe toxice sau să genereze compuşi toxici în urma creşterii
culturii microbiene;
- să fie steril astfel încât să nu dezvolte numai celule introduse prin inocul;
- sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alte
microorganisme.

pH metru Medii de cultură păstrate în baloane Erlenmeyer

În practica de laborator mediile de cultură se folosesc pentru izolarea din medii

naturale a diferitelor microorganisme pentru obţinerea de culturi pure, pentru cultivarea
acestora în scopul obţinerii de biomasă sau pentru întreţinerea culturilor pure
selecţionate.
În scop industrial mediile de cultură se folosesc pentru obţinerea de celule sau a
compuşilor rezultaţi prin activitatea microorganismelor selecţionate.
Clasificarea mediilor de cultură (conform SR EN ISO 11133. Microbiologia
alimentelor, hranei pentru animale şi a apei. Preparare, producere, depozitare şi
încercări de performanţă ale mediilolor de cultură):
După compoziţie:
- chimice ;
- parţial chimice ;
- cromogene şi fluorogene.
După consistenţă:
- medii lichide - care constau dintr-o soluţie apoasă şi unul sau mai
mulţi constituenţi, cum ar fi apa peptonată şi agarul nutritiv ;
- medii solide - medii lichide care conţin substanţe solide - agar -
agar, gelatină, în diferite concentraţţii.
În funcţie de utilizare :
- medii de transport - destinate să păstreze şi să menţină viabilitatea
microorganismelor în perioada dintre colectarea probelor şi
procesarea lor în laborator (ex. mediul Stuart sau mediul Amies) ;

11
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
- medii de păstrare - destinate să păstreze şi să menţină viabilitatea
microorganismelor pe o perioadă extinsă protejându-le împotriva
diferitelor influenţe care pot apare pe
perioada stocării îndelungate şi care să permită recupararea după
această perioadă (ex. agar nutritiv în pantă) ;
- medii de diluţie - medii destinate să reducă concentraţia
microorganismelor utilizând diluţii fără ca acestea să se multiplice
sau să fie inhibate pe parcursul perioadei de cultivare (ex. soluţie
de peptonă cu sare) ;
- medii de resuscitare - medii care să permită microorganismelor
stresate sau afectate să se repare şi să îşi recapete capacitatea de
creştere normală (ex. apă peptonată Buffered) ;
- medii de preâmbogăţire şi îmbogăţire - medii în general lichide care
datorită compoziţiei lor furnizează condiţii particulare favorabile
pentru multiplicarea microorganismelor - ex. bulion triptonă soia),
medii selective de îmbogăţire (care permit multiplicarea anumitor
microorganisme parţial sau în totalitate, inhibând creşterea altor
microorganisme - ex. mediu Rappaport - Vassiliadis - RVS), medii
de îmbogăţre non - selective (care permit creşterea unei varietăţi
mari de microorganisme - ex. bulion inimă - creier) ;
- medii de izolare - solide sau semisolide care permit creşterea
microorganismelor (medii de izolare selective - care permit
creşterea specifică a unor microorganisme în timp ce inhibă total
sau parţial alte microorganisme - ex. mCCD agar), mediu de izolare
non - selectiv care nu inhibă specific creşterea unor
microorganisme - ex. agarul nutritiv), medii selective cromogene şi
fluorogene (care conţin componente selective şi care inhibă total
sau parţial marcând microorganismele ţintă, aspect ce permite
detecţia cu precizie a acestora - ex. TBX agar MUG/EC medium)
- medii diferenţiale - medii care permit testarea unuia sau mai multor
carcateristici fiziologice/ biochimice ale microorganismelor în
vederea identificării lor - ex. TBX agar, agar lactoză cu tergitol 7,
TTC, Xilose lisyne deoxycholate - XLD)
- medii de identificare - destinate să producă o reacţie de identificare
specifică care nu necesită teste suplimentare de confirmare - ex.
agar bilă esculină azidă) ;
- medii de enumerare - medii selective sau non - selective care
permit cuantificarea microorganismelor - ex. agar Baird - Parker,
agar Yeast extract agar;
- medii de confirmare - medii care contribuie la identificarea sau
carecterizarea microorganismelor după o prealabilă resuscitare
şi/sau îmbogăţire si/sau izolare - ex. Klinger iron agar);
- medii care conţin neutralizanţi - medii de transport, diluţie sau medii
de cultură care conţin ingrediente
12
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
neutralizante pentru inactivarea detergenţilor/ dezinfectantelor sau
a altor agenţi cu efect biocid);
- medii cu folosinţă multiplă - medii utilizate pentru mai multe
categorii de microorganiseme - ex. agar cu sânge, apă peptonată
Buffered;
- medii de referinţă - medii obişnuit non - selective pentru evaluarea
comparativă a performanţelor independent de mediile care sunt
utilizate în mod obişnuit pentru control, pentru a demonstra că
acestea sunt potrivite.
După metoda de preparare:
- Medii gata de utilizare - lichide solide sau semisolide care au fost
turnate în plăci, sticle, tuburi sau alte recipiente într-o formă gata de
utilizare după retopire sau după retopire şi completare;
- Medii de cultură finale - medii care sunt gata pentru însămânţare;
- Medii gata de utilizare după topire - mediul trebuie să fie retopit de
exemplu pentru a fi turnat în plăci Petri;
- Gata de utilizare după retopire şi suplimentare - mrdiu trebuie să fie
retopit şi suplimentat înainte de a fi utilizat - ex. agar tryptose
sulphite cycoserine (TSC), Baird - Parker sau plasmă de iepure
(RPF);
- Medii preparte şi comercializate în formă deshidratată - medii
uscate care necesită rehidratare şi procesare înainte de utilizare,
rezultând una sau două feluri de medii: complete şi incomplete la
care trebuie adăugate suplimente înainte de utilizare.- ex. pudră,
granule, produse liofilizate.
Prepararea mediilor de cultură
Corectitudinea preparării mediilor de cultură este o etapă fundamentală pentru un
examen microbiologic corect, fiind necesar să se respecte bunele practici de laborator şi
instrucţiunile de lucru.
Pentru prepararea mediilor de cultură se utilizează numai apă pură, distilată,
demineralizată, deionizată sau produsă prin osmoză inversă, liberă de subsatanţe care
inhibă sau influenţează creşterea microorganismelor în condiţii de testare
Apa purificată - trebuie să fie stocată în recipienţi legaţi strâns confecţionaţi din
materiale inerte (sticlă neutră, polietilenă, etc.) care trebuie să fie libere de substanţe
inhibitoare. Este recomandat ca apa să fie utilizată cât mai repede după preparare.
Contaminarea microbiologică nu trebuie să depăşească 10³ ufc/ml, de preferabil sub 10²
ufc/ml. Contaminarea microbiologică trebuie să fie monitorizată în mod regulat în
concordanţă cu prevederile ISO 6222 cu incubare la 22ºC±1 ºC pentru 68±4h sau
utilizând o metodă echivalentă. Conductivitatea apei trebuie de asemenea monitorizată.
Cântărirea şi rehidratarea - trebuie luate măsuri de precauţie, mediul deshidratat
sau ingredientele individuale trebuie amestectae bine, evitând formarea de bulgări.
Pentru cântărire trebuie utilizată o balanţă care să prevină eventuale erori , eroarea
maxim admisă fiind de 1% sau sub această valoare
Dizolvare şi dispersie............................
13
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

Autoclavarea - este o metodă de sterilizare cu vapori sub presiune. Mediile se

prepară după reţete oficiale, se introduc în recipiente adecvate cu dopuri.
După introducerea materialului de sterilizat, se închide, se pune în funcţie lăsând
robinetul deschis până când jetul de vapori devine continuu. În acest moment, se închide
robinetul şi se continuă încălzirea până când manometrul indică presiunea (temperatura)
necesară, se menţine presiunea constantă timpul necesar.
O sterilizare eficientă, care asigură distrugerea celulelor vegetative şi a sporilor,
se realizează în intervale care sunt în funcţie de următoarele presiuni şi temperaturi:
- 0,5 atmosfere ( 1150 C) - 90 minute;
- la 1,0 atmosfere ( 1210 C) - 30 minute;
- la 2 atmosfere ( 1340C) - 10 minute.
Obişnuit se practică sterilizarea mediilor la 1 atmosferă timp de15 minute, iar
mediile care conţin zaharuri la 0,5 atmosfere timp de 15 minute.
După terminarea sterilizării se scoate din funcţie sursa de încălzire, se lasă să
scadă presiunea şi apoi se deschide robinetul de evacuare totală a vaporilor de apă şi se
usucă materialele.. Nu trebuie neglijat acest amănunt pentru că în caz contrar se pot
produce accidente datorită diferenţei bruşte de presiune.
Procedura de verificare
- Verificarea sterilităţii - verificarea sterilităţii mediilor de cultură preparate în
laborator sau a celor gata preparate se face prin termostatarea unor cantităţi
reprezentative din lot la temperatura de 35-37C, timp de 24 ore. După
termostatare recipientele cu mediile de cultură trebuie să nu prezinte creştere
microbiană. În caz că se observă creştere microbiană, lotul respectiv este scos
din procesul analitic;
- Verificarea pH-ului - fiecare lot este verificat în privinţa pH –ului înainte de
turnarea lui în placi Petri sau eprubete. pH trebuie fie identic cu cel din reţeta
de preparare;
- Verificarea calităţilor nutritive ale mediului - verificarea calităţilor nutritive se
face prin însămânţarea lui cu culturi de referinţă din colecţia de lucru;
- Verificarea propietăţilor de specificitate şi selectivitate - se face prin
însămânţarea lor cu amestecuri de culturi din colecţia de referinţă incluzând
atât organisme specifice pentru mediul respectiv cât şi organisme sensibile la
substanţele inhibitoare din mediu. Însămânţarea cu aceste culturi se face în
cantităţi foarte mici pentru organismul specific în vederea stabilirii ratei de
recuperare.
Tulpinile de referinţă folosite pentru verificarea fiecărui mediu de cultură sunt
stipulate în procedurile de fabricaţie ale mediilor de cultură.
Exemple de preparare medii de cultură
Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :
Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are
largi utilizari, in special când i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului

14
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: apă distilată 100,0 ml;
peptonă 1,0 g; NaCl 0,5 g.
Se ajusteaza pH-ul la 7,2—7,4, se incalzeşte 15 minute la 115°C pentru
precipitare, se filtreaza prin hârtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.

Apă peptonată

Când se adaugă zaharurile, acestea se pun în proportie de 1% in balonane

separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator
si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluţia de
albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol
+ 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata.
Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine şi cabaline, mai rar
din cea de pasare. Muschii se curaţa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se
taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga
1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30
minute, se decanteaza şi se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe
straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniţial. Se incalzeste la 80-
90°C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid.
Se ajustează pH-ul cu o soluţie de NaOH n :1 (la 7,2—7,6) prin metoda colorimetrica.
Se încălzeşte la autoclav la 115°C timp de 15 minute. Încălzirea în prezenţa NaOH
produce o precipitare abundentă, ceea ce impune o filtrare prin hârtie de filtru. Apoi
se face repartizarea în tuburi, în cantitate de cca 5 ml, în sticle sau baloane, care se
astupă cu dopuri de vată şi se sterilizează 30 minute la auitoclav la 115°C.
Pentru repartizare se pot folosi pipete de 25—50 ml, dar cel mai practic este să se
folosesca dispozitive speciale - pâlnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc şi
clemă. În unele laboratoare există dispozitive automatizate care asigură un debit
constant, reglabil (aşa numitele turnătoare de medii).
Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa
fie perfect limpede. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine
inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina.
15
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
La ora actuală, este din ce în ce mai raspindită folosirea extractelor de carne
care sunt livrate în stare deshidratată, purificată şi standardizată, ceea ce asigură
obţinerea unor medii de o calitate superioară (extractele Merck, Oxoid etc.).
Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obţinut prin adăugarea la bulionul
de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determină
solidificarea mediului.
La 1 litru de bulion, se calculează 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se
topeşte apoi prin încălzire la 115°C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtrează prin vată,
în autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrării).
Se repartizează în eprubete sau alte recipiente unde urmează a fi păstrat. Se
astupă cu dopuri de vată, se sterilizează 20 de minute la 120°C după care
eprubetele se pun în pziţie inclinată pentru solidificare.
Păstrarea se poate face în flacoane închise etanş pentru a evita pierderea apei,
dar în general este bine să nu se prepare şarje prea mari pentru a dispune de mediu
cât mai proaspăt.
Curba de creştere a culturilor microbiene
Prin inocularea de celule, aparţinând unei culturi pure, într-un mediu nutritiv steril
se poate stabili dinamica de creştere prin studiul vitezei de acumulare a biomasei sau
prin creşterea numărului de celule raportat la unitatea de volum a mediului.
În condiţiile experimentale, dinamica multiplicării microorganismelor este bine
cunoscută. Procesul evoluează într-o serie de faze succesive.

1÷2-faza de repaos (faza lag);

1÷a-perioada de adaptare;
a÷2-perioada de refacere;
2÷3-faza exponenţială; 3÷4-faza staţionară;
3÷b- perioada de spor de creştere negativ;
b÷4-perioada de staţionare propriu-zisă;
5-faza finală de declin.

Faza de latenţă, de creştere zero sau de lag reprezintă etapa de timp când după
inoculare numărul celulelor rămâne neschimbat, sau chiar scade, noile condiţii de mediu
implică latenţa inducţiei acelor enzime necesare pentru adaptarea la mediul nutritiv. Faza
de latenţă apare deci ca o perioadă de adaptare la condiţiile noi de cultură, în care
microorganismele viabile din inocul îşi acumulează în celulă metaboliţi şi sistemele
necesare creşterii, în cazul în care aceste componente biochimice le lipseau datorită
condiţiilor de mediu anterioare inoculării. În cazul drojdiilor această fază poate dura 1-2
ore,durată ce depinde de compoziţia mediului şi capacitatea de reglare a
16
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
metabolismului propriu. Faza lag se poate prelungi mult dacă inoculul este obţinut din
culturi vechi sau care s-au păstrat în condiţii de refrigerare. În schimb dacă la inoculare
s-a folosit o cultură viguroasă, aflată în faza activă de creştere, în mediul cu o compoziţie
similară, faza lag este scurtă sau poate să fie absentă.
Faza de multiplicare exponenţială sau de creştere logaritmică este
caracterizată prin aceea că, după o scurtă perioadă (cca. 2 ore) de accelerare a ritmului
de creştere, în care multiplicarea se produce cu o viteză progresivă mărită, acest ritm
devine constant şi caracteristic în anumite condiţii de cultură, durata unei generaţii fiind
minimă. Perioada de echilibru poate fi menţinută numai atât cât nu intervin alterări
importante, pe care creşterea le poate provoca în compoziţia mediului. De exemplu,
numărul de celule de drojdie sau de bacterii şi cantitatea de materie vie formată creşte
temporar după o progresie geometrică cu raţia 2. Celulele aflate în faza exponenţială de
multiplicare sunt cele mai potrivite pentru cercetări de genetică şi fiziologie.
Faza staţionară (de maturare) în care numărul celulelor viabile este maxim şi
rămâne constant o perioadă de timp. De exemplu, celulele de drojdie nu mai
înmuguresc, îşi măresc volumul şi tind spre forma sferică, se rotunjesc. Celulele de
microorganisme au în această fază caracteristicile morfologice cele mai tipice genului şi
speciei. Această fază poate fi prelungită atunci când urmărim păstrarea culturii pure, prin
modificarea unor factori care scad viteza de metabolism celular.
Faza de declin se caracterizează printr-o scădere în progresie geometrică în
raport cu timpul a numărului de celule vii. Pe măsură ce mediul devine mai puţin
favorabil, celulele vii nu se mai multiplică, deşi activitatea lor mai continuă un timp după
care mor şi intră în autoliză. La sfârşitul acestei ultime faze se înregistrează maximum
absolut al numărului total de celule formate pe parcursul întregii evoluţii a culturii.

VRBG – mediu prost preparat

17
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

LABORATOR NR. 4

Tehnica însămânţării şi a transplantărilor

Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea

germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de
examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic,
metodele bacteriologice complexe permit, pe lânga izolare si cercetarea diferitelor
insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din
punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea
in consum a unor produse alimentare care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii,
uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca pericolul pe care-l prezinta,
mai ales carnea animalelor sacrificate de necesitate, la care intreruperea procesului
patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu
trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in
evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc., toate transmisibile la
om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si
permite deci, eliminarea ei.
Tehnica însamânţarii - ca tehnici de însamânţare pot fi aplicate mai multe
procedee:
Pentru aceasta, trebuie parcurse următoarele etape.
 Se ordonează pe masa de lucru echipamentele necesare;
 Operatorul se aşează comod pe scaun cu antebraţele sprijinite complet
de blatul mesei de lucru;
 Se ia ansa de însămânţare în mâna dreaptă (ca pe un creion);
 Cu mâna stângă se ia recipientul din care se prelevează sau se
introduce materialul manipulat, cât mai aproape de extremitatea
inferioară, în aşa fel încât operatorul să aibă vizibilitate optimă asupra
conţinutului;
 Se scoate dopul recipientului, cuprinzându-l între degetul mic, inelar şi
palma mâinii drepte;
 Se sterilizează prin flambare gura recipientului, trecându-l de mai multe
ori (3-5 ori) prin flacăra generată de becul Bunzen;
 Se introduce ansa în eprubetă pentru prelevarea sau depunerea
materialului microbian, evitându-se atingerea cu ansa a pereţilor
recipientului;
 După retragerea ansei, se flambează gura recipientului şi se introduce
dopul sau se înşurubează capacul;
 Se resterilizează ansa.

18
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

Cu ajutorul acului de însămânţare drept - se cauterizează suprafaţa

produsului alimentar şi se sterilizează acul prin încălzire la roşu (tija se trece şi ea de
3 ori prin flacară), iar după răcire se înţeapă prin suprafaţa cauterizată, facând câteva
mişcări spre interior. Se scoate acul şi se face însamânţarea prin clătirea acestuia
în mediul lichid.
Fără a se flamba, acul se introduce apoi în tubul cu mediul solid, făcându-se
pe suprafaţa acestuia mişcări în zig-zag, începând de la baza mediului spre partea
superioară, sau se clăteşte acul în lichidul de condensare, după care se umectează
întreaga suprafaţă a mediului cu acest lichid, prin înclinări repetate. După fiecare
probă, acul se sterilizează prin înroşire la flacară.
Cu pipeta Pasteur - se cauterizează suprafaţa probei cu o spatulă încalzită,
se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambată şi ea şi răcită, o cantitate de
lichid organic din profunzime şi se însamânţează întâi pe mediul lichid (bulion), iar apoi
pe mediul solid (agar înclinat, agar cu sânge, agar ou ser etc.). La închiderea şi
deschiderea tuburilor se iau toate măsurile de asigurare a sterilităţii, flambând gura
lor imediat dupa deschidere şi înainte de închidere.
Cu porţiuni de aliment - când alimentul a fost recoltat în condiţii de
sterilitate, se poate recurge la secţionarea unor bucăţi cu ajutorul unor instrumente
sterile, iar cu una din suprafeţele secţiunii se dispersează materialul patologic pe
suprafaţa unei plăci cu mediu. În unele laboratoare aceasta tehnică este folosită
aproape în exclusivitate.
Prin introducerea direct, în mediu a portiunilor de aliment - metoda se
foloseşte mai rar, în special când se bănuieşte sărăcia în germeni a materialului
patologic. Recoltarea şi manipularea acestuia trebuie să se facă în conditii de
sterilitate perfecte. Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare
sau secţionarea tesuturilor înainte de recoltarea materialului pentru examenul
bacteriologic.
Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor
germeni in stare pura, fie menţinerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de
colectie).
Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur
19
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (câteva
picaturi) din cultura veche, care apoi se insamânteaza in mediul proaspat. In cel
de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se
face insamântarea pe mediile proaspete (intâi in mediul lichid si apoi in mediul
solid, daca este cazul).
Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclând o
cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.
In timpul insamântarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere
câteva reguli general valabile:
- însămânţările se execută în boxe sterile sau în hote speciale care
permit sterilizarea periodică şi nu permit formarea de curenţi de
aer în timpul lucrului;
- în timpul operaţiunilor de însămânţare se evită pe cât posibil
conversaţia şi orice mişcare de prisos în jurul operatorului;
- ansa cu care se execută însămânţarea nu trebuie să fie atinsă de
nici un obiect nesteril (mână, halat, masă de lucru, etc.);
- însămânţările se vor executa cât mai repede, cu scopul de a
reduce la minim contactul materialului de însămânţat cu atmosfera
ambiantă;
- în timpul cât recipientele sau tuburile de cultură, sterile sau
însămânţate sunt deschise, vor fi ţinute în poziţie înclinată cât mai
aproape de flacără pentru a evita contaminarea cu germeni sau
spori din atmosferă;
- imediat după însămânţare se face notarea tuburilor cu creioane
speciale fără a se omite data însămânţării.

20
Microbiologie Generală - Lucrări practice

21
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

LABORATOR NR. 5

Examenul caracterelor culturale

Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultură ia aspecte diferite în

funcţie de specia în cauză, mediul folosit şi uneori condiţiile de cultivare. Pentru unele
specii, o serie de caractere culturale reprezintă particularităţi deosebit de preţioase
pentru identificarea lor.
În mediile lichide, în aprecierea dezvoltării bacteriilor se au în vedere turbiditatea,
depozitul şi formaţiunile de suprafaţă.
 Turbiditatea - poate fi pronunţată, discretă sau poate să lipsească.

 Depozitul - ia naştere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care

s-au dezvoltat în mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, vâscos
sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu
la fundul tubului.

22
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

Depozit neomogenizabil

 Suprafaţa - mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile,

rugoasă, granulară, încreţită sau netedă, sau al unui inel de grosimi
variabile la suprafaţa lichidului.

 Culoarea - este diferită în funcţie de prezenţa şi natura pigmentului pe

care eventual îl conţin (alb, galben, verde, roşu, portocaliu etc.);

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerări cunoscute sub

numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. În aprecierea lor, se au în
vedere: dimensiunile, forma în ansamblu, profilul, suprafaţa, marginile, culoarea,
opacitatea, consistenţa, emulsionabilitatea.
Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabilă, pâna la câţiva milimetrii
diametru.
 Forma poate fi circulară, ovalară, radiată sau neregulată;
 Profilul (în secţiune prezumtivă) poate avea un aspect plat, convex,
concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform;
23
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
 Suprafaţa poate fi netedă, aspră, granulară, lucioasă sau mată;
 Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri;
 Culoarea coloniilor este diferită în funcţie de prezenţa şi natura
pigmentului pe care eventual îl conţin (alb, galben, verde, roşu, portocaliu
etc.);
 Sub raportul opacităţii, coloniile pot fi translucide sau opace, între ele
existând grade intermediare;
 Consistenţa este şi ea variabilă: untoasă, vâscoasă, uleioasă,
grunjoasă, friabilă, filantă, ea determinând cel mai adesea şi gradul de
aderenţă la suprafaţa mediului. În timp ce coloniile de consistenţă
untoasă şi granulară se desprind cu uşurinţă, cele vâscoase aderă,
determinând o dificultate în desprinderea lor;
 Emulsionabilitatea poate fi uşoară sau dificilă şi face ca suspensiile care
se practică să fie omogene sau neuniforme.

Câteva exemple în acest sens, pot fi edificatoare.

În medii lichide:
 mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi);
 mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioară a
mediului (E. coli);
 mediul poate fi clar, însă la fund prezintă un depozit grunjos
sau nisipos (streptococi);
 mediul poate fi clar, cu un depozit floconos şi aderent la fundul tubului
(bacilul antraxului);
 mediul prezintă un voal subţire la suprafaţă (vibrionul holeric);
 mediul prezintă o membrană uscată la suprafaţă (Bacillus subtilis);
 mediul prezintă o membrană groasă, rugoasă, plisată la suprafaţa,
restul lichidului ramânând limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat
în verde-albastrui (B.piocianic).
Pe medii solide:
 E. coli dă colonii rotunde cu margini şi suprafeţe netede de
3—5 mm diametru, de culoare albă-laptoasă, lucioase;
24
 Microbiologie Generală - Lucrări practice
 Pasteurella spp. dă, de regulă, colonii mici, abia vizibile, transparente,
uneori uşor albăstrui, aderente la mediu;
 Bacilul antraxului formează colonii cu suprafaţa aspră şi cu margini
având prelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor
ondulaţii ale firelor de păr;
 stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini şi suprafeţe
netede, unele din ele pigmentate în alb, auriu sau citrin;
 streptococii dau colonii mici bombate;
 Bacilul tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu margini
neregulate.
Bacteriile anaerobe oferă şi ele aspecte variabile în funcţie de mediul folosit în
cultivarea lor.
 În cazul mediilor lichide, în general, se produce o tulburare uniformă cu
sau fară producţie de gaze, vizibile sub forma unor bule în masa lui, fie la
suprafaţă.
 În cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de
colonii, în funcţie de difuzibilitatea germenilor în mediu, însuşire legată
de prezenţa mobilităţii . Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii
pufoase de aspect sferoid , în timp ce cele imobile ( Cl. perfringens )
produc colonii de aspect lenticular , de talie variabilă.

25
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

LABORATOR NR. 6 - 7

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI

DIN PRODUSELE ALIMENTARE
Metodă orizontală pentru enumerarea microorganismelor.
Tehnică de numărare a coloniilor la 30ºC
SR EN ISO 4833/2003

Standardul stabileşte o metodă orizontală pentru enumerarea microorganismelor

prin numărarea coloniilor crescute pe unh mediu solid după incubarea aerobă la 30 ºC.
Microorganism - este o bacterie, drojdie sau colonie numărabilă formatoare de mucegai.
Produse alimentare care se examinează în vederea detectării NTG: lapte
crud; lapte pentru consum, Lapte UHT; lapte praf, zer dulce praf, cazeinat şi zer acid
praf, zară praf, lactoză, cazeină ( acidă, lactică, cheag); produse lactate praf pentru copii;
smântână dulce pentru frişcă şi frişcă bătută; lapte concentrat cu zahăr; produse lactate
congelate inclusiv înghetată de consum; unt, brînză topită; carne zvântată, refrigerată,
congelată şi organe de pasăre, mâncăruri gătite congelate şi mâncăruri gătite, servite
calde; preparate din carne, mixte sau simple, gata pregătite, care se consumă reci, fără
altă prelucrare (piftii, pateuri din carne şi organe, biftec); peşte proaspăt, decapitat şi
eviscerat; prăjituri cu cremă , deserturi , creme; maioneză; prafuri de budinci şi creme
deshidratate, înlocuitori de frişcă; băuturi răcoritoare şi sucuri de fructe cu termen de
valabilitate mai mic de 14 zile; pulberi pentru sucuri; făinuri alimentare altele decât făinuri
pentru panificaţie (făină de orez, orezin, fosfarin); specialităţi din ciocolată umplute cu
cremă grasă sau de tip fondant; specialităţi din ciocolată umplute cu cremă grasă sau de
tip fondant;concentrate alimentare (supe, cuburi de carne); ceai (plantă); melanj din ouă
praf; produse din grâu germinat; fructe de mare refrigerate; sandviciuri, mâncăruri tip
fast-food; etc.
Principiul metodei
Prepararea a două plăci turnate prin folosirea unui mediu de cultură specific şi a
unei cantităţi specificate de probă, dacă produsul iniţial este lichid sau a unei cantităţi
specificate de suspensie îniţială în cazul altor produse. Prepararea în aceleaşi condiţii, a
altei perechi de plăci turnate, folosind diluţiile decimale ale probei sau ale suspensiei
iniţiale. Incubarea plăcilor Petri în condiţii de aerobioză timp de 72 de ore la temperatura
de 30oC. Calcularea numărului de microorganisme pe ml sau pe g de probă din numărul
de colonii obţinute pe plăcile selectate.
Medii de cultură şi diluanţi
Medii de cultură
Compoziţie - Agar pentru numărare - PCA.

26
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

Mediu de cultură PCA – Pulbere deshidratată

Acesta conţine: digest enzimatic pentru cazeină 5,0g, extract de drojdie 2,5g,
glucoză anhidră (C6H12O6) 1,0g, agar 9 - 18g şi apă 100 ml. La examinarea produselor
lactate se adaugă 1,0g lapte praf degresat pe un litru de mediu de cultură. Laptele praf
degresat trebuie să nu conţină substanţe inhibitoare;
Preparare - pentru preparare în caz că se utilizează mediu complet deshidratat
disponibil comercial se respectă instrucţiunile producătorului. După preparare se necesar
să se regleze pH-ul dacă este necesar, în aşa fel încât după sterilizare să fie 7,0±0 la
25oC;

Mediu de cultură PCA – determinare pH

Distribuţie - se repartizează mediul în eprubete, în cantităţi de 12 - 15 ml/

eprubetă, sau în flacoane sau sticle cu capacitatea de până la 500 ml;

27
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

Mediu de cultură PCA

Sterilizare - se sterilizează la autoclav la 121oC timp de 15 minute;

Păstrare - dacă mediul se foloseşte imediat, se răceşte înainte de folosire pe o
baie de apă (aptă de a opera de la 44 - 47 oC). În caz contrar se păstrează la întuneric la
temperatura de 3±2 oC pentru maxim 3 luni, în condiţii care să nu provoace nici o
modificare a compoziţiei sau proprietăţilor.
Înainte de începerea examenului microbiologic, pentru a evita orice întârziere la
turnarea mediului, înainte de folosire, se topeşte complet mediul, apoi se răceşte pe o
baie de apă între 44 - 47 oC.
Pentru a verifica temperatura mediului se recomandă să se pună un termometru
într-o porţiune de soluţie de control ce conţine 15g/l agar, într-un container separat,
identic cu cel folosit pentru mediu. Soluţia de control trebuie să fie supusă la celeaşi
operaţii de încălzire şi răcire ca şi mediul.
Aparatură şi sticlărie
 Aparat pentru sterilizare uscată (etuvă) sau umedă (autoclav);
 Incubator apt de a opera la 30o±1oC;
 Cutii Petri din sticlă sau plastic, cu diametrul de 90 - 100 mm;
 Pipete cu capacitate nominală de 1 ml;
 Baie de apă, aptă de a opera de la 44 - 47 oC;
 Echipament de numărare a coloniilor, costând dintr-o bază luminată pe un
fond întunecat, prevăzut cu lentile de mărire cu putere corespunzătoare de
circa 1,5x şi un dispozitiv de numărare mecanic sau electronic digital;
 pH- metru, având o acurateţe a etalonării de 0,1 unităţi de pH la 25oC;
 Eprubete, flacoane sau sticle de capacitate corespunzătoare nu mai mare
de 500 ml.
Eşantionare
Este important ca laboratorul să primească un eşantion care este cu adevărat
reprezentativ şi care să nu fi fost deteriorat sau modificat în timpul transportului sau
depozitării.

28
 Microbiologie Generală - Lucrări practice

Probe de lapte materie primă care urmează

să fie introduse în lucru
Pregătirea probei
Exemple:
Lapte şi produse lactate – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura
o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu
eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Intervalul
dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să
depăşească 3 minute.
Lapte praf, zer dulce – se amestecă direct conţinutul recipientului închis, prin
agitări şi răsturnări repetate..Se cântăresc 10 g eşantion într-un vas de sticlă şi se
răstoarnă praful în sticlă cu soluţia de diluare (90 ml de soluţie adecvată la 45+-1oC în
baie de apă). Se menţin flacoanele în baia de apă timp de 5 minute agitând din când în
când. Se obţine astfel o diluţie de 10-1.

Pregătirea eşantionului pentru analiză şi a diluţiei iniţiale

Cu o pipetă sterilă se introduce 1 ml din soluţia iniţială într-o eprubetă care
conţine 9 ml de soluţie diluare sterilă. Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie.

9ml 9ml 9ml 9ml

29