Encapsulación de enzimas en nanoesferas porosas de sílice: producción de

biodiesel

Científicos del Instituto de Tecnología Química, centro mixto de la Universidad

Politécnica de Valencia y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
junto con investigadores de la Universidad de Calabria (Italia), desarrollaron un
nuevo tipo de catalizadores híbridos orgánicos-inorgánicos a través de la
encapsulación de enzimas en el seno de nanoesferas huecas delimitadas por una
cubierta porosa de sílice. Según los investigadores, estos nuevos catalizadores,
pueden ser empleados como biocatalizadores para la producción de biodiesel de
manera más eficiente.

Una de las trabas de la producción de biodiesel es que la materia prima (aceites

vegetales) necesaria para el proceso de producción debe de ser de alta calidad
(bajo contenido en ácidos grasos libres, agua y triglicéridos insaturados).

La posibilidad de utilizar materias primas más baratas requiere catalizadores

alternativos en lugar de los básicos homogéneos (NaOH hidróxido de sodio, KOH
hidróxido de potasio y NaOCH3 metóxido de sodio ampliamente utilizados en la
producción industrial de biodiesel).

De hecho, la
transesterificación básica
homogénea muestra una
cinética de reacción muy
rápida pero, también, una
reacción de saponificación
colateral que reduce la
eficiencia en la producción
de biodiesel (bajo rendimiento de biodiesel y alto consumo de catalizador). Para
evitar estos inconvenientes, el aceite y el alcohol deben estar secos y el aceite debe
tener una cantidad mínima de ácidos grasos libres

La transesterificación esto es el proceso de intercambiar el grupo alcoxi de un

alcohol.

Saponificación: Transformación de un cuerpo graso en jabón.

En este enfoque, el proceso de transesterificación catalizado por enzimas es una

alternativa prometedora y atractiva. Las lipasas muestran varias ventajas en
comparación con los catalizadores base homogéneos, tales como alta actividad
catalítica para la reacción llevada a cabo en condiciones moderadas, capacidad
para procesar aceites vegetales que contienen alto grado de ácido graso libre y
agua, reduciendo la formación de jabones y emulsiones.
Recientemente, se han llevado a cabo varios estudios en la transesterificación
enzimática de aceites vegetales que han logrado la producción de una variedad de
ésteres y poliésteres biodegradables utilizando la lipasa como biocatalizador.

Transesterificación de triglicéridos del aceite de girasol, aceite de pescado y aceite

residual de restaurantes, en presencia de etanol y utilizando lipasa de Candida
Antarctica y Pseudomaonas cepacia.

Al igual, se han llevado a cabo estudios sobre la producción de ésteres mediante

transesterificación de aceites reciclados de restaurantes que usan lipasa de cepacia
como catalizador en una matriz sol-gel.

Como se demostró en todos los trabajos científicos antes mencionados, los

aspectos principales a destacar, en la preparación de biocatalizador heterogéneo,
son la actividad y la conservación de la estabilidad de la enzima inmovilizada.

En general, el medio en el que se inmoviliza la enzima es muy importante para

preservar su conformación natural y activa. Los liposomas son un medio interesante
en el que las enzimas pueden preservar su conformación natural y activa, porque
son vesículas lipídicas en las que un volumen microacuoso está encerrado por la
membrana lipídica bicapa.

2. Experimental

2.1. Materiales

Se prepararon nanoesferas orgánicas (liposoma + enzima) usando: l-a-

fosfatidilcolina (Sigma-Aldrich) como liposoma y PALATASE 20000L (Novo) como
enzima lipasa (RML). Para la preparación de la capa porosa de sílice alrededor de
las nanoesferas orgánicas se usó ortosilicato de tetraetilo (TEOS), como fuente de
sílice, y fluoruro de sodio, como agente mineralizante. Los reactivos utilizados para
la reacción de transesterificación fueron trioleína (60% en agua), metanol (99,9%) y
n-hexano (95%).
2.2. Síntesis de nanoesferas híbridas

La síntesis de nanoesferas híbridas se llevó a cabo adaptando un procedimiento a

la inmovilización enzimática y consiste en dos etapas operativas y subsecuentes:
preparación de enzimas encapsuladoras de nanosferas liposomales y formación de
una capa de sílice porosa inorgánica alrededor de las nanoesferas orgánicas.

Una cantidad específica de

Preparación de enzimas encapsuladoras de nanosferas liposomales

Lecitina se mezcló con cloroformo para disolverlo y crear una solución homogénea.
La solución se agitó hasta obtener una emulsión de color amarillo. La solución se
colocó luego en un evaporador rotatorio para eliminar el cloroformo. De este modo,
esta solución se mezcló con tampón de fosfato que contenía la enzima RML,
obteniendo finalmente nanoesferas homogéneas.

Formación de una capa de sílice porosa inorgánica alrededor de las

nanoesferas orgánicas

durante la segunda etapa, se formó un caparazón inorgánico externo (matriz porosa

silícica) alrededor de los liposomas, previamente sintetizados: se añadió una
cantidad específica de ortosilicato de tetraetilo y la suspensión formada se agitó a a
temperatura ambiente y luego la mezcla se centrifugó y el sólido recuperado se lavó
con agua destilada, se secó y se almacenó para preservar la funcionalidad de la
enzima hasta su uso catalítico.

La parte orgánica de esta nanoesfera cuenta con una lipasa aislada del
hongo Rizhomucor miehei como enzima. La nanoesfera está cubierta por una
cáscara porosa de sílice inorgánica que aísla, protege y estabiliza las moléculas
bioactivas del interior.
2.3. Prueba catalítica

Los ensayos catalíticos se llevaron a cabo a partir de la siguiente mezcla de

reacción: trioleína comercial como sustrato, biocatalizadores heterogéneos
preparados y metanol.

Después del tiempo de reacción controlado, los productos y reactivos se separaron

del catalizador y la glicerina por centrifugación para extraer todos los ésteres
metílicos producidos y los reactivos no convertidos.

3. Resultados y discusión

3.1. Resultados de inmovilización de lipasa

En la Tabla 1, se informan los resultados de la inmovilización de la enzima. Mediante

los resultados de inmovilización, es posible observar que, manteniendo la relación
entre liposoma y sílice igual a 1 (muestra LL1 y LL4), la eficacia de inmovilización
de la enzima conseguida es la más alta (93-95%). Cuando la relación liposoma:
sílice es más baja (muestra LL3) o más alta (muestra LL2) que la unidad, se obtiene
la menor eficiencia de inmovilización (89-90%).
3.2. Resultados de caracterización de biocatalizadores heterogéneos

La morfología de las nanoesferas

híbridas se observó mediante la
técnica HR-TEM (microscopia
electrónica de transimisión de alta
resolución). La Fig. 6, imagen de
TEM relacionada con la muestra de
LL1, muestra claramente la

presencia de ambas capas: la de los liposomas y

la de la sílice. Dentro de estas nanoesferas, el agua
y la lipasa deben estar atrapadas.

Mediante estos resultados, es posible observar,

también, que manteniendo la proporción entre sílice y liposoma igual a 1, las
nanoesferas parecen estar bien cubiertas por la capa de sílice. Este es el caso de
la muestra LL1 (figura 6) y de la muestra LL4 (figura 7).

Cuando la relación sílice: liposoma es 1: 2, la

cantidad de sílice no es suficiente para cubrir
todas las nanoesferas (muestra LL2). De hecho,
solo se forman unas pocas nanoesferas aisladas
y varias nanosferas no cubiertas son visibles
(Fig. 8).

Cuando la cantidad de sílice utilizada es dos

veces con respecto al liposoma se debe obtener
la morfología
más homogénea y regular de las nanoesferas,
probablemente asociado a este efecto al aumento
de espesor y densidad de microporos externos. De
hecho, las nanoesferas más densas se aprecian a
partir de micrografías TEM (ver Fig. 9, muestra
LL3).
3.3. Resultados de la reacción de transesterificación

También es necesario evaluar si la enzima inmovilizada en las muestras parece

catalíticamente activa o no. Este tipo de enzima, en su forma libre y soluble, tiene
una forma cerrada en la cual la tapa cubre el centro catalítico y, solo en presencia
de sustrato hidrofóbico, la tapa se mueve permitiendo la apertura del centro y la
conversión del sustrato.

Los resultados informados en la Fig. 11 muestran el diferente rendimiento catalítico

de las muestras preparadas que contienen la enzima lipasa, en comparación con la
lipasa libre, para el primer ciclo de reacción.

Después del segundo ciclo de reacción, las actividades de las muestras LL1 y LL4
disminuyen fuertemente (véase la Fig. 12).

El comportamiento diferente de los catalizadores puede depender de la

homogeneidad y la estabilidad de las nanoesferas producidas por diversas
relaciones de sílice / liposoma. Las muestras preparadas por la relación sílice /
liposoma igual a 1 muestran el mismo comportamiento y, después del segundo ciclo
de reacción, pierden la mayor parte de su actividad (muestras LL1 y LL4). La
muestra LL2, preparada con la relación más baja entre sílice y liposoma (0.5), no
muestra una actividad apreciable muy probablemente debido a la menor cobertura
del sistema debido a la cantidad reducida de sílice utilizada durante la síntesis.

La mejor muestra parece ser el catalizador LL3, preparado con la mayor cantidad
de sílice y obtenido con la mayor homogeneidad de las nanoesferas. Este
catalizador muestra un rendimiento catalítico excelente, cercano a los de la lipasa
libre. Esto sugiere que la enzima se ha inmovilizado en su forma activada y la capa
de sílice protege bien la fase orgánica, porque, con respecto a las otras muestras,
su actividad se conserva también después del segundo ciclo de reacción.

Esta última hipótesis es corroborada por los resultados obtenidos, para esta
muestra, después de varios ciclos de reacción. La Fig. 13 muestra el rendimiento
catalítico de la muestra de LL3 después de siete ciclos de reacción.

Este es un aspecto importante que corrobora la hipótesis según la cual la e fi ciencia

catalítica se debe también a la acción del caparazón silícico que cubre bien las
nanoesferas orgánicas (sistema lipasa / liposoma).
Estos resultados demuestran claramente que el aspecto más importante para un
procedimiento de inmovilización enzimática eficiente es la conformación final del
biocatalizador en lugar de la cantidad de enzima inmovilizada.

4. Conclusiones

Los liposomas que contienen enzimas son sistemas interesantes en los que el
biocatalizador se puede inmovilizar, conservando su conformación libre y estable,
debido al microambiente biocompatible dentro de la membrana del liposoma.

La estabilidad química de las nanoesferas orgánicas podría mejorarse mediante la

cobertura de sílice.

En el caso de la muestra LL3, se ha obtenido la morfología más homogénea y

regular de las nanoesferas preparadas (utilizando una cantidad doble de la sílice
con respecto a las otras muestras) y, por esta razón, esta muestra tiene una mayor
estabilidad química.

Después de 5 ciclos de reacción, la productividad total del mejor catalizador

obtenido es mayor que la de la enzima libre.