Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Universidad La Salle
investigaciones@lasalle.edu.co
ISSN (Versión impresa): 1657-6772
COLOMBIA
2006
Renata Grebechova / Lena Prieto Contreras
BIOSÍNTESIS DE LAS ENZIMAS PECTOLÍTICAS A PARTIR DE HONGOS
ASPERGILLUS NIGER Y ASPERGILLUS FOETIDUS PARA APLICACIÓN EN
INDUSTRIA DE ALIMENTOS
Revista de Investigación, julio-diciembre, año/vol. 6, número 002
Universidad La Salle
Bogotá, Colombia
pp. 153-162
http://redalyc.uaemex.mx
Revista de Investigación, ISSN 16576772. Vol. 6 (2): 153-162. Julio - diciembre 2006.
En esta investigación se evaluó la biosíntesis de las enzimas pectolíticas de las cepas de Aspergillus niger
y Aspergillus foetidus de la Colección Nacional de Rusia (Moscú) para aplicación en procesos alimentarios.
Se realizaron procesos de fermentación sumergida con 12 diferentes medios de cultivo orgánico sintético
a pequeña escala (erlemeyer de 250ml) y a 6 litros en un biorreactor New Brunswick. Los resultados se
obtuvieron con medios de cultivo que tenían pectinas de frutas (cítrica y manzana) y pectina de verduras
(zanahoria y remolacha). La actividad de la enzima endo-polimetilgalacturonasa (endo-PMG) fue 95,0-
99,0 unidades/ml. La actividad de la enzima pectin-esterasa (PE) fue baja (0,75–0,99 unidades/ml). La
enzima endo-polimetilgalacturonat-liasa (endo PMGL) no se encontró en ningún de los cultivos de las
dos cepas. Los siguientes parámetros se obtuvieron para la biosíntesis de las enzimas pectolíticas:
inóculo 1x106 conidias/ml, pH 4,5-5,5; temperatura 28oC-30oC y velocidad de aireación 180-200
revoluciones/minuto. Los sustratos cítricos, zanahoria y remolacha fueron excelentes para la producción
de PGM a partir de la biosíntesis con los hongos Aspergillus niger y Aspergillus foetidus.
1 Esta investigación es parte del Proyecto de Investigación: «Producción, purificación y caracterización de la enzima pectinasa
aislada de Aspergillus niger y Aspergillus foetidus«; financiado por la Universidad de La Salle.
Correspondencia: lprieto@lasalle.edu.co
Recibido: noviembre 23 de 2005.
Aceptado: febrero 11 de 2006.
153
Biosíntesis de enzimas pectolíticas a partir de A. niger y A. foetidus.Grebechova R. Prieto L.
154
Revista de Investigación, Vol. 6 (2): 149-. Julio - diciembre 2006.
de conidias en agua destilada con Tween-80 viscosímetro de vidrio CANNON, para líquidos
(0,01%) e incubados a 30ºC en agitador orbital opacos. La mezcla de reacción contiene 10 ml de
(HEILDOPH) a 180 rpm durante 96-120 horas, solución pectina al 2%, 2 ml buffer acetato pH 4,5
siguiendo a Grebechova y Prieto (2003). Las y 5 ml de medio de cultivo. Se incubó a 35oC por
fermentaciones se prepararon con los medios de 30 minutos, y luego, se inactivo la enzima en un
cultivo reportados por Gracheva y Crivova baño maría por 5 minutos, se dejó enfriar y se
(1982), Tuttobello y Mill (1961), Acuña et al. (1995), determinó el tiempo de caída de la solución en el
Gracheva y Crivova (1982), Channe y Shewale viscosímetro. El porcentaje de cambio de viscosidad
(1995), Lozano y López (2001), Lobanok y se calculó de acuerdo con la ecuación de Roboz
Pavlovskaia (1977) y Lobanok et al. (1976). El (Mill y Tuttobello 1961), con la siguiente ecuación:
mejor medio de cultivo se modificó y se trabajó
con 5 medios experimentales con pectina cítrica VO − V m
2%, salvado de trigo 1% y caseina 1%, al mejor CV % =
medio modificado se le varió el sustrato de VO − V S
pectina frutas o de pectina verduras.
donde, CV% es el cambio de viscosidad, Vo el
Diseño experimental para escoger los mejores tiempo de flujo del blanco de reactivos en
medios de cultivo. Se estructuró para evaluar los segundos, Vm el tiempo de flujo de la mezcla de
mejores medios de cultivo de las fermentaciones reacción, en segundos y Vs el tiempo de flujo del
inoculadas con las dos cepas de hongos Aspergillus blanco de enzimas, en segundos. La unidad de
empleadas, y así organizar los experimentos y activación enzimática (U- PMG) se definió como
análisis: mejor medio de cultivo de otros inves- la cantidad de enzima capaz de reducir en un 50%
tigadores para modificar sus componentes que la viscosidad bajo las condiciones del ensayo.
permita mayor producción de enzima endo-PMG,
mejor medio de cultivo modificado para la mayor Determinación de la activación de enzima pecti-
producción de enzima endo-PMG y mejor medio nesterasa (PE). Se empleó el método Gracheva
de cultivo modificado para hacerle modificaciones (Gracheva y Crivova 1982), el cual esta basado
de sustrato con frutas (manzana, mora, piña) y en la hidrólisis de una solución de pectina por la
verduras (remolacha, zanahoria) que favorezca enzima investigada, con la posterior determina-
la mayor producción de las enzimas pectolíticas ción cuantitativa de los grupos carboxilos, los
endo- PMG y PE. cuales se liberan al final de la hidrólisis. La
actividad de la pectinesterasa se caracteriza por
Determinación de biomasa. Al final del proceso la capacidad de formar alcohol metílico y los
de fermentación se separó el micelio de los grupos carboxilos libres. La unidad de actividad
hongos Aspergillus por filtración en papel filtro a de pectinesterasa (U-PE) se considera como la
partir del caldo de fermentación. También, se cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de
realizó la separación de biomasa, de algunas un microequivalente de los enlaces éter dentro
pruebas, con la centrifuga de la Planta Piloto de de la molécula de pectina en 1 minuto y a una
la Facultad de Ingeniería de Alimentos; esta temperatura de 30ºC, esta actividad de unidades
última operación de separación resultó rápida y de enzima se expresan en un gramo del preparado
eficiente. Después se llevó la biomasa a la estufa enzimático o en un mililitro del caldo crudo
de secado (MERMET) para retirar cualquier (Gracheva y Crivova 1982). La actividad de
humedad y así, determinar la cantidad de biomasa pectinesterasa se determina o se calcula según la
por peso seco. fórmula:
155
Biosíntesis de enzimas pectolíticas a partir de A. niger y A. foetidus.Grebechova R. Prieto L.
NaOH 0,1N miliequivalente, E son los ml de Tukey, la cual mide la diferencia significativa entre
NaOH 0,1N de la prueba de control, 100 es el las medias, para tomar una decisión de los
grado de eterificación de pectina como etanol, T mejores medios de cultivo de cada experimento
el tiempo de hidrólisis en 60 minutos, C el grado planteado anteriormente.
de eterificación de pectina cítrica en prueba (80%)
y M es la cantidad de enzima en ml o mg, (como
RESULTADOS
factor de dilución).
Activación y estabilización de las cepas productoras
Determinación de la actividad de la enzima
de enzimas pectolíticas. Las cepas de A. niger y de
polimetilgalacturonat-liasa (PMGL). Esta enzima
A. foetidus se activaron con el método de choque
se caracteriza por la capacidad de catalizar la
térmico y luego la incubación se observó que el
reacción del rompimiento de los enlaces α-1,4 de
hongo A. niger en agar Sabouraud presentaba una
la pectina. Después se obtienen los productos de
colonia blanca que se tornaba rápidamente negra,
reacción con los enlaces dobles entre los átomos
con producción de muchas conidias, las colonias
4 y 5 de carbono en la molécula del ácido galac-
eran polvorosas algodonosas. Microscópicamente
turónico. La unidad de actividad de PMGL
se observaron hifas tabicadas, conidioforos
(U-PMGL) es la cantidad de enzima que causa la
pigmentados largos de pared gruesa, vesículas
formación de los productos de la reacción que
globosas que daba lugar a métulas y fialides que
aumentan la densidad óptica de la muestra en 0,1
la cubrían completamente. La cepa del hongo A.
en una hora y con la temperatura de 40ºC. El
foetidus presentó en medio agar Sabouraud
método se basa en la determinación de concentra-
colonias blancas que iban pigmentándose con el
ción de los productos de descomposición de
crecimiento y envejecimiento del hongo a color
pectina utilizando la técnica de espectrofotome-
café. Las hifas eran tabicadas, un conidioforo
tría con longitud de onda de 235 nm. El cálculo de
pigmentado delgado, una vesícula globosa de
actividad de la enzima PMGL se hace según la
color amarillo oscuro con métulas y fialides que
siguiente fórmula:
lo cubrían hasta la mitad.
D P × 10 Efecto de la concentración del inóculo. Se
PMGL =
T × E × 0,1 realizaron tres repeticiones de cada una de las
fermentaciones. En la tabla 1 se presenta el
promedio de los resultados obtenidos. Estos
donde, PMGL es la actividad de enzima poli-
resultados son aceptables y se obtuvieron con
metilgalacturoat-liasa, Dp es la densidad óptica de la
concentraciones de conidias de cepas 1 x 106/ml.
muestra experimental, 10 es la dilución de la mezcla
Los hongos se desarrollaron en forma de pellet
de los reactivos, T el tiempo de reacción por una hora,
con lo cual mejoró la biosíntesis de las enzimas,
E la cantidad de enzima en ml o g y 0,1 el aumento
además para la A. niger transferencia de oxigeno
acordado de la densidad óptica en una hora.
y de nutrientes del medio.
Se trabajó un diseño experimental completamente
aleatorizado con diferentes números de repeti- Evaluación de medios de cultivo. Se prepararon
ciones, debido a que se experimentaba con varios siete medios de cultivo conocidos de otros
medios de cultivo. Se decidió evaluar solo una investigadores (Tabla 2), y después se realizó las
variable dependiente, la producción de enzima fermentaciones respectivas con las dos cepas de
pectolítica; y además, por costos se replicaron más hongos Aspergillus, con los parámetros: pH de 4,5;
veces los que permitían resultados favorables temperatura de 30oC y tiempo de fermentación
para el análisis. Después los resultados se de 96 horas; finalmente, se midió el contenido de
evaluaron estadísticamente por medio de análisis unidades de enzima pectolítica endo-PMG
de varianza de una sola vía (ANAVA) con 95% de formada. Los resultados se observan en la Tabla 2,
confiabilidad, en el programa Statistix versión 7,0 según el arreglo del diseño experimental aleatorizado
y se probaron sus resultados por la prueba de con desigual número de repeticiones.
156
Revista de Investigación, Vol. 6 (2): 149-. Julio - diciembre 2006.
Tabla 2. Unidades de PGM obtenidas con los diferentes medios de cultivo después de las fermentación
con cepa Aspergillus niger y Aspergillus foetidus.
157
Biosíntesis de enzimas pectolíticas a partir de A. niger y A. foetidus.Grebechova R. Prieto L.
Tabla 3. Unidades de PGM obtenidas con los medios de cultivo modificados en esta investigación
después de las fermentación con cepa Aspergillus niger y Aspergillus foetidus.
Tabla 4. Unidades de PGM y PE obtenidas con los medios de cultivo modificados a los cuales se les
adicionó sustratos (frutas y verduras) y cepas Aspergillus niger y Aspergillus foetidus.
158
Revista de Investigación, Vol. 6 (2): 149-. Julio - diciembre 2006.
Tabla 5. Efecto del pH para la biosíntesis de la enzima endo-PMG de cepas Aspergillus niger y Aspergillus
foetidus (medio de cultivo de Tuttobello, inoculo 1 x 106 conidias/ml, tiempo de fermentación
96 horas, temperatura 28°C).
Tabla 6. Efecto de la temperatura para la biosíntesis de la enzima endo-PMG de cepas Aspergillus niger
y Aspergillus foetidus (medio de cultivo de Tuttobello, inóculo 1 x 106 conidias/ml, pH 4,5,
tiempo de fermentación 96 horas).
Tabla 7. Efecto de la aeración para biosíntesis endo–PMG de cepas Aspergillus niger y Aspergillus foetidus
(medio de cultivo de Tuttobello, inóculo 1 x 106 conidias/ml, tiempo de fermentación 96 horas,
temperatura 30°C, pH 4,5).
159
Biosíntesis de enzimas pectolíticas a partir de A. niger y A. foetidus.Grebechova R. Prieto L.
En las fermentaciones realizadas con las cepas A. A la Universidad de La Salle por la financiación
niger y A. foetidus se observaron diferencias de la Investigación.
altamente significativas en los medios de cultivo. Al Decano de la Facultad de Ingeniería de
Alimentos, Dr. Camilo Rozo Bernal por su apoyo
En cuanto a la producción de enzima endo-PMG permanente.
con la prueba de Tukey se observaron diferencias A la Coordinadora Estrella Cárdenas del Departa-
significativas (α=0,05) entre los medios de mento de Investigaciones por la revisión de los
cultivo: Lobanok, Acuña y Blieva y la cepa A. niger textos.
160
Revista de Investigación, Vol. 6 (2): 149-. Julio - diciembre 2006.
A la Bacteriologa Luz Mary Figueroa por su apoyo por hongos del genero Aspergillus para aplicación
en la ejecución de la experimentación. en procesos alimentarios. Revista de investigación
A la Microbiologa Carolina Echeverry por la 3 (Supl.): 45-58.
asesoría permanente en la parte microbiológica. Lea AGH 1992. Enzymes in the production of
A las estudiantes de la Facultad de Ingeniería de beverages and fruit juices. In: Tucker GA and
Alimentos de la Universidad de La Salle: Heidy Woods LFJ (Editors). Enzymes in Food Processing.
Ruth Barrera Rojas y Sandra Maria Matiz Silvana Second Edition. Blackie Academic & Professional.
por su colaboración. Glasgow UK: 223-247.
Lobanok AG, Pavlovskaia ZI 1977. Constitutive
BIBLIOGRAFÍA synthesis of cellulase by Trichoderma lignorum
Mikrobiologiia 46 (3): 428-432.
Lobanok AG, Zinchekko ON, Romanov SL,
Acuña-Arguelles ME, Gutiérrez-Rojas M, Smetanin VV, Bogomazova LT 1976. Biogenesis
Viniegra-González G, Favela-Torres E 1995. of cellulolytic enzymes by Trichoderma ligorum
Production and properties of three pectinolytic on media with «inductor». Mikrobiologiia.
activities produced by Aspergillus niger in 45(4):620-624.
submerged and solid-sttate fermentation. Appl Lozano A, Lopez E 2001. Endo–poligalacturonasa
Microbiol Biotechnol 43: 808-814. y pectin-esterasa de Aspergillus niger. Revista
Barrios-Gonzáles J, Martinez C, Aguilera A, Colombiana de Biotecnología 3 (2): 85-91.
Raimbault M 1989. Germination of concentrated Martínez F, Martos A, Benassi F 2003. Aislamiento
suspensions of spores from Aspergillus niger. e identificación de cepas de Aspergillus produc-
Biotechnology Letters 11:551-554. tores de enzimas pectinas. La alimentación
Blandino A, Dravillas K, Cantero D, Pandiella S Latinéamericana 246: 40-44.
Webb C 2001. Utilisation of whole wheat flour Rubio M, Maldonado M, Aznar P, Navarro A 2003.
for the production of extracellular pectinases Producción y caracterizacion de un invertasa
by some fungal strains. Process Biochem 37: 497– extracelular de Penicillium glabrum. La alimen-
503. tación Latinoamericana 247: 45- 47.
Channe PS, Shewale YG 1995. Pectinase production Statistix 7 2000. Analytical software. Version 7.0,
by Sclerotium rolfsii: effect of culture conditions. Copyright ® USA.
J Folia Microbiology 40: 1-111. Taylor AJ, Leach RM 1992. Enzymes in the food
Gracheva J, Crivova A 1982. Tecnología de enzimas. industry. In: Enzymes in Food Processing. Second
Editorial Elevar, Moscu. 512 pp. Edition, Edited by GA Tucker and LFJ Woods.
Grebechova R 2003.Biotecnología de las enzimas Blackie Academic & Professional. Glasgow
microbianas extracelulares. Memorias de II UK: 26-39.
Congreso Internacional de Microbiología: 14-16. Tuttobello R, Mill PJ 1961.The pectic enzymes of
Grebechova R, Prieto-Contreras L 2003. Evaluación Aspergillus niger. 1. The production of active
de enzimas extracelulares á- amilasa y pectinasa mixtures of pectic enzymes. Biochem J 79 (1):
producidas por bacterias del genero Bacillus y 51–57.
161