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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE SANTIAGO PAPASQUIARO UNIDAD

EVALUACIÓN SENSORIAL TEMÁTICA I


PRÁCTICA No. 3 “AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO, HIDRÓLISIS Y DETERMINACIÓN DE
GLUCOSA”

PRÁCTICA No. 3 Aislamiento de glucógeno, hidrólisis y determinación de glucosa

Objetivos:

Utiliza las metodologías de bioquímica experimental para la extracción de glucógeno a partir de


tejido animal y realizar su determinación cualitativa.

Determinar la función e importancia del glucógeno.

Marco teórico:
El glucógeno es un polímero a través del cual los animales almacenan glucosa. El glucógeno puede
ser sintetizado o degradado en la mayoría de las células animales y solo dos tejidos lo contienen en
grandes cantidades: músculo e hígado. En el hígado puede ocupar hasta un 10% de su peso y en
músculo, un 1%. En situación de ayuno, el glucógeno es la primera reserva que se moviliza para
mantener la glucemia, al menos durante dos horas.

El glucógeno consta de cadena de glucosa unidas por enlaces glucosídicos a (1-4) y


ramificaciones, cada 8 o 10 unidades de glucosa, mediante enlaces glucosídicos a (1-6). Para
extraer glucógeno del hígado se debe realizar una homogeneización del tejido y ruptura celular,
seguido de una extracción y eliminación de las proteínas (desproteinizar) para evitar interferencias
en los análisis posteriores. Para la obtención de glucosa (análisis cualitativo) hay que someter al
precipitado de glucógeno a una hidrólisis ácida, de esta forma se rompen los enlaces glucosídicos y
se libera glucosa.

Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes


suaves como el ion Fe 3+ o Cu 2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo
libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo
carbonilo libre son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se
encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias
reacciones químicas que permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no.

La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reacción o no de un


azúcar con el ion Cu 2+, por lo que, la valoración cualitativa de la cantidad de glucosa presente en
cada hidrolizado se realizará mediante esta prueba aprovechando el carácter reductor que tienen
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todos los monosacáridos. La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo


evidencia la presencia de un azúcar reductor.

Normas específicas de seguridad para la práctica

Cuadro de detección de riesgos.


Reactivo o sustancia Tipo de peligro Como evitarlo Como proceder en caso
de accidente
Reactivo de Benedict* H319: Provoca irritación P280: Llevar guantes, P305+P351+P338: EN
ocular grave. prendas, gafas y CASO DE CONTACTO
H411: Tóxico para los máscara de protección. CON LOS OJOS: Aclarar
organismos acuáticos, P273: Impida que se cuidadosamente con
con efectos nocivos libere al medio ambiente. agua durante varios
duraderos. minutos. Quitar las
lentes de contacto, si
lleva y resulta fácil.
Seguir aclarando
Hidróxido de potasio Severo daño si es No comer, lavarse las No inducir al vómito.
ingerido, irritación severa manos después de su Beber abundante agua,
KOH al 30%**
en la piel, en contacto uso. lavar la boca con agua.
con los ojos puede P280: Llevar guantes, Lavarse al menos 15
causar dolor, prendas y gafas de min. con abundante
quemaduras protección. agua y jabón en caso de
posiblemente severas en contacto. Quitarse las
función del tiempo de ropas contaminadas.
contacto Lavar los ojos durante 15
min. con abundante
agua
Ácido Sulfúrico Severo daño si es No inducir al vómito,
ingerido, quemaduras beber abundante agua,
H2SO4 5N**
graves por contacto, lavar la boca con agua,
lesiones oculares no proceder a pruebas
graves, quemaduras de neutralización.
posiblemente severas en Lavarse al menos 15
función del tiempo de min. con abundante
contacto. agua y jabón en caso de
Corrosivo para los contacto. Quitarse las
metales. ropas contaminadas.
Lavar los ojos durante 15
min. con abundante
agua
Fenolftaleína al 1% *** Dañino si es ingerido, No comer, lavarse las Inducir al vómito.
puede causar irritación manos después de su Beber abundante
leve por contacto; uso. agua.
puede causar cáncer P280: Llevar guantes, Lavarse con

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dependiendo del nivel prendas y gafas de abundante agua en


y duración de la protección. caso de contacto.
exposición. Quitarse las ropas
contaminadas
Hidróxido de sodio Severo daño si es No comer, lavarse las No inducir al vómito.
ingerido, irritación severa manos después de su Beber abundante agua,
NaOH 5N
en la piel, en contacto uso. lavar la boca con agua.
con los ojos puede P280: Llevar guantes, Lavarse al menos 15
causar dolor, prendas y gafas de min. con abundante
quemaduras protección. agua y jabón en caso de
posiblemente severas en contacto. Quitarse las
función del tiempo de ropas contaminadas.
contacto Lavar los ojos durante 15
min. con abundante
agua
Nota: Esta práctica representa un bajo riesgo, no obstante es importante acatar el reglamento
vigente colocado a la entrada del laboratorio. Estos datos son proporcionados como guía, para
mayor información consulte la ficha de seguridad correspondiente. En casos graves buscar atención
médica inmediatamente.

• Consideraciones relativas a la eliminación:


* P501: Elimínense esta sustancia y su recipiente en un punto de recogida de eliminación residuos
especiales o peligrosos, conforme a la reglamentación local, regional, nacional y/o internacional.
** Neutralización o dilución y desecho por la tarja.
*** No disponible.

Materiales y Sustancias.

Tubos de ensayo de plástico. KOH al 30% Fenolftaleína (en etanol)


Tubos de vidrio graduados Na2SO4 15% Reactivo Benedict
Pipetas Alcohol etílico
Centrífuga de mesa H2SO4 5N
Potenciómetro NaOH 5N
Tubo de ensayo Hielo
Vaso de precipitado 600 mL Hígado

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Procedimiento Experimental.

a) Extracción del glucógeno de una muestra hepática fresca (ratón, pollo o res).

1. Pesar aproximadamente 4 g de hígado. En el caso de hígados de animales en ayuno, se cuidará


que el peso sea ligeramente superior a 4 g. Registrar el peso exacto de la muestra de hígado.

2. Introducir los fragmentos de hígado en dos tubos de ensayo (de 10 ml, de vidrio o de plástico
translúcido).

3. Añadir a cada tubo 3 ml de KOH al 30%.

4. Incubar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos con agitación ocasional, hasta
la completa digestión del tejido (que no queden partículas en suspensión). ¡¡ PRECAUCION:
ALCALI HIRVIENDO!!

5. Enfriar y centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para eliminar los restos de tejido no digerido.

6. Pasar cuidadosamente los sobrenadantes (con una pipeta o por decantación) a dos tubos de
vidrio graduado y previamente pesados, a los que se les añaden 0,2 ml de Na2SO4 al 15%, se agita
fuertemente y dejar reposar 5 min

7. Se precipita el glucógeno que está en solución por adición de 7 mL de etanol al 95%. Se agita y
deja en frío en un baño de hielo durante 5 minutos.

8. Dejar reposar en hielo durante un periodo de 5 a 10 minutos, para provocar la precipitación del
glucógeno extraído.

9. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para sedimentar el glucógeno.

10. Desechar con cuidado el sobrenadante y retener el precipitado o sedimento de color marrón-
blanco, que es el que contiene el glucógeno.

Nota.- La purificación completa del glucógeno implicaría tres o cuatro precipitaciones alcohólicas y
una precipitación ácida, pero en esta práctica haremos sólo una precipitación alcohólica.

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11. Secar cuidadosamente con papel filtro y pesar el precipitado de glucógeno de cada tubo. Anotar
el resultado.

b) Hidrólisis ácida del sedimento de glucógeno

1. Al sedimento de glucógeno obtenido en el tubo graduado, se le añade 1 ml de H 2SO4 5N para


proceder a su hidrólisis ácida y para ello se calienta la disolución cuidadosamente a 100°C durante
45 minutos. Como el ácido puede saltar en la ebullición, es conveniente poner en la parte superior
del tubo papel filtro enrollado, para que absorba el ácido si éste salta y evitar riesgos. Tener en
cuenta que en este tratamiento es donde se está obteniendo la glucosa que después se puede
valorar, por lo cual no conviene perder muestra.

2. Ajustar a 2 ml con agua destilada y añadir de 2 a 3 gotas de fenolftaleína como indicador para la
posterior neutralización.

3. Añadir gota a gota NaOH 5N y agitar bien hasta que se obtenga un pH 8 o superior. Se debe
comprobar el pH de la muestra con papel indicador o potenciómetro.

4. Anotar el volumen de la disolución, hidrolizado de glucógeno, puesto que es la disolución


problema donde se va a comprobar la presencia de glucosa proveniente del glucógeno extraído.

c) Medida cualitativa del contenido de glucosa

1. Se disponen de dos tubos de ensayo en los que se introduce 0,5 ml del hidrolizado de glucógeno
de cada muestra, deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict. Coloque los tubos en un baño de agua
hirviendo por 5 minutos. Tenga cuidado de no quemarse.

2. Observe cualquier cambio de color durante calentamiento. Saque el tubo y póngalo en una
gradilla y después de un corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser
rojo, anaranjado o verdoso. Observar y anotar lo que ocurre en cada tubo.

Resultados y discusión.

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Registra tus resultados en una tabla. Realizar la discusión luego del análisis de los
resultados en función de los objetivos particulares y del objetivo general de la práctica

Conclusiones.

Presentar las conclusiones a las que se llegaron.

Cuestionario (Explica ampliamente):

1. ¿Concuerdan sus resultados con lo esperado teóricamente sobre carbohidratos reductores?


2. ¿Qué otro reactivo se puede usar para análisis de azúcares reductores?
3. ¿Qué función biológica tiene el glucógeno hepático?
4. La enzima glucosa-6-fosfatasa se encuentra solo en el hígado, ¿Qué importancia tiene esta
enzima?
5. ¿Quedo demostrada la presencia del glucógeno en el hígado y se interpretó adecuadamente su
función biológica?

Anexos.

Incluir impresión o fotocopia de la rúbrica para la evaluación de la práctica y el diagrama de


flujo, a quién no la integre no se le tomará en cuenta la práctica.

Bibliografía.

 Harry R M., Richard A F., Roger L M. 1997. Biochemistry - A Short Course. John Wiley & Sons,
Chapter 12.
 Clark JM (1966): “Bioquímica Experimental”, 1ª ed. Editorial Acribia (Zaragoza, España), pp 42-
45.
 Nelson DL, Cox MM (2001): “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Editorial Omega (Barcelona,
España), pp 304-305.
 Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté (Barcelona,
España), pp 577-580.

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Rúbrica
TEMA: Función biológica de los carbohidratos
EVIDENCIA DE APRENDIZAJE No. 3: Reporte de Práctica (10% de la calificación final del curso)
El propósito de esta herramienta es orientar a los estudiantes sobre la función biológica de los carbohidratos para la comprensión de la utilización
y almacenamiento de energía a nivel celular.

Nombre del participante: ___________________________________________________________

Nombre de la persona que evalúa: ___________________________________________________

NIVELES DE DESEMPEÑO Y PUNTOS A ASIGNAR PUNTAJE


CRITERIO
OBTENIDO COMENTARIOS
DESEMPEÑO
EXCELENTE NOTABLE BUENO SUFICIENTE
INSUFICIENTE
Entrega a tiempo: El El documento se El documento no se
documento fue entregó dentro del entregó dentro del
entregado dentro del tiempo establecido. tiempo establecido o
tiempo establecido. no se entregó.

10 puntos 0 puntos
Estructura: Contiene
los elementos, hoja de Contiene todos los Contiene al menos 5 Contiene al menos Contiene al menos 3 Contiene menos de
presentación, elementos elementos 4 elementos. elementos 3 elementos,
resultados, discusión,
cuestionario,
conclusiones,
bibliografía.
20 puntos 15 puntos 10 puntos 5 puntos 0 puntos
Limpieza y orden: Esta Tiene limpieza y No tiene limpieza y
presentado sin orden orden
borrones,
enmendaduras,
manchas y en hojas de
igual tamaño y conforme
la secuencia establecida
15 puntos 0 puntos

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Cuestionario:
Tiene los dos Tiene más del 50% de los dos Tiene menos del 50% de los dos No tiene los dos
Responde las
requisitos requisitos, pero no está requisitos requisitos
cuestiones de una
completo o tiene errores
manera amplia y
correcta
15 puntos 10 puntos 5 puntos 0 puntos
Resultados y
discusión de los Argumenta Argumenta Argumenta Argumenta débilmente No contiene
resultados: presenta la plenamente, y claramente, y débilmente , y , y compara resultados o
información de acuerdo compara sus compara sus compara sus brevemente sus discusión de
a lo solicitado, resultados con los resultados con los resultados con los resultados
resultados con los
argumenta y compara existentes en la existentes en la existentes en la
bibliografía bibliografía existentes en la bibliografía
sus resultados con los
existentes en la bibliografía
bibliografía
15 puntos 12 puntos 8 puntos 4 puntos 0 puntos

Conclusiones: incluye Incluye las No contiene


conclusiones en las opiniones, ideas y conclusiones.
cuales expone su punto conclusiones
de vista personal, personales

15 puntos 0 puntos
Buena caligrafía:
Los reglones están Tiene buena No tiene buena
Tiene una caligrafía
alineados, se caligrafía caligrafía
aceptable
comprende lo escrito y
elaborado con bolígrafo

5 puntos
10 puntos 0 puntos

TOTAL 100 puntos

La rúbrica abarca 100 puntos de la actividad Reporte de práctica.


Para la calificación del curso se debe de multiplicar los puntos por 0.10

COMENTARIOS GENERALES