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1.

INTRODUCCIÓN
Los continuos y generalizados incrementos de la producción agrícola que se han
producido durante los últimas décadas, no han llegado a equilibrar la incesante demanda de
alimentos a nivel mundial. Por otra parte la presión sobre los sistemas agrícolas y forestales ha
generado graves problemas de contaminación debido al empleo de fertilizantes y pesticidas.
Las tendencias actuales de la investigación en este campo, se integran en tres aspectos
fundamentales:
- Mejora de la producción mediante biotecnología.
-Estudio de la dinámica de ciclos biogeoquímicos y sus implicaciones en la nutrición
vegetal.
- Estudio de la fisiología de las plantas para su aplicación en la mejora de la producción.
Las tres áreas de investigación se encuentran íntimamente relacionadas entre sí,
interaccionando de forma que el estudio de cualquiera de ellas obliga a considerar las restantes.
En la presente memoria se pretenden abordar aspectos fundamentales que inciden en la
productividad de una especie, Vicia villosa, con un considerable impacto económico en la
agricultura de determinados países. El estudio se realiza considerando la interacción de la
planta, con el sistema edáfico, separándonos de los sistemas de producción clásicos en los que el
factor productividad anulaba otras consideraciones vitales, como el mejor aprovechamiento de
los recursos edáficos con la mínima presión externa. El objetivo es reducir los efectos nocivos
de la producción sobre el ambiente, optimizándola y permitiendo una agricultura sostenible
basada en el conocimiento de la fisiología de las plantas y del sistema edáfico en que se
desarrollan.
1.1. El ciclo del nitrógeno

El nitrógeno, elemento muy abundante en el planeta, se encuentra formando rocas ígneas


(14x109 Tg), sedimentos y rocas sedimentarias (4x109 Tg), como nitrógeno atmosférico
(3.9x109 Tg), nitrógeno de biomasa oceánica (5x102 Tg) y nitrógeno de biomasa terrestre
(1.5x104 Tg). Sin embargo, a pesar de su abundancia, la biodisponibilidad es baja y los niveles
de nitrógeno en la biomasa total vienen a ser una milésima parte de las reservas orgánicas. La
causa de ello está en que la molécula de nitrógeno es inaccesible para la mayor parte de los seres
vivos por lo que no se puede utilizar como fuente de nitrógeno. Las consecuencias de la escasa
biodisponibilidad suelen ser muy negativas ya que el nitrógeno es un constituyente esencial de
las biomoléculas y junto con el agua y el fósforo es el factor principal que aumenta la

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producción primaria (Gutschick, 1981; Risser y Parton, 1982; Vitousek y Howarth, 1991;
Danso, 1995).
Las carencias de nitrógeno se suplen artificialmente mediante la administración de
fertilizantes químicos, con el consiguiente aumento en la contaminación de los acuíferos (NRC,
1989; Ollinger et al., 1993), eutrofización de las costas (Estavillo et al., 1996), y el incremento
en la producción de gases como N2O ( Anderson y Levine, 1987; Nevison et al., 1996 ).
La biomasa microbiana del suelo es un factor esencial para la descomposición de
residuos, ciclo del nitrógeno y flujo de energía (Jenkinson y Ladd, 1981)(2070). Esta biomasa
funciona como fuente y como sumidero de nutrientes en la mayoría de los ecosistemas
terrestres (Okano et al., 1989)(2070).
El ciclo del nitrógeno edáfico está controlado principalmente por bacterias, y su
actividad afecta la distribución de compuestos nitrogenados en el sistema. Las condiciones
ambientales que regulan la actividad de las bacterias determinan donde ocurre cada proceso, el
grado de intercambio entre las distintas formas de nitrógeno y las posibles interacciones físicas,
químicas y biológicas que pueden darse (Ward, 1996)(2534). Por tanto, el número de
interacciones que se pueden desarrollar es tal que, aunque existe mucha información bioquímica
sobre las reacciones bacterianas, no es suficiente para entender el control y para predecir los
procesos en distintos ambientes.
El ciclo del nitrógeno consiste en una serie de reducciones y oxidaciones sucesivas, que
conducen a la transformación del nitrógeno en formas accesibles al metabolismo de animales,
plantas y microorganismos. De esta manera el nitrógeno circula de forma cíclica a través del
suelo y de la atmósfera (Figura 1.1).

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NO N2 N 2O N2atmosférico Aporte de
Fijación seres vivos
Desnitrificación (libre, industrial o simbiótica)
Reducción
Pérdidas gaseosas asimilatoria
SERES VIVOS Y
MATERIA ORGANICA
EDÁFICA
-
Lixiviación NO3

Inmovilización Amonificación
Reducción
Nitrificación desasimilatoria Arcillas
Nítrica

+
NH4

NO2- NH 3

Volatilización
Nitrificación
Nitrosa
Pérdidas gaseosas

Figura 1.1. Representación esquemática del ciclo del nitrógeno.

El ciclo del nitrógeno ha sido objeto de especial atención por diversas razones, entre las
que podemos destacar:
- El incremento de nitrificación y desnitrificación puede ir acompañado, directa o
indirectamente, de un aumento de la producción de óxido nitroso y nítrico. El N2 es un producto
final más favorable ecológicamente hablando (Burns et al., 1996)(2200) y además es un
componente de la deposición ácida (Logan, 1983)(2194). El N2O es un gas con efecto
invernadero y además está implicado en la destrucción catalítica de la capa de ozono (Crutzen,
1981)(2624). Aunque su concentración absoluta es baja comparada con el CO2 , contribuye de
forma significativa al efecto invernadero, por su capacidad de absorción de IR y a que reside en
la atmósfera durante mucho tiempo. Desde la época preindustrial hasta nuestros días ha
aumentado un 5% la concentración de N2O atmosférico (Houghton et al., 1990)(2191) lo que
supone una concentración de N2O de 310 ppb y aumenta entre un 0.2 a un 0.3% al año (Papen y
Seiler, 1994)2619). Un aumento del 0.25% corresponde con una adición de 3.5 Tg de N2O/año
en la escala global (Benkise et al., 1996)(2619). El N2O es responsable de un 2 a un 3% del
calentamiento global del planeta (Watson et al., 1992)(2191) y puede contribuir hasta en un
10% en el futuro (Cicerone, 1989)(2191) y por otra parte doblar la concentración de este gas en
la atmósfera se estima que puede hacer disminuir la capa de ozono en un 10% (Mosier et al.,

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1996)(2191). Los suelos contribuyen con un 70% del total de emisiones de N2O antropogénicas
(Kroeze, 1993)(2624). Los procesos microbiológicos en los suelos son las fuentes más
importantes de N2O (Granli y B∅ck,man, 1994)(2194), razón por la cual se asume que los
cambios en el ciclo del nitrógeno a nivel edáfico han influido decisivamente en el aumento de
N2O en la atmósfera durante el pasado centenio y pueden ayudar a predecir futuros cambios
(Bowman, 1990)(2191).
- La desnitrificación es uno de los procesos causantes de la disminución de eficacia de
los fertilizantes químicos. Tiedje (1988) estima que entre el 52 y el 100% del nitrógeno fijado
vuelve a la atmósfera por procesos de desnitrificación. Bouwman (1990) calcula que en
ecosistemas naturales terrestres se emiten entre 9.7 y 12 Tg de nitrógeno al año y entre 2.3 y 3.7
Tg en suelos cultivados; si a esto unimos los datos anteriormente comentados, se comprende la
gran importancia de este proceso.
- Algunas formas de nitrógeno combinado afectan a la tasa de producción primaria, a la
descomposición de la materia orgánica y a las propiedades físicas, químicas y biológicas del
suelo (Cannon et al., 1984; Juma, 1993).
- El incremento o disminución de la concentración de nitratos asociado al proceso
nitrificante se propone como factor regulador de la dinámica de cationes en los ecosistemas
edáficos (Kölling y Prietzel, 1995).
- Las pérdidas de nitrógeno en forma de nitratos son, en muchas ocasiones, mayores que
las pérdidas de cualquier otro nutriente (Vitousek et al., 1989).
- La disponibilidad de nitrógeno para la nutrición vegetal es uno de los factores
determinantes de la riqueza en lignina en las paredes celulares, lo que condiciona los aportes de
compuestos fenólicos y de materia orgánica fácilmente degradable. Además los compuestos
fenólicos acidifican el sustrato, dificultando la movilización de nutrientes (Gosz, 1981).
- Efectos negativos de exceso de nitritos y nitratos sobre la salud humana (Prasad y
Power, 1995).
A continuación se comentan los aspectos más importantes de las distintas etapas del
ciclo del nitrógeno, así como algunos de los trabajos más sobresalientes al respecto.

1.1.1. Fijación biológica del nitrógeno (FBN)

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La FBN es la etapa reguladora del ciclo. Junto con la fotosíntesis, dicho proceso es clave
en la producción de los ecosistemas (Worthington, 1975). Sólo ciertos procariotas poseen el
aparato enzimático necesario para reducir el nitrógeno molecular, de estado de oxidación 0,
hasta amonio, estado de oxidación -3. Este amonio se incorpora a compuestos orgánicos
formando glutamina y otros compuestos nitrogenados (Schubert, 1986).
Las entradas de nitrógeno vía fijación biológica se estiman en 139-170 millones de t
N/año (Paul, 1988) de los cuales un 25-30% se deben a asociaciones simbióticas en suelo
cultivado, otro 30% a través de pastizales permanentes, y el resto se explica por otras
asociaciones o por fijación libre (Peoples et al., 1995). Estas entradas de nitrógeno en el
ecosistema compensan las pérdidas por desnitrificación (14.75 Tg N/año) (IPCC, 1994),
cosechas (830 kg N/ha) (Soon y Arshad, 1996), volatilización de amonio (13-23 Tg N/año),
lixiviación (30 Tg N/año) y erosión (2-20 Tg N/año) (Roswal y Paustian, 1984).
Este proceso requiere un gasto energético elevado. Los microorganismos implicados
pueden obtener los compuestos orgánicos necesarios para conseguir energía, directamente del
sustrato sobre el que se desarrollan (fijación libre), o bien colonizar raíces de ciertas plantas que
les suministran compuestos orgánicos (fotosintatos) que utilizan como fuente energética. De
esta forma se establece una relación simbiótica, ya que parte del nitrógeno fijado es asimilado
por la planta, que lo integra en su metabolismo (fijación simbiótica).
Las implicaciones de ambos sistemas de fijación de nitrógeno son decisivas en lo que se
refiere a su efecto sobre la producción primaria, sin embargo los mecanismos por los que el
nitrógeno fijado queda a disposición de las plantas son muy distintos, así como el rendimiento
energético del proceso y los factores que regulan el flujo de energía que se establece en cada
caso. Por esta razón pasamos a considerar los procesos por separado.

1.1.1.1. Fijación libre del nitrógeno (FLN)

Blackburn (1983) apunta a los microorganismos fijadores libres fotosintéticos como los
reductores más eficaces, sin embargo, como quiera que la energía solar incide escasamente
sobre la productividad del suelo, la mayoría de los fijadores libres, a nivel edáfico son
microorganismos heterótrofos (Evans y Burris, 1992) que se ven obligados a competir por su
sustrato con el resto de los microorganismos heterótrofos, y su actividad dependerá en gran
parte del éxito en la competencia por el sustrato (Hill, 1992)(libro).

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El grupo funcional de los fijadores libres de nitrógeno atmosférico está formado por
numerosos microorganismos, entre ellos podemos citar las cianofíceas (Haselkorn y Buikema,
1992); bacterias aerobias y microaerobias heterótrofas, como Azotobacter spp. y Azospirillum
spp. respectivamente (Evans y Burris, 1992) o Beijerinkia spp. y Derxia spp. (Boddey y
Dobereiner, 1995); bacterias quimioautótrofas, incluyendo aquellas que oxidan metano (Dalton
y Chatfield, 1985) y azufre (Mackintosh, 1978) y las que utilizan H2 como fuente de energía
para el crecimiento autótrofo (Berndt et al., 1976); bacterias anaerobias facultativas como las
del género Klebsiella y Enterobacter, que requieren compuestos nitrogenados para crecer bajo
condiciones aerobias pero fijan nitrógeno en anaerobiosis (Aho et al., 1976); bacterias
pertenecientes a los géneros Bacillus (Line y Loutit, 1971) y Pseudomonas, que son
probablemente los géneros más abundantes en la rizosfera (Acero et al., 1994; Puente y Bashan,
1994); y por último, bacterias anaerobias estrictas, siendo el género Clostridium el más
importante (Rosenblum y Wilson, 1948; Flather y Beauchamp, 1992)(2624).
En ecosistemas terrestres, las cianobacterias fijan cerca de 30 kg N ha-1 año-1 en
pastizales, mientras que en los sistemas agrícolas sólo fija entre 3 y 5 kg N ha-1 año-1.
Azotobacter spp. fija entorno a 1 kg N ha-1 año-1 en estado libre, mientras que asociado a
gramíneas fija 20 kg N ha-1 año-1 (Paul y Clark, 1989)(2518).
Una asociación de gran interés, que no se puede considerar exactamente como
simbiosis, es la formada por la bacteria fijadora de nitrógeno Azospirillum, que prolifera sobre
raíces de maíz, trigo, cebada, avena y otros cereales, constituyendo una rizocenosis no nodulante
que conduce a un aumento del número de espigas y de biomasa vegetal (Bashan y Levanony,
1990; Zaady et al., 1994).

1.1.1.1.a. Factores que afectan a la fijación libre de nitrógeno y microorganismos


implicados en el proceso

Los diazotrofos libres, están marcadamente afectados por las propiedades y


requerimientos del complejo nitrogenasa. El oxígeno es uno de los factores que más afecta al
proceso, dada la sensibilidad de la nitrogenasa a este gas (Drevon et al., 1988; Hunt y Layzell,
1993). Las condiciones microaerófilas son óptimas para el crecimiento de estas bacterias es la
microaerofilia, ya que en estos hábitats las bacterias tienen el oxigeno necesario para su
respiración, pero la nitrogenasa no se encuentra inhibida (Hill, 1992)(Libro)

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La presencia en el suelo de nitrógeno inorgánico inhibe la actividad de las bacterias
fijadoras de nitrógeno (Kitoh y Shiomi, 1991; Roper et al., 1994)(2518). Por el contrario, las
condiciones inducen la inmovilización del nitrógeno estimulan la actividad nitrogenasa en el
suelo (Roper et al., 1994)(2518). Rao (1976) y Sawicka (1982, 1983) (368), indican que la
adición de pequeñas cantidades de nitrógeno junto con carbono orgánico incrementan la FLN de
estos suelos.
Las bacterias diazotrofas libres están estimuladas y su actividad nitrogenasa aumenta en
presencia de altos niveles de materia orgánica en el suelo. La rizosfera es una zona con elevada
concentración de compuestos orgánicos fácilmente degradables debido a la exudación radical,
razón por la cual las bacterias fijadoras libres encuentran en la rizosfera un lugar muy apropiado
para fijar nitrógeno (Glick, 1995)(1141). Distintas plantas creciendo en el mismo suelo y bajo
las mismas condiciones climáticas poseen distintas tasas de fijación en su rizosfera (Sawicka,
1983)(368). Estas diferencias se deben a la composición específica de los exudados de cada
planta (Rovira, 1956)(368). La adición de compuestos no nitrogenados exudados por las raíces,
confiere a las bacterias diazotrofas ventajas competitivas sobre el resto de los heterótrofos de la
rizosfera, así como la liberación de diversas vitaminas, como tiamina, que aumenta de forma
considerable el número de bacterias diazotrofas en la rizosfera (Azaizeh et al., 1995)(2254).
Dado el efecto de la naturaleza y cantidad de carbono orgánico disponible sobre la FLN
(Alexander y Zuberer, 1989)(2518), cierto tipo de manejo, como el aporte de restos vegetales de
leguminosas al suelo aumenta los niveles de fijación al proporcionar niveles más altos de
carbono lábil a las bacterias fijadoras (Wander et al., 1994)(2518).
Esta etapa del ciclo es especialmente sensible a la presencia de metales pesados en el
suelo, por lo que se han propuesto como indicadores biológicos de la toxicidad de estos
elementos (Lorenz et al., 1992)(567). Sin embargo, las bacterias fijadoras heterótrofas y
anaerobias, en presencia de metales pesados, son capaces de fijar en un amplio rango de
condiciones de alcalinidad y acidez del suelo (Paul y Clark, 1989)(567), y además su actividad
nitrogenasa es normalmente mayor que la de aquellas que crecen en condiciones aerobias
(Jones, 1977)(567).
Otros factores que afectan considerablemente al proceso son: pH (DeLuca et al.,
1996)(2518); fósforo (Grant y Binkley, 1987; Kay y Virginia, 1989; Smith, 1992; Crews, 1993),
tipo de suelo (Azaizeh et al., 1995b)(2254), temperatura (Stewart, 1974; Granhall, 1981; Lynch
y Smith, 1993) y el estrés hídrico (Venkateswarlu, 1990).
1.1.1.2. Fijación simbiótica del nitrógeno (FSN)

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La fijación simbiótica de nitrógeno tiene un papel muy importante sobre la producción
primaria ya que supone la entrada de nitrógeno más importante en los ecosistemas terrestres
(Tamm, 1991). Por tanto, este proceso resulta fundamental en la nutrición y crecimiento de las
plantas (Michiels y Vanderleyden, 1994).
Bumb (1994) indica que la mejora de la fijación simbiótica reduciría en esta década el
uso de fertilizantes nitrogenados en 80-90 millones de t de N, por lo que actualmente se está
realizando un esfuerzo para intentar aumentar la eficiencia fijadora (Hardarson, 1993),
profundizando en el estudio de métodos agronómicos, microbiológicos y biotecnológicos. El
análisis es complejo ya que la fijación de nitrógeno no está regulada sólo por la demanda de
nitrógeno de una planta individual, también, de forma indirecta por la demanda del ecosistema
como un todo (Hartwing et al., 1996)(2450).
Las relaciones simbióticas más estudiadas corresponden a Rhizobium y Bradyrhizobium
con las fabáceas, y al actinomiceto Frankia con angiospermas no leguminosas. Algunas
cianofíceas también establecen simbiosis, si bien lo hacen con pteridofitos del género Azolla,
pudiendo fijar entre 70-110 kg de nitrógeno por hectárea y año (Ventura y Wantanbe, 1993). Así
mismo, las cianobacterias del género Nostoc, establecen simbiosis con una herbácea tropical del
género Gunnera (Rasmussen, 1996)(2304).
Aproximadamente 194 especies de plantas se han descrito como actinorrizas no
leguminosas y están englobadas dentro de ocho familias y cuatro subclases de plantas
angiospermas (Cronquist, 1981)(2592). Estas plantas tienen tendencia a crecer en suelos
marginales y juegan un papel importante como pioneras en las primeras etapas de sucesión.
Aparecen en muy diversos hábitats como la tundra (Dryas), bosques (Alnus, Comptonia,
Coriaria y Sheperdia), dunas (Casuarina, Hipophaë, Myrica y Elaeagnus) bosques riparios
(Alnus, Myrica y Datisca) y chaparrales (Ceanothus, Comptonia, Cerocarpus, Cowania y
Purshia). La cantidad de nitrógeno fijado por las plantas actinorrizas es similar al fijado por las
leguminosas (40-350 kg N ha-1 año-1)(Torrey, 1978), y algunas especies pueden devolver
al ecosistema hasta un 70% de este nitrógeno (Schwintzer, 1984)(2592). Además de su
importancia como pioneras, son importantes como fuentes de biomasa y sirven de plantas
nodrizas para otras especies de interés económico.
Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium son capaces de nodular únicamente plantas
leguminosas. Dentro de las leguminosas podemos distinguir tres subfamilias, Mimosoideae,
Papilionoideae y Caesalpinoideae. Un 90% de las dos primeras familias entran en simbiosis

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con rizobios del suelo formando nódulos tanto radicales, como en algún caso caulinares, sin
embargo, sólo unos pocos miembros de la familia Caesalpinoideae son capaces de establecer
este tipo de relación (Doyle, 1994).(993)
La diversidad taxonómica de familias dentro de las plantas actinorrizas, en comparación
con las leguminosas, hace pensar que la simbiosis actinorrízica se originó repetidamente en la
evolución de las angiospermas (Mullin, Swensen y Goetting-Minesky, 1990; Baker y Mullin,
1992; Swense, 1996).
Desde un punto de vista agronómico, la fijación de nitrógeno mediante la simbiosis
rizobio-leguminosa tiene gran importancia ya que su rendimiento se estima entre 41-51 millones
de t N/año (Paul, 1988). La fijación se lleva a cabo por los rizobios en estructuras de morfología
definida, denominadas nódulos, que se desarrollan en las raíces (Bergersen, 1982) o en los
tallos (Loureiro et al., 1995) de plantas leguminosas.
Por las razones expuestas, los procesos de simbiosis entre fabáceas y
Rhizobium/Bradyrhizobium y entre otras angiospermas no leguminosas y Frankia resultan de
gran importancia en agricultura y silvicultura, respectivamente. La asociación de vegetales
nodulados con otros revierte en una mejor nutrición nitrogenada de estos últimos (Cochran y
Schlentner, 1995). Haynes et al. (1979) encontraron en plantaciones de Platanus occidentalis
que si se incorporaba una vegetación acompañante de leguminosas herbáceas, aumentaba
considerablemente el volumen, diámetro e índice volumétrico de las plantas con respecto al
control. Pero también se ha visto que las leguminosas herbáceas fijadoras de nitrógeno, tienen
una gran importancia en sistemas agrícolas cuando se utilizan en programas de rotación de
cultivos, ya que aumentan significativamente la producción de cereal, principalmente trigo y
cebada (King, 1984; Reeves et al., 1984; Rowland et al., 1986; Doyle et al., 1988). Reynolds et
al. (1994) observan en cultivos mixtos de leguminosas con trigo o cebada, en suelos pobres en
nitrógeno, un aumento en la cantidad de proteínas en el grano, hecho que relacionan con un
mejor transporte del nitrógeno en presencia de las leguminosas.
Los rizobios son bacterias Gram negativas que pertenecen a la familia Rhizobiaceae.
Actualmente se engloban en tres géneros, Rhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium
constituidos por los rizobios de rápido crecimiento clásicos (2-4 horas de tiempo de generación)
y Bradyrhizobium de lento crecimiento con un tiempo de generación de 8 horas o más.
Los rizobios presentes en el suelo interaccionan con las raíces de distintas leguminosas,
induciendo la formación de nódulos, estructuras en los que se produce la fijación del nitrógeno.
El desarrollo del nódulo y la fijación de nitrógeno es un proceso complejo que requiere señales

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entre los rizobios y las células de la planta. Los polisacáridos superficiales de los rizobios,
particularmente exopolisacáridos y lipopolisacáridos, parecen estar implicados en el
establecimiento de la simbiosis con distintas leguminosas (Gray y Rolfe, 1990; Leigh y Coplin,
1992). Los lipopolisacáridos, no sólo se necesitan a distintos tiempos durante el desarrollo del
nódulo, también están encargados de proteger al rizobio por supresión de los mecanismos de
defensa de la planta (Noel, 1992)(2176). El papel de estos polisacáridos en la infección y
desarrollo del nódulo depende de que el nódulo sea determinado o indeterminado (Ko y Gayda,
1990; Parniske et al., 1993, 1994)(2154). Los exopolisacáridos tienen mayor importancia en la
formación de los nódulos indeterminados, mientras que los lipopolisacáridos en los
determinados (Eggleston et al., 1996)(2154).
Los mecanismos de reconocimiento célula-célula vienen determinados en un primer
momento por una proteína calcio dependiente muy común en las rizobiaceas, que permite a las
bacterias ligarse a la raíz (Smit et al., 1992)(2130). En una segunda etapa, que depende de las
condiciones de crecimiento, las lectinas de la planta suponen puntos de anclaje para las bacterias
(Wsniewski y Delmotte, 1996)(2130). Además, parece ser que las lectinas inducen la capacidad
de nodulación de Rhizobium (Halverson y Stacey, 1986)(2130).
Los flavonoides presentes en los exudados radicales, también juegan un papel
importante en los procesos de nodulación. Estos compuestos fenólicos atraen a los rizobios e
inducen genes de nodulación (Dharmatilake y Bauer, 1992)(2130). Además estos compuestos
pueden modificar el metabolismo bacteriano provocando un aumento en la síntesis de
exopolisacáridos (Hartwing et al., 1991; Dunn et al., 1992). Así mismo, otros productos
presentes en los exudados radicales como isoflavonoides y sacáridos, estimulan a las bacterias
para iniciar la nodulación (Wisniewski y Delmotte, 1996)(2130).
Existen una serie de genes, tanto de la planta (Nif y Fix) como de la bacteria (Nod) que
codifican para proteínas necesarias para el desarrollo del nódulo y para el proceso posterior de
fijación de N. Los genes Nif y Fix se activan durante la formación del nódulo y que dan lugar a
proteínas denominadas nodulinas (Sanchez et al., 1991)(2118). Entre estas nodulinas podemos
destacar: leghemoglobina (Brisson y Verma, 1982), una glutamina sintetasa específica del
nódulo (Cullimore et al., 1984) y polipéptidos ricos en lisina que se expresan en los primeros
estadíos del desarrollo del nódulo (Franssen et al., 1987; Scheres et al., 1990)(2118). Los genes
Nod codifican para los factores Nod que llevan a cabo cambios morfológicos en la raíz de la
planta huesped como deformaciones de los pelos radicales (Lerouge et al., 1990), formación del
canal de infección (van Brussel et al., 1992) y formación del primordio nodular (Spaink et al.,

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1991; Truchet et al., 1991)(sep Javier). Además los factores Nod inducen alteraciones en la
composición de flavonoides de los exudados radicales que provocan una activación de los genes
inductores de los Nod (van Brussel et al., 1990)(sep Javier). Entre los factores Nod podemos
citar: quitina y celulosa sintasas, acetiltransferasas y ATP sulfurilasa.

1.1.1.2.a. Factores que afectan a la fijación simbiótica de nitrógeno y microorganismos


implicados en el proceso

La fijación simbiótica de nitrógeno (FSN) se ve afectada por un amplio espectro de


factores bióticos y abióticos. La mejora del proceso controlando los factores que a continuación
se mencionan puede constituir una de las principales vías de investigación en este campo.
Entre los factores bióticos los más relevantes son: el tipo de inóculo y la vía de
inoculación (Brockwell et al., 1988), la elección de cultivares apropiados que influye
decisivamente sobre las entradas de nitrógeno en sistemas agrícolas (Wani et al., 1995), el
control de las pestes y enfermedades que afectan al vigor de la planta y a su potencial de
crecimiento ( Johnstone y Barbetti, 1987; Sinclair, 1994).
En cuanto a los factores abióticos, son muchos los que inciden sobre el proceso, factores
que además suelen interaccionar entre sí. Uno de los más estudiados es la concentración de
nitrato, ya que es una de las formas de nitrógeno más utilizada como fertilizante y actúa como
un potente inhibidor de la FSN (Streeter, 1988). Por otra parte los niveles de nitrato en el suelo
intreraccionan con la concentración de oxígeno en el mismo (Arrese-Igor et al., 1993(656); de
Lorenzo et al., 1994), este último factor afecta al funcionamiento de la nitrogenasa nodular
(Ianneta et al., 1995). Se han observado cambios de la resistencia a la difusión de oxígeno en el
cortex nodular implicados en el descenso de la FSN en presencia de altas concentraciones de
nitrato (Vessey y Waterer, 1992)(2461) así como una regulación por retroalimentación basada
en el estatus de nitrógeno mediado por los aminoácidos que fluyen por el floema y que actúan
en el nódulo (Parsons et al., 1993)(2461). Sin embargo, concentraciones bajas de nitrato
estimulan la FSN, particularmente, durante la época de crecimiento de la planta (Allos y
Bartholomew, 1959; Ingestad, 1980; Rigaud, 1981; Macduff et al., 1989)(2185). Durante esta
época, un pequeño suplemento de nitrato, aumentaría la actividad fotosintética de la planta y el
aporte de carbohidratos al nódulo, lo que favorece su desarrollo y actividad. Sin embargo, los
niveles no deben ser lo suficientemente elevados (< 2 mol m-3) como para provocar altos niveles

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de nitrógeno en el floema (Macduff et al., 1996)(2185) que dispararía el mecanismo de
retroalimentación propuesto por Parsons (1993) y que ya hemos mencionado.
El NH4+ inhibe la FSN de forma indirecta por un incremento en la concentración
citoplasmática de amonio o de aminoácidos derivados de la asimilación de amonio por parte de
las raíces, lo que puede llegar a exceder temporalmente la capacidad constitutiva de las rutas
asimilatorias de las raíces (Svenning y Macduff, 1996)(2461). Por otro lado, el amonio, puede
regular la nodulación reprimiendo los genes Nod (Dusha et al., 1989; Kondorosi et al., 1989).
El fósforo, es uno de los factores limitantes de la producción vegetal en muchos
ecosistemas (Andrew y Robins, 1969)(2668). La FSN depende de la energía que le
proporcionan los fotosintatos traslocados a las raíces (Graham, 1984)(2393), el fósforo es
esencial en la formación de fotosintatos y en su traslocación, por lo tanto es un factor esencial
(Soliman et al., 1996)(2393). Las leguminosas están especialmente afectadas por este factor, ya
que necesitan más fósforo que otras plantas no simbióticas (Israël, 1987)(2668). En leguminosas
noduladas un 20% del fósforo total de la planta se localiza en los nódulos (Adu-Gyamfi et al.,
1989; Gunawardena et al., 1992)(2668). Además, la masa nodular desciende drásticamente en
condiciones de deficiencia de este nutriente (O´Hara et al., 1988; Gunawardena et al.,
1992)(2668)(Ribet y Drevon, 1995a). Sin embargo, Ribet y Drevon (1995a)(2668) observan un
aumento en la permeabilidad del cortex nodular al oxígeno. Vadez et al. (1996) encuentran los
mismos resultados y proponen algún tipo de relación entre la tolerancia a bajas concentraciones
de fósforo frente a la FSN mediante una regulación de la permeabilidad nodular.
El hierro es uno de los nutrientes necesario para la iniciación de la nodulación,
desarrollo de la bacteria en el nódulo, producción de leghemoglobina y de nitrogenasa (Barton
et al., 1994)(2503). Por este motivo, se propone que la producción de sideróforos por parte del
simbionte puede ser importante para el metabolismo del nódulo, sobre todo bajo condiciones de
limitación de hierro. Ciertos rizobios producen sideróforos como carboxilatos, fenolatos, catecol
e hidroxamato (Barran y Bromfield, 1993)(2503). Persmark et al. (1993)(2503) caracterizan la
rizobactina, un sideróforo específico de Rhizobium meliloti, que aumenta la FSN en plantas
noduladas que crecen bajo condiciones deficientes de hierro (Gill et al., 1991; Barton et al.,
1992)(2503). Tanto la ausencia como la producción continuada de sideróforos afecta
negativamente a la FSN (Barton et al., 1996)(2503). La producción continuada resulta tóxica
para la bacteria en el nódulo. Sin embargo, una producción adecuada estimula el crecimiento de
la planta y regula la fijación de nitrógeno en condiciones de deficiencia de hierro (Gill et al.,
1991; Barton et al., 1992)(2503).

13
El tipo de manejo afecta a este proceso, Herridge y Bergarser (1988)(2586) observan
diferencias en la fijación de nitrógeno según el tipo de práctica agrícola, y Horn et al.(1996)
observan que el momento de la siembra afecta, obteniendo mayores tasas de fijación sembrando
prematuramente. Sin embargo, estos últimos autores aclaran, que el momento de siembra debe
ser elegido según el tipo de planta, la humedad del suelo, y momentos, en que los niveles de
nitratos sean bajos para mejorar así, la producción y el rendimiento de la fijación de nitrógeno.
Goh et al. (1996)(2634) observan una variación estacional en la fijación simbiótica de
nitrógeno que explican, al menos en parte por variaciones en la temperatura. Las temperaturas
más bajas del invierno, afectan al metabolismo de la planta (Lie, 1981), a la formación de raíces
(Rohini-Kumarashinghe et al., 1979), al crecimiento del rizobio, a su capacidad de infección y a
la formación del nódulo (Roughley y Dart, 1970)(2634), lo que reduce las tasas de fijación
durante estos meses. Así mismo, temperaturas por debajo de 5-10°C limitan la fijación de forma
indirecta impidiendo el crecimiento de los pelos radicales y de forma directa al disminuir la
demanda de nitrógeno por la planta (Svenning y Macduff, 1996)(2461). La temperatura de la
zona radical parece afectar al balance entre la cantidad de nitrógeno mineral absorbido por las
raíces y la fijación de nitrógeno por parte de los nódulos (Svenning y Macduff, 1996)(2461). Por
otro lado la temperatura afecta de forma indirecta al proceso, puesto que es responsable, en
parte, de los niveles de humedad en el suelo (Yunusa et al., 1995 a)(2634), aspecto en el que se
incide a continuación.
La humedad del suelo es un factor de incidencia crítica sobre el proceso (Weisz et al.,
1985)(2282). La FSN es incluso más sensible a la humedad del suelo que otros parámetros
fisiológicos como la fotosíntesis (Durand et al., 1987)(2282), transpiración (Sall y Sinclair,
1991)(2282) o la asimilación de nitratos (Obaton et al., 1982)(2282). Pankhurst y Sprent
(1975)(2282) proponen que el principal efecto de la sequía sobre la actividad nodular es un
descenso de la permeabilidad a la difusión del oxígeno en el nódulo. Así mismo, la sequía
produce alteraciones en el metabolismo del nitrógeno. Los uréidos deben estar directamente
implicados en la regulación de la permeabilidad del nódulo al oxígeno (Streeter, 1992; Purcell y
Sinclair, 1994). Serraj y Sinclair (1996)(2282) proponen que la síntesis y transporte de uréidos
está íntimamente ligada a la disminución de la fijación de nitrógeno durante la sequía. Como
consecuencia del estrés hídrico: baja la demanda de nitrógeno por parte de las raíces y se limita
el agua disponible para el nódulo; baja el transporte de solutos nitrogenados, incluidos los
uréidos; se acumulan los productos de la fijación de nitrógeno en el nódulo y se inhibe la
actividad nitrogenasa en los bacteroides. Así mismo, altos niveles de agua en el suelo resultan

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también negativos para este proceso (Serraj y Sinclair, 1996)(2282). El óptimo parece
encontrarse en una humedad edáfica entorno a la capacidad de campo (Castellanos et al.,
1996)(2081).
La competencia por la luz puede darse en algunas ocasiones, como en cultivos mixtos, y
ser un factor limitante de la FSN. Este hecho se debe a una disminución de la fotosíntesis en la
planta y por lo tanto una menor disponibilidad de fotosintatos para la formación del nódulo y
para el proceso de fijación en los mismos (Wahua y Miller, 1978)(2571).
Por otra parte la concentración de protones en el medio está ligada a la concentración de
cationes como Al3+, Mn2+, Ca2+ y Mo2+. Cuando baja el pH se movilizan Al3+ y Mn2+ que
resultan tóxicos para muchos poblaciones microbianas (Coventry et al., 1985; Richardson et al.,
1988; Evans et al., 1990)(2202). Además el Al3+ y la concentración elevada de H+ inhiben
específicamente el crecimiento radical y la formación del nódulo (Munns, 1968; Whelan y
Alexander, 1986; Blamey et al., 1993; Brady et al., 1994)(2202). En cuanto al Ca2+ y Mo2+, su
disponibilidad evoluciona de forma inversa a la concentración de protones (Unkovich et al.,
1996)(2202). La carencia de Ca2+ en el medio inhibe la formación de pelos radicales (Loneragan
y Dowling, 1958; Evans et al., 1988; Flis et al., 1993)(2202), lo que influye decisivamente en el
proceso de infección. Además dado que el anclaje de los rizobios a la raíz está mediado por una
proteína dependiente de calcio, la nodulación resulta fuertemente inhibida. Por otro lado, al
bajar el pH también descienden las concentraciones de molibdeno, lo cual revierte en una
supresión de la actividad nitrogenasa de los nódulos ya existentes (Coventry et al., 1985)(2202).
El oxígeno es necesario para mantener la respiración bacteriana, ya que los rizobios son
aerobios estrictos, sin embargo el oxígeno inhibe la nitrogenasa, razón por la cual, los niveles en
el interior del nódulo son bajos, oscilando entre 3 y 25 nM, concentración determinada por la
permeabilidad del cortex al O2 (Hunt y Layzell, 1993; Serraj et al., 1995). En estas condiciones
para proveerse del oxígeno necesario para la respiración, la bacteria utiliza la leghemoglobina,
una proteína que transporta O2, directamente a los bacteroides pero no deja oxígeno libre que
inhibiría la nitrogenasa (Appleby, 1984)(2092). La síntesis de ATP en el nódulo a bajas
concentraciones de oxígeno requiere una alta afinidad por parte de las oxidasas (Appleby,
1984)(2668) y por la mitocondria (Millar et al., 1995)(2668). Al exponer los nódulos a altas
concentraciones de oxígeno, se ha observado, que en un primer momento, su actividad
nitrogenasa aumenta, así como la respiración (King y Layzell, 1991; Roy, 1993)(2668). Sin
embargo, con el tiempo la nitrogenasa queda inhibida, existiendo dos hipótesis para explicar
este hecho. Por un lado Hunt et al. (1984)(2373), opinan que al someter al nódulo a altas

15
presiones de oxígeno, se producen alteraciones en la barrera de difusión de este gas en el cortex
nodular. Sin embargo, Zeng y Tjepkema (1996)(2373) observan que existe un retraso en la
respuesta de la respiración nodular al aumento de las presiones de oxígeno en el exterior, y
como consecuencia aumenta la concentración de este gas en el interior del nódulo. Este aumento
interno, inhibe a la nitrogenasa, hasta que la respiración aumenta y la inhibición revierte.
La actividad nitrogenasa de leguminosas se ve incrementada por presiones parciales de
CO2 altas (Finn y Brun, 1982; Williams et al., 1982)(2450). Este hecho puede ser debido, a que
bajo estas altas presiones, la relación C/N aumenta tanto en los exudados radicales como en la
hojarasca, lo cual favorece a las bacterias implicadas en la FSN (Curtis et al., 1994; Norby,
1994)(2450). El aumento en la actividad nitrogenasa en los nódulos puede deberse a una mayor
disponibilidad de C, necesario para la reducción del N2, (Hardy y Havelka, 1976)(2450). Sin
embargo, Zanetti et al. (1996) observan que la mayor fijación de nitrógeno por parte de la planta
bajo altas concentraciones de CO2, coincide con el aumento en el número y peso de los nódulos.
Otros factores abióticos que afectan directa o indirectamente a este proceso son, entre
otros, el magnesio, necesario para el funcionamiento de una pirofosfatasa en la membrana
peribacteroide (Bassarab y Werner, 1989), el boro (Bolaños et al., 1996), la concentración salina
(Delgado et al., 1993; Cordovilla et al., 1996), la concentración de ácidos orgánicos en el suelo
(Yuen y Stacey, 1996), la defoliación (Hartwig et al., 1987)(2259) y el etileno (Suganuma et al.,
1995).

1.1.2. Amonificación

La amonificación, también denominada mineralización del nitrógeno, consiste en un


conjunto de reacciones a través de las cuales el nitrógeno de proteínas y otros compuestos
presentes en la materia orgánica se libera en forma de amonio, siendo ésta forma asimilable
por las plantas (Singh y Kashyap, 1996) (Sep 2181). Este proceso es complejo y depende de
la actividad de microorganismos aerobios y anaerobios (Nugroho y Kuwatsuka, 1990)(sep
2365) que utilizan los compuestos orgánicos nitrogenados como fuente de energía (Jarvis et
al., 1996)(sep 2579). Parte del amonio que es liberado por la acción de los microorganismos
mineralizadores es utilizado para su propio desarrollo quedando inmovilizado.
Mineralización e inmovilización son procesos íntimamente conectados y se dan
simultáneamente en el suelo (Recous et al., 1992; Hart et al., 1994)(sep 2189). La
inmovilización es responsable de una demora en el rendimiento de fertilizantes (Broadbent y

16
Nakashima, 1967). Benkiser et al. (1989) sitúan entre un 20 y un 40% el nitrógeno de
fertilizantes que es inmovilizado en suelos agrícolas, y Hadas et al. (1989) establecen una tasa
algo menor (13-26%) en suelos adaptados para el cultivo en Israel. No obstante esta
inmovilización es relativa, toda vez que el amonio asimilado no escapa a la dinámica del
ciclo y a medio plazo se volverá a incorporar al suelo, siendo disponible para las plantas. En
teoría el balance entre éstos dos procesos podría fluctuar según las condiciones ambientales,
el suelo y la cantidad y naturaleza de los sustratos orgánicos. La tasa de mineralización
depende de la relación C/N de las bacterias en comparación con la relación de su sustrato.
Cuando las bacterias descomponen la materia orgánica se libera mayor cantidad de amonio si
la bacteria tiene mayor proporción de C/N que su sustrato (Hassink et al., 1994)(1003). En la
mayoría de los casos, existe una mineralización neta a lo largo del año, aunque en breves
periodos de tiempo pueda dominar la inmovilización (Ocio et al., 1991)(Sep 2579). El
balance entre estos dos procesos determina el flujo y la disponibilidad de nitrógeno (Powlson
et al., 1994)(Sep. 2180) y han sido reconocidos como importantes procesos edáficos desde
principios de siglo (Löhnis, 1910)(Sep 2579) ya que las formas minerales del nitrógeno son
esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas (Jarvis, 1996)(2579). Por tanto, su
estudio es necesario para tomar decisiones sobre las necesidades de fertilizantes, reciclado de
nitrógeno proveniente de restos de cultivos, abonos animales, mantenimiento de la materia
orgánica del suelo, emisión de gases con efecto invernadero y futuras prácticas agrícolas
(Jarvis, 1996)(Sep 2180).

1.1.2.a. Factores que afectan a la amonificación y microorganismos implicados en el


proceso

El rendimiento de la amonificación es muy variable y viene determinado por la


resultante de complejas interacciones entre los componentes biológicos, químicos y físicos
del suelo, que a su vez están sujetos a influencias externas.
McKenney et al. (1995) (sep 1068) indican que la naturaleza de la materia orgánica,
así como la cantidad y calidad de los restos vegetales es el principal factor que regula la
mineralización. Mengel y Kirkby (1978)(sep 2579) estiman que las proporciones relativas de
compuestos nitrogenados en los residuos vegetales son: menos de un 2% correspondiente a
fracción mineral (NO3-, NH4+, NO2-); aproximadamente un 5% de compuestos amino solubles
(ácidos, amidas y aminas); 90-95% proteínas y ácidos nucleicos. La proporción de cada una

17
de las tres fracciones esta influida por el estado de crecimiento de las plantas y tipo del
cultivo y nutrición, sobre la que tiene una especial incidencia los aportes de sustancias
nitrogenadas. Por tanto, atendiendo a las observaciones de McKenney et al. (1995) (sep 1068)
el tipo de cultivo y su manejo afecta de manera decisiva a la mineralización.
Las plantas inciden en la amonificación por el aporte de materia orgánica nitrogenada
de restos vegetales y a través de la exudación radical (Swift et al., 1979; Aber et al.,
1990)(sep 1992). Los exudados radicales no sólo afectan al proceso debido a que suponen una
fuente de materia orgánica, sino también porque en su composición aparecen diversas
sustancias que alteran el metabolismo de los microorganismos implicados en la
mineralización del nitrógeno (von Lützow y Ottow, 1994; Martens, 1995)(Sep 2070);
Badalucco et al., 1996)(sep 2544). Sobre este aspecto incidiremos más adelante al describir el
efecto de las plantas sobre los microorganismos rizosféricos.
Con respecto al aporte de compuestos orgánicos a través de los restos vegetales, su
riqueza en sustancias fenólicas solubles en agua es uno de los factores más importantes que
afectan la mineralización en suelos forestales, ya que dichos compuestos provocan la
estabilización de los compuestos orgánicos. La mayoría de los extractos acuosos de la
hojarasca incrementan la amonificación, pero otros la inhiben (Palm y Sanchez, 1991;
Gallardo y Merino, 1992)(Sep 1992). Hobbie (1996)(Sep 2511) afirma que la descomposición
viene controlada principalmente por la proporción de lignina y carbohidratos más que por el
nitrógeno presente en la hojarasca. Sin embargo en suelos agrícolas la situación parece ser
distinta, Broersma et al. (1995)(2098) encuentran que la tasa de mineralización en suelos
donde se han cultivado leguminosas es diez veces mayor que aquellos en los que han crecido
otro tipo de cultivo. Este hecho lo atribuyen a que estas plantas proporcionan mayores
cantidades de nitrógeno mineral al medio edáfico. Como se puede apreciar la diferencia
básica es que en sistemas agrícolas el aporte de compuestos polifenólicos no suele ser
importante si lo comparamos con sistemas forestales. Además el régimen de manejo del
suelo es completamente distinto. González-Prieto et al. (1996)(sep 2116) observan que la
mineralización neta a lo largo del año es mayor en suelos forestales que en suelos agrícolas.
El manejo de los suelos explicaría según estos autores alrededor del 20-25% de la varianza en
los índices de mineralización.
Hasta ahora se ha comentado el efecto de la materia orgánica sobre el proceso
amonificante derivado simplemente del aporte de sustrato metabolizable y su degradabilidad.
Sin embargo la presencia de sustancias que afectan al proceso metabólico en si también se

18
puede dar en esta vía además de por exudación radical. Durante la última década se ha
prestado especial atención a los mecanismos empleados por las plantas para controlar la
actividad de los microorganismos del ciclo del nitrógeno mediante toxinas o inductores. En
dichos procesos están implicados compuestos orgánicos complejos (taninos, terpenos y
fenoles) que alteran directamente la actividad microbiana en el suelo (Palm y Sanchez, 1990,
1991; Irons et al., 1991; Gallardo y Merino, 1992)(Sep 1992). Por lo tanto los metabolitos
secundarios afectan de forma importante al ciclo del nitrógeno y a la disponibilidad del
mismo (Schimel et al., 1996)(Sep 1992).
La textura controla la mineralización afectando a la distribución física de la materia
orgánica y confiriéndole cierto grado de protección a través de la asociación con partículas de
arcilla (Hassink et al., 1993)(2180). Por otra parte cuando la textura del suelo favorece las
condiciones aerobias aumenta la actividad amonificante (Drazkiewicz, 1995, 1996)(2365).
Por tanto los suelos con texturas más finas tienen menores tasas de amonificación que en
aquellos en los que la textura es más gruesa (van Veen et al., 1985; Catroux et al., 1987;
Hassink, 1994a)(1003). La textura del suelo no solo influye por su efecto sobre la aireación
del mismo, la reducción de los poros del suelo después de la compactación reduce el
transporte de sustancias solubles, disminuyendo el aporte de nutrientes (Drazkiewicz,
1996)(2365). Esto puede inhibir la degradación de lignocelulosa (Colberg, 1988)(2203), que
tiene una gran influencia en la degradabilidad de los residuos vegetales (Pinck et al.,
1950)(2203). Breland y Hansen (1996)(2203) encuentran que la mineralización disminuye en
un 18% en un suelo compactados, frente a otro no compactado.
La humedad del suelo es otro factor que afecta a la amonificación (Moorhead et al.,
1988)(Sep 1737). La deficiencia de agua hace disminuir la tasa de mineralización, ya que
determina la difusión de solutos y la distribución de los productos de la actividad microbiana
(Cabrera, 1993)(2579). Sin embargo, el exceso reduce la aerobicidad del suelo y altera las
actividades de distintas poblaciones bacterianas en diferentes micrositios. Se ha comprobado
que existe un aumento de la mineralización después de secar y rehidratar el suelo (Stevenson,
1956; Nordmeyer y Richter, 1985; Cabrera, 1993)(2606). La explicación de este hecho es que
mediante el secado del suelo y posterior rehumedecimiento los compuestos orgánicos se
vuelven disponibles para la extracción y también para la descomposición. Gestel et al.
(1991)(2606) proponen que los compuestos orgánicos mineralizados después de rehidratar el
suelo seco derivan principalmente de materia orgánica no biótica.

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Existe una fuerte interacción entre la temperatura y la mineralización (Addiscott,
1983; Beck, 1983; Lochman et al., 1989; (2188) Neve et al., 1996) (Sep 2188), siendo
responsable de entre un 31 y un 41% de la varianza en las tasas de mineralización anuales de
un pastizal (Gill et al., 1995)(2579). La mayoría de los microorganismos del suelo son
mesófilos y prefieren temperaturas moderadas con un óptimo entre 25 y 37°C y una
temperatura base de 5°C. Los cambios de congelación descongelación tienen efectos similares
a los de secado y rehidratado (Jarvis et al., 1996)(2579). En general la mineralización
aumenta con la temperatura y tiende a ser menos variable a temperaturas altas (Stanford et al.,
1973)(2579), viéndose más favorecida la mineralización de residuos más resistentes (Neve et
al., 1996)(2188).
Un concepto interesante que puede aportar datos al conocimiento de la dinámica de la
mineralización del nitrógeno en el suelo es el introducido por Bonde et al. (1988)(2606).
Estos autores indican que sólo una pequeña parte del nitrógeno orgánico en el suelo es
realmente accesible a la mineralización y de ésta una proporción importante corresponde ala
propia biomasa bacteriana. Estos resultados encajan con los resultados de Choi y Nelson
(1996)(2553) que encuentran en la biomasa bacteriana un fertilizante nitrogenado de
excelente calidad ya que su nitrógeno es rápida y fácilmente utilizable por la planta, más que
los compuestos orgánicos procedentes de restos vegetales (Abuzinadah et al., 1986)(2446).
Un factor que puede tener influencia sobre la tasa de mineralización es la actividad de
la mesofauna y microfauna. La mineralización en la rizosfera se ve incrementada por el
“pastoreo” de los protozoos (Clarholm, 1985)(2544). Los protozoos estimulan la tasa de
crecimiento bacteriano (Coleman et al., 1978; Woods et al., 1982; Clarholm, 1985)(1003) así
como la producción de enzimas bacterianas implicadas en la mineralización (Badalucco et al.,
1996)(2544). Por otro lado la proporción C/N es normalmente mayor en la microfauna
comparada con la relación de su sustrato, mientras que para las bacterias es al revés y por ello
la microfauna excreta mayor cantidad de nitrógeno en forma de NH4+ (Hunt et al., 1987)
(1003). La textura afecta de forma indirecta, en éste sentido, a la mineralización del
nitrógeno, ya que la compactación del suelo disminuye el volumen de poros disponible para
los nemátodos, organismos que incrementan el reciclado de nitrógeno por la predación de
microorganismos (Elliott et al., 1980; Woods et al., 1982; Griffiths, 1986)(2203). En los
suelos con textura más gruesa la presión de pastoreo de nemátodos y flagelados sobre
bacterias es mayor y las tasas de mineralización también (Hassink et al., 1994)(1003). Se ha
comprobado que el “pastoreo” es mayor en suelos dedicados a pastos, donde la entrada de

20
residuos orgánicos es mayor que en suelos arados donde las entradas son menores, y además
se concentran sobre todo en la época de cosecha. (Hassink et al., 1994)(1003).
Tietma et al. (1992)(2116), no encuentran ninguna relación entre el pH del suelo y la
mineralización. sin embargo, trabajos posteriores como los de González-Prieto et al.
(1996)(2116) demuestran que la mineralización es mayor en suelos ácidos (pH<4.5), aunque
la incidencia de este factor sólo explicaba en torno a un 3-17% de la varianza. Pese a que la
mineralización se ve completamente inhibida en suelos bajo la influencia de lluvia ácida
(Wolters, 1991)(2116), estos resultados no se pueden extrapolar a suelos no alterados, en los
cuales las poblaciones microbianas están adaptadas a pH ácidos (Bramley y White,
1990)(2116).
Otros factores que afectan a la mineralización son: CIC (González-Prieto et al.,
1996)(Sep 2116). el fuego (Fritze et al., 1994; Singh, 1994), el estado de la sucesión (White
et al., 1988; Vitousek et al., 1989), la adición de nitrógeno (Jenkinson et al., 1985; Hart et al.,
1986)(2579), la disponibilidad de nutrientes (Entry et al., 1986), la presencia de
contaminación por metales pesados (Chang y Broadbent, 1982)(2579) y el pretratamiento de
los suelos (Campbell et al., 1993)(Sep 2098).
El grupo funcional de los mineralizadores es amplio y abarca a hongos y bacterias.
Entre los primeros destacan géneros del orden Mucorales (Mucor y Rhizopus) y
ascomycotinas del orden Aspergillales (Aspergillus y Penicillium), (Garrt 1963 y Alexander,
1980). Los hongos liberan menos amonio que las bacterias, dada su mayor necesidad de
nitrógeno para la síntesis celular y abundan en medios con pH ácido (Garret, 1963). Llevan a
cabo las primeras etapas de la descomposición de la materia orgánica vegetal especialmente
la de la hojarasca más recalcitrante. Hace falta un primer paso en la descomposición por parte
de hongos saprófitos para liberar el nitrógeno contenido en la hojarasca (Colpaert y Laere,
1996)(2446). Ectomicorrizas y basidiomicetos colonizan los horizontes orgánicos de los
suelos forestales y movilizan nutrientes a partir de los sustratos orgánicos (Read,
1991)(2447). Una vez los carbohidratos son metabolizados por los microhongos, los
basidiomicetos saprófitos se encargan de descomponer y mineralizar los compuestos más
recalcitrantes (Colpaert y van Tichelen, 1996)(2447). Las bacterias heterótrofas, son los
principales descomponedores y suponen más de un 90% del flujo de energía en el suelo
(Ladd y Foster, 1988). Normalmente se dividen en dos grupos: a) especies autóctonas que
mantienen relativamente constante su actividad y b) especies zimógenas que reaccionan
rápidamente ante nuevos aportes de sustrato y luego permanecen en dormición (Ladd y

21
Foster, 1988)(2579). Las bacterias están representadas por diversas especies de los géneros
Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Serratia y Micrococcus. A diferencia de los hongos,
Colpaert y van Tichelen (1996)(2447) señalan una mayor abundancia de bacterias en medios
básicos o neutros.

1.1.3. Nitrificación

La nitrificación es el proceso microbiológico que transforma el N-NH4+ en formas


oxidadas de N, nitrato y nitrito. De este proceso depende en parte la productividad del suelo, ya
que el nitrato suele ser la forma nitrogenada que prefieren las plantas para su nutrición (Tu,
1996)(2527). Según Manzhosov y Maymusov (1994) la productividad de un suelo depende de
la cantidad de nitratos que pueda producir y retener.
Benckiser, et al. (1996) esquematizan el proceso de la siguiente manera:

NH3 ➙ NH2OH ➙ HNO ➙ NO ➙ NO2- ➙ NO3-


➘ ➘
N2O N2O, N2

La transformación de NH4+, relativamente inmóvil, a NO3-, extremadamente móvil,


pasando por NO2- proporciona la oportunidad de escape de numerosos formas nitrogenadas
(NO3-, NO2-, NOx, N2O, N2). Estudios in vitro con Nitrosomonas europea (Yoshida y
Alexander, 1970; Ritchie y Nicholas, 1972)(2620) demostraron que las bacterias oxidantes de
amonio eran capaces de producir N2O bajo determinadas condiciones. Ritchie y Nicholas
(1972)(2620) concluyeron que éstas bacterias reducían el nitrito a óxidos de nitrógeno para
minimizar la acumulación de niveles tóxicos de nitrito intracelulares. Sin embargo, Poth y Focht
(1985) observaron que N. europea usa el nitrito como aceptor de electrones bajo condiciones de
anaerobiosis. Estudios posteriores han confirmado esta hipótesis (Benckiser et al., 1996)(2619).
Maag y Vinther (1996)(2620) estiman que un 1% del nitrógeno nitrificado se pierde en forma de
N2O. Esta ruta alternativa de los nitrificantes para continuar sintetizando ATP usando parte de
los productos de su metabolismo aerobio cuando están en condiciones de anaerobiosis, supone
una vía de reducción de la contaminación de aguas por nitratos, pero un aumento de los niveles
de N2O en la atmósfera (Benckiser et al., 1996)(2619). Si excluimos las pérdidas de nitrógeno
como N2O vía desnitrificación, las perdidas de nitrógeno añadido como fertilizante por
volatilización de amonio y por emisión de óxido nítrico vía nitrificación, se estiman

22
aproximadamente en un 20%, si los fertilizantes son orgánicos, y en un 10% si son químicos
(Schepers y Mosier, 1991). Por otra parte las pérdidas de nitratos a través del lavado pueden
llegar a ser mayores que las pérdidas de cualquier otro nutriente (Vitousek et al., 1989; Davies y
Williams, 1995). Por las razones anteriormente expuestas se ha prestado especial atención
durante los últimos años al estudio de la nitrificación y al empleo de inhibidores de la misma,
que permitan mantener la productividad del suelo alcanzando un equilibrio entre las perdidas
por volatilización del amonio, por producción de óxidos de nitrógeno y por lavado de nitratos
(Davies y Williams, 1995). Diversas sustancias se han utilizado como inhibidoras de la
nitrificación, como por ejemplo herbicidas (Tu, 1996)(2527), insecticidas, fungicidas, así como
diversos compuestos químicos (Prasad y Power, 1995)(1304). El estudio de esta etapa del ciclo
del nitrógeno, se hace indispensable, no sólo por ser un proceso limitante, que además es vital
para el flujo, transferencia , pérdidas y utilización del nitrógeno, si no por las implicaciones
ecológicas que conlleva (Jarvis, 1996)(2180).

1.1.3.a. Factores que afectan a la nitrificación y microorganismos implicados en el proceso

Holmes et al. (1996)(2548) señalan la disponibilidad de amonio como regulador de la


nitrificación (Vitousek et al., 1982). Por esta razón, Standford et al. (1975) señalan como factor
limitante de la nitrificación la velocidad de mineralización y como ya hemos puntualizado en el
apartado anterior, la naturaleza y cantidad de los restos vegetales afectan de forma indirecta a
éste proceso (Paul y Clarck 1989)(2481). Sin embargo, H∅jberg et al. (1996) encuentran que en
suelos con niveles de amonio en torno a los 40 µg/g son otros factores distintos de la
disponibilidad de sustrato los que afectan al proceso, como aireación y humedad del suelo.

La disponibilidad de oxígeno es otro de los factores que más afecta a la nitrificación,


puesto que es un proceso aerobio. La supervivencia de las bacterias nitrificantes en ambientes
con concentraciones bajas de oxígeno, depende de su capacidad para competir con las raíces de
las plantas, con otras bacterias aerobias heterótrofas y con procesos químicos de oxidación
(Bodelier et al., 1996)(2458). Laanbroek y Gerards (1993) y Laanbroek et al. (1994)(2458),
demuestran que las bacterias nitrificantes son malas competidoras por el oxígeno comparadas
con bacterias heterótrofas (Laanbroek y Woldendorp, 1995)(2458). Sin embargo Bodelier et al.
(1996)(2458) observan que las bacterias nitrificantes que viven en ambientes donde se dan
fluctuaciones óxicas y anóxicas, son capaces de desarrollar adaptaciones fisiológicas,

23
aumentando su afinidad por el oxígeno para sobrevivir a las condiciones de microaerofilia.
Gunderson (1966) observa que un 10% de O2, es el óptimo para el crecimiento de nitrificantes.
Presiones superiores de oxígeno se han descrito como inhibidoras de Nitrobacter, siendo
necesarias bajas presiones de O2 para su crecimiento en medio sólido (Prosser, 1989)(2200).
Determinadas plantas promueven la aparición de nitrificantes en su rizosfera aportando oxígeno
a través del aerénquima (Lodhi et al., 1996)(2331). Sin embargo, como ya se ha indicado
anteriormente éstas bacterias deben competir con las plantas por el oxígeno y por tanto, la
disponibilidad de éste depende en gran parte de el estado de desarrollo de la planta y de la época
de crecimiento (Bodelier et al., 1996)(2458).

La humedad del suelo afecta a la nitrificación tanto por deshidratación como por
limitación de sustrato. Esta sensibilidad de los nitrificantes a la humedad del suelo está
relacionada con sus altos requerimientos energéticos, al diversificar su energía para sintetizar
solutos como aminas o polioles, que les ayudan a soportar situaciones de sequía (Sprent, 1987).
En organismos de crecimiento lento como los nitrificantes, se espera una fuerte selección
(selección k), y por ello, sus poblaciones suelen variar poco en el tiempo (Woldendorp y
Laanbroek, 1989)(2181), aunque Focht y Verstraete, (1977) (2548) observan variaciones
estacionales en estas poblaciones.
Las alteraciones del suelo debidas a la acción antropogénica afectan al funcionamiento
del ciclo del nitrógeno. El aumento en las concentraciones de nitratos, por deposición, tiene
diversos efectos sobre el suelo forestal, como por ejemplo, aumentar el lavado de Ca2+,
aumentar la solubilidad de Al3+ y disminuir la relación Ca/Al (Aber et al., 1989; Foster et al.,
1989)(2336). Este dato resulta de gran importancia, ya que la nitrificación se inhibe a altas
concentraciones de Al3+ y Fe3+, aunque las concentraciones de amonio sean altas (Liang y
Tabatabai, 1978)(2336). Como consecuencia del cultivo se altera la estabilidad del suelo y se
reduce la cantidad de carbono orgánico (Bauer y Black, 1981; Gupta y Germida, 1988;
Srivastava y Sing, 1989)(2181). Las pérdidas de carbono orgánico reducen el número de
macroagregados en los suelos cultivados (Sing y Sing, 1995)(2181) y esto tiene un considerable
impacto sobre la mineralización ya que la materia orgánica de macroagregados es más lábil y
más fácil de mineralizar que la asociada a microagregados (Gupta y Germida, 1988)(2181). Jha
et al. (1996)(2181) calculan que el número de oxidantes de amonio y de nitrito en suelo agrícola
es un 48 y 31% del presente en suelo forestal lo que podría deberse a los factores antes
señalados.

24
A pesar de ser microorganismos autótrofos, Berg y Rosswall (1985, 1987)(2181)
encuentran una correlación positiva entre las cantidades de carbono orgánico y el número y
actividad de oxidantes de amonio y nitrito. En este sentido influye el efecto de la materia
orgánica sobre la mineralización y la relación entre este proceso y la nitrificación (Standford et
al., 1975; Paul y Clark, 1989), pero además la materia orgánica del suelo aumenta la aireación
del mismo, lo cual es crucial para los nitrificantes que dependen de los sistemas citocromo para
el transporte de electrones y finalmente del oxígeno (Haynes, 1986). Sin embargo, cantidades
excesivas de materia orgánica junto con una excesiva humedad pueden crear situaciones de
anoxia inhibiendo, por tanto, la nitrificación (Jha et al., 1996)(2181).
La textura del suelo afecta decisivamente la nitrificación puesto que la difusión de
oxígeno, así como el mantenimiento del agua se produce de forma desigual según el tamaño del
poro y de los agregados telúricos Drazkiewicz (1996)(2289). Por otro lado la heterogeneidad del
suelo y el contenido en arcillas afectan decisivamente al proceso ya que las arcillas adsorben
iones amonio, y como resultado existe una colonización entorno a ellos de los oxidantes de
amonio (Powell y Prosser, 1992)(2181).
El metabolismo del nitrito es extremadamente rápido, salvo en ocasiones que queda
retenido en el suelo, dependiendo de las características del mismo, las prácticas agrícolas como
fertilización con amonio, pH, contenido de materia orgánica, temperatura y humedad (Burns et
al., 1995)(2269). La alcalinidad del suelo favorece la acumulación de nitrito, en los lugares
donde se dan altas concentraciones de NH3 y altos pH, el nitrito tiende a acumularse, ya que su
oxidación está inhibida (Van Cleemput y Samater, 1996)(2269). Estos dos factores parecen
afectar más a los oxidantes de nitrito que a los oxidantes de amonio, lo cual deriva en una
acumulación de NO2- en el suelo. Otros autores han observado una acumulación de nitrito a
bajas concentraciones de carbono orgánico y a bajas temperaturas (Habr y Goltermasn,
1990)(2269).
Las plantas afectan a este proceso produciendo compuestos alelopáticos que inhiben
directamente la nitrificación (Rice, 1984)(1992). Entre estos metabolitos secundarios destacan
los taninos (Thibault et al., 1982; Baldwin et al., 1983), fenoles de bajo peso molecular (Lodhi y
Killingbeck, 1980) y terpenos (White, 1986). Por otro lado, los fenoles, taninos y otros
metabolitos secundarios de las plantas afectan a la nitrificación de forma indirecta, cambiando la
descomponibilidad de los compuestos orgánicos, lo que supone un retraso en la descomposición
y mineralización de los mismos (Palm y Sanchez, 1990, 1991; Irons et al., 1991; Gallardo y
Merino, 1992)(1992).

25
Otros factores que afectan al proceso son la temperatura (Savey, 1967), el pH (Katyal et
al., 1988), la concentración de ácidos orgánicos (Karmarkar y Tabatabai, 1991), metales
pesados (Dusek, 1995), capacidad de intercambio catiónico y disponibilidad de fosfatos
(Vitousek et al., 1982), el fuego (Acea y Carballas, 1996)(2658) y concentración de nitrato
(Gomez et al., 1996)(2127), entre otros.
La nitrificación la pueden realizar ciertos microorganismos heterótrofos. Estudios
llevados a cabo con cultivos de microorganismos nitrificantes heterótrofos (Doxtader y
Alexander, 1966; Schmidt, 1973; Focht y Verstraete, 1977; Tate, 1985) indican que éstos no
hacen uso de la energía liberada en la oxidación para su crecimiento y, como apunta Alexander
(1980), los productos oxidados no aparecen hasta que ha cesado la fase exponencial de
crecimiento. Todo ello sugiere que la nitrificación heterótrofa no tiene una importancia muy
grande en lo que respecta a la producción de N-NO3-.
La nitrificación quimioautótrofa es llevada a cabo por dos grupos fisiológicos de
bacterias Gram negativas quimioautótrofas pertenecientes a Nitrobacteraceae (Watson et al.,
1981; Schmidt, 1982)(2181); la primera etapa, la conversión de amonio a nitrito, es mediada por
bacterias oxidantes de amonio (Jha et al., 1996)(2181) que pertenecen sobre todo a los géneros
Nitrosomonas, Nitrosoglea, Nitrosospira, Nitrosococcus y Nitrosocystis. La segunda, el paso de
nitrito a nitrato por bacterias oxidantes de nitrito (Jha et al., 1996)(2181) pertenecientes en su
mayoría a los géneros Nitrobacter y Nitrocystis. Entre los microorganismos que realizan la
nitrificación heterótrofa pueden mencionarse algunos géneros de bacterias como Azotobacter,
Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Alcaligenes, Nocordia y Thiosphaera, a este último
género pertenecen los desnitrificantes aerobios anteriormente mencionados y hongos del orden
Aspergillales de los géneros Aspergillus y Penicillium.

1.1.4. Desnitrificación

La desnitrificación microbiológica consiste en la reducción del nitrato a óxidos de


nitrógeno y nitrógeno molecular. Para ello las formas oxidadas de nitrógeno sirven como
últimos aceptores de la cadena respiratoria con el subsiguiente rendimiento energético (Bernet et
al., 1995)(1290), por lo tanto el proceso sólo ocurre en condiciones anaerobias. Zanner y Bloom
(1995), detectan actividad desnitrificante en suelos bien aireados, hecho que imputan a la
presencia de microespacios anaerobios entre las partículas constituyentes del suelo o en la
proximidad de residuos orgánicos. En consecuencia, en el suelo se dan simultáneamente

26
procesos nitrificantes y desnitrificantes (Burns et al., 1995b)(2200) ocupando los
microorganismos la superficie de agregados del suelo (con mayor tensión de oxígeno) o el
interior de las partículas (con menor tensión de oxígeno), respectivamente (Tate, 1985). Ye et
al., (1994) especifican el conjunto de reacciones constituyentes del proceso como sigue:

NO3- ➙ NO2- ➙ NO ➙ N2O ➙ N2

Cada una de las distintas etapas está catalizada por una enzima específica distinta
(Hochstein y Tomlinson, 1988; Stouthamer, 1991)(2637). Así, sólo algunos microorganismos
poseedores del juego enzimático completo pueden producir nitrógeno molecular a partir de
NO3-, por lo que Ingraham (1981) sólo considera desnitrificantes estrictos a dichos
microorganismos. Lo más habitual es, sin embargo, que sólo posean algunas de estas enzimas,
por lo cual liberan únicamente productos parcialmente reducidos (Hall, 1978(Tesina Lu);
Tiedje, 1988; Ye et al., 1994)(2637). Las cuatro reductasas implicadas en el proceso difieren en
sus condiciones óptimas con respecto a variables, como: concentración de oxígeno, pH,
concentración de NO3-, disponibilidad de carbono, etc. Por tanto las condiciones ambientales
juegan un papel importantísimo determinando si la desnitrificación es total o parcial y por tanto
que productos del proceso se acumulan (Burns et al., 1996)(2200).
El nitrato puede ser también reducido asimilatoriamente (se han encontrado procariotas
capaces de dicha reducción) sin que éste sea liberado al medio (Blackburn, 1983). Esta ruta,
conocida como reducción asimilatoria es reprimida por el amonio y no está acoplada a la
producción de ATP, por lo que se verifica tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Bernet et
al. (1995) apuntan que existe una vía desasimilatoria que produce amonio y que está acoplada a
la formación de ATP. Esto supone para los microorganismos capaces de realizarla una fuente
extra de energía y para los ecosistemas, una vía de liberación de nitrito y del exceso de poder
reductor (Yordy y Ruoff, 1981). La proporción entre desnitrificación y reducción
desasimilatoria es función de la relación carbono disponible/aceptor electrónico, tamaño de la
población bacteriana y su actividad (deCatanzaro y Beauchamp, 1985; Fazzolari et al.,
1990)(2481).
Existen también procesos de desnitrificación estrictamente abióticos, aunque su
importancia es mínima (Hutchinson y Davidson, 1993), limitándose a suelos muy ácidos o
helados (Vermoesen et al., 1996).

27
1.1.4.a. Factores que afectan a la desnitrificación y microorganismos implicados en el
proceso

La tasa de desnitrificación responde a la concentración de nitrato de acuerdo con una


cinética de Michaelis-Menten (Firestone, 1982)(2209). Sin embargo, esta variable afecta de
forma diferente a las distintas enzimas implicadas en la desnitrificación. En algunas bacterias el
nitrato inhibe la síntesis de la nitrito reductasa (Unden et al., 1980)(2200). Por lo tanto en suelos
donde la nitrificación sea intensa y se acumulen altas concentraciones de NO3-, este se reduce a
NO2-, pero su transformación en óxidos de nitrógeno estará bloqueada y se pueden acumular
cantidades elevadas de NO2-. La concentración de NO3- afecta a la cantidad de N2O y N2
producidas durante la desnitrificación (Swerts et al., 1996)(2624). Hutchinson y Davidson
(1993)(2624) proponen la hipótesis de que cuando la disponibilidad de oxidantes prevalece
sobre la de reductores, el sustrato nitrogenado es sólo parcialmente reducido, por lo que la
relación N2O/N2 aumenta.
También el NO inhibe la nitrito reductasa (Carr et al., 1989)(2200). Esto supone un
mayor rendimiento en la reducción completa hasta N2 y por lo tanto un mejor rendimiento
energético, al evitar pérdidas de NO cuando se sobrepasa la capacidad de la óxido nítrico
reductasa.
Al aumentar la humedad del suelo, los niveles de desnitrificación aumentan (Mosier et
al., 1983; Groffman y Tiedje, 1991; Weier et al., 1993)(2200). Este efecto es muy acusado si la
humedad es superior al 60% (Linn y Doran, 1984; Aulakh et al., 1991). Cuando la humedad del
suelo está en torno a su capacidad de retención máxima, se favorece el aumento de NO
incrementándose las cantidades de oxido nitroso (Burns et al., 1996)(2200) al mismo tiempo
que la relación N2O/N2 disminuye (Vinther, 1996)(2620).
La desnitrificación heterótrofa requiere una abundante fuente de carbono orgánico
degradable, por lo tanto es un factor crítico para dicha actividad (Bowman y Focht, 1974;
Stanford et al., 1975a; Beauchamp et al., 1989)(2209). Cuando en el suelo existen
concentraciones de NO3- no limitantes para el proceso, la disponibilidad de carbono es el factor
más importante en el control de la desnitrificación (Lalisse-Swerts et al., 1996)(2624). En
condiciones aerobias las bacterias desnitrificantes son capaces de utilizar gran variedad de
fuentes de carbono, sin embargo, bajo anaerobiosis, este número se reduce (Beauchamp et al.,
1989)(2481). Además, Ganaye et al. (1996) demuestran que el tipo de fuente de carbono afecta

28
de forma decisiva a la actividad de las distintas enzimas implicadas en el proceso, de forma que
según la fuente de carbono empleada, la cantidad de nitrito acumulada varía considerablemente.
El oxígeno afecta de forma diferencial a las distintas enzimas del proceso. La síntesis de
la nitrito reductasa es reprimida por el oxígeno, siendo esta enzima la más sensible a este factor
de todas las implicadas en la desnitrificación (Cole, 1994)(2200). Parkin (1987)(1748) introduce
el concepto de “puntos calientes”, zonas en que la intensidad de respiración microbiana se ve
favorecida debido a una abundante disponibilidad de carbono orgánico junto con niveles
apropiados de oxígeno. Dicha respiración excede el suplemento de oxígeno por difusión durante
un tiempo limitado, favoreciendo la desnitrificación. La variabilidad en la actividad
desnitrificante bajo condiciones de campo sugiere que la desnitrificación en gran parte debe
estar asociada a estos puntos calientes. En los sistemas agrícolas se forman tipos especiales de
puntos calientes ya que los residuos vegetales proporcionan altas concentraciones de carbono y
nitrógeno (Paul y Beauchamp, 1989; Nielsen y Revsbech, 1994)(1748). Estos puntos calientes
sostienen la actividad desnitrificante durante largos periodos (Thompson et al., 1987)(1748).
El tipo de manejo que se le de al suelo afecta de forma significativa a la desnitrificación
en el suelo. Los suelos agrícolas son una importante fuente de emisión de óxidos de nitrógeno
ya que el cultivo continuo altera la agregación del suelo (Hart et al., 1985; Burns y Davies,
1986)(1012). Además en estos suelos la disponibilidad de nitrógeno inorgánico y carbono
orgánico es alta por varias razones: la aplicación de fertilizantes nitrogenados, la mineralización
de nitrógeno orgánico y la disponibilidad de carbono orgánico debido a los aportes de restos
vegetales (Vermoesen et al., 1996)(2194). La desnitrificación es uno de los procesos causantes
de la disminución de eficacia de los fertilizantes químicos y en general del nitrógeno disponible
para los cultivos (Swerts et al., 1996)(2624). Constable et al. (1992)(2582) observan que sólo
un 40% del nitrógeno de los fertilizantes pasa a formar parte de la cosecha. Se ha estimado que
cerca de 1.5 Tg de nitrógeno se inyectan directamente a la atmósfera cada año en forma de N2O
como resultado de la aplicación de fertilizantes en los sistemas agrícolas (CAST, 1992; Watson
et al., 1992)(2191). Esto supone un 44% de las entradas debidas a la acción antrópica y un 13%
del total anual. Estas estimas (Watson et al., 1990, 1992) (2191) no incluyen la producción de
N2O por otras vías como son los abonos animales y la fijación simbiótica de nitrógeno. En los
pastizales las pérdidas de N2O son normalmente menores que en suelos agrícolas, en torno a un
2% del nitrógeno aplicado por fertilización (Granli y B∅ckman, 1994; Van Cleemput et al.,
1994; Velthof y Oenema, 1994) y la transformación de pastizal a tierra de cultivo incrementa la
desnitrificación (Mosier et al., 1996)(2191). Por todas las razones expuestas, la desnitrificación

29
en suelos cultivados se ha estudiado durante muchos años para cuantificar las pérdidas de
nitrógeno por esta vía, determinar el efecto de factores ambientales en las tasas de
desnitrificación y optimizar el rendimiento de los cultivos (Fuch, 1974; Linn y Doren, 1984;
Myrold y Tiedje; 1985; Prade y Trodlenier, 1989; Klemedtsson et al., 1991; Colbourn,
1993)(1761).
Como ya se ha indicado anteriormente el tipo de materia orgánica disponible afecta
considerablemente al proceso. Por esta razón el tipo de cultivo influye sobre la tasa de
desnitrificación. McKenney et al. (1993)(2481) observan un aumento significativo de la
actividad desnitrificante al suministrar restos secos de leguminosas. Este aumento es mayor que
si los restos provenían de otro tipo de planta. Galbally et al. (1992) indican que las leguminosas
contribuyen a la emisión de oxido nitroso de varias formas: el nitrógeno atmosférico fijado por
las leguminosas puede ser nitrificado y desnitrificado del mismo modo que el nitrógeno de los
fertilizantes, y además los rizobios que viven en simbiosis con este tipo de plantas son capaces
de desnitrificar y de producir N2O (García Palazola et al., 1995)(1394).
La textura afecta al proceso interaccionando con otros factores como la temperatura
(Vinther, 1996)(2620) y el oxígeno (Corre et al., 1995). Cuando se añade nitrógeno y carbono al
suelo, la desnitrificación aumenta, pero, este aumento es variable según la textura y la humedad
del suelo (Paul, et al., 1993; Vinther, 1996)(2620). Diferencias en las propiedades físicas del
suelo se traducen en diferencias en la capacidad de retención del agua y capacidad de
percolación. Esto afecta de modo indirecto a la desnitrificación, ya que la disponibilidad de
nutrientes también varía con estos parámetros. Ensayando agregados simples, Sexstone et al.
(1951) y Lensi et al. (1991) (1012) observan que la actividad desnitrificante no aparece en
todos los agregados telúricos, aunque existiesen centros anaerobios (Sexstone et al., 1985)
(1012). Comparando suelos agregados y no agregados, Sexstone et al. (1988) (1012) sugirieron
que la discontinuidad de carbono disponible, concentración de nitrato y bacterias
desnitrificantes eran los factores limitantes de la desnitrificación en suelos agregados, mientras
el oxígeno inhibe más que la disponibilidad de sustratos en suelos no agregados.
Entre otros factores que también inciden en la desnitrificación podemos citar: la
temperatura (Estavillo et al., 1994; Zanner y Bloom, 1995), el pH (Wang et al., 1995;
Vermoesen, et al., 1996)(2194), la vegetación y sus características (García, 1977; Mikkelsen,
1987; H∅jberg et al., 1996), los pesticidas (Goring y Laskowski, 1982; Knowles, 1982), las
condiciones climáticas (Aulakh et al., 1992) y el tamaño de la población desnitrificante
(Firestone, 1982)(2209).

30
De los microorganismos heterótrofos un 5% son desnitrificantes (Tiedje et al.,
1982)(1012). Las bacterias heterótrofas que llevan a cabo la desnitrificación pertenecen a
diversos grupos taxonómicos. García (1977) señala el género Bacillus como el máximo
contribuyente a la desnitrificación en ambientes naturales. Tiedje et al. (1984) señalan a
Pseudomonas y Gamble et al., (1977) a Clostridium. Existen otros géneros en los que aparecen
especies desnitrificantes como Thiosphaera y Alcaligenes (Robertson et al., 1995) y
Flavobacterium (Wang et al., 1995), pero su menor representatividad cuantitativa en
comparación con los géneros anteriormente mencionados, hace pensar que su incidencia en la
desnitrificación a nivel edáfico a de ser apreciablemente menor.

1.2. Interacciones del sistema suelo-planta

En 1904, Hiltner define la rizosfera como aquella porción del suelo en torno a la raíz de
leguminosas, con una mayor actividad microbiana dada la alta concentración de carbono y otros
nutrientes existentes en esta zona. Posteriormente este concepto fue redefinido y actualmente se
considera rizosfera la porción de suelo influida por las raíces vivas. Son muchos autores los que
a partir de 1904 se han dedicado al estudio de la rizosfera, cabe destacar, entre otros, los trabajos
de Starkey (1949) en los que demuestra los principales efectos de la planta en el crecimiento de
microorganismos edáficos, los de Rovira (1959), Vancura (1964), Rovira y Bowen (1966) y
Rovira et al. (1979) sobre la naturaleza y el papel de los exudados en la rizosfera y toda una
serie de trabajos y revisiones sobre las propiedades y características de esta región edáfica que
nos permiten considerar el "efecto rizosfera" como uno de los factores clave que afectan a la
producción primaria (Rovira, 1979; Lynch, 1983; Curl y Truelove, 1986; Wild, 1988; Lynch,
1990)(Agus).
La rizosfera posee una estructura compleja en la que actúan gran número de variables.
Al igual que cualquier ecosistema, es un sistema termodinámicamente abierto en el que se
produce un intercambio constante de masa y energía (Foster, 1988; Smiles, 1988). El estudio de
este sistema es muy complicado debido al alto número de interacciones que en él se dan. La
planta durante su desarrollo va a influir en la microflora edáfica, y los microorganismos a su vez
interaccionan con las plantas, encontrándose diferencias importantes en la fertilidad del suelo
según estudiemos el suelo rizosférico y el no rizosférico (Gobran y Clegg, 1996). Los
microorganismos también interaccionan con los componentes físicos del ambiente radical
alterando la naturaleza del suelo, produciendo polisacáridos y otros compuestos orgánicos que

31
promueven la formación de agregados (Lynch, 1987). En resumen, el entorno rizosférico viene
determinado por la triple interacción suelo, planta y microorganismos.

1.2.1. Efecto de la planta sobre el suelo y las comunidades microbianas edáficas

Las plantas modifican las comunidades microbianas del suelo de un modo fundamental
(Remacle y De Leval, 1975; Acero et al., 1994). Alexander (1980) observa cómo diferentes
especies de plantas en un mismo tipo de suelo, presentan rizosferas muy diversas, mientras que
la rizosfera de una misma especie, cultivada en suelos muy diferentes varía muy poco.
Lozano y Velasco (1972 y 1981), estudian este problema en zonas repobladas con Pinus
pinaster Ait. y Eucaliptus camaldulensis Denn., donde el bosque climácico era un robledal de
Quercus pyrenaica Wild. y un alcornocal-encinar, respectivamente. En el primer caso observan
como la especie introducida modifica substancialmente el ciclo del carbono, mientras que en el
segundo caso es el ciclo del nitrógeno el que se altera de forma importante. En la rizosfera se da
una mayor desnitrificación que en el resto del suelo (Klemedtsson et al., 1987b)(1637). La
rizosfera puede ser un sitio de bajo contenido en oxígeno, las raíces y los microorganismos
consumen rápidamente el O2 (Woldendorp, 1962; Klemedtsson et al., 1987a; Hfjberg y
Sfrensen, 1993) (1637). El aporte de C por los exudados radicales y las bajas concentraciones
de O2 favorecen la síntesis de enzimas desnitrificantes y por lo tanto la actividad y crecimiento
de estas bacterias (Hfjberg et al., 1996)(1637). Los trabajos de Gutiérrez Mañero y Bermúdez
de Castro (1983), Bermúdez de Castro y Gutiérrez Mañero (1987) y Pozuelo Gonzalez et al.
(1992) con Myrica gale (L.) indican que esta especie tiene un efecto beneficioso sobre el suelo
de los lugares en que es autóctona, ya que acelera el reciclado de la materia orgánica
nitrogenada, incentivando así la productividad del ecosistema. Llinares (1990) y Pozuelo et al.
(1995) encuentran que Eleagnus angustifolia L. y Alnus glutinosa (L.) Gaertn. respectivamente
modifican los componentes bióticos y abióticos del suelo, produciendo un incremento de la
materia orgánica y de la velocidad de reciclado del nitrógeno. Los trabajos de Lawley et al.
(1983) y Schmitz et al. (1989) siguen la misma línea, estudiando en el primer caso los
microorganismos asociados a la rizosfera de varias plantas herbáceas, y en el segundo la
variación de los microorganismos edáficos durante la sucesión de un pastizal mediterráneo.
Turner y Frantz (1985) señalan que el efecto de la vegetación sobre el suelo y las
comunidades microbianas que lo pueblan se verifica principalmente por cuatro vías:
* Aporte de diferentes compuestos por el lavado de las partes aéreas por la lluvia.

32
* Adición de materia orgánica al suelo a través del lecho de hojarasca.
* Efecto de las raíces a través de exudados, secreciones etc, en la aireación y estructura
del suelo así como en la composición y funcionalidad de microorganismos.
* Formación de microclimas por efecto dosel.
La lluvia, al lavar las partes aéreas de la planta (tallos, ramas y hojas) arrastra nutrientes
hacia el suelo. Bollen y Lu (1968) encuentran que el agua de lluvia que ha lavado las partes
aéreas del aliso, contienen de 2 a 10 veces más nitrógeno que la caída a cierta distancia de la
betulácea. Este aporte junto con el producido por otras vías provoca un incremento significativo
del nitrógeno en aquellos lugares colonizados por esta planta (Pozuelo et al., 1995), provocando
modificaciones importantes en algunas etapas del ciclo del nitrógeno (Kim et al., 1995).
Muchas plantas excretan en la superficie foliar complejos resinosos de compuestos orgánicos,
formados principalmente por: terpenoides, agliconas, flavonoides y fenoles embebidos en una
matriz acuosa (Wollenneber y Dietz, 1981; Wollenneber et al., 1991)(1505). Estos componentes
pueden ser lavados y afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas del
suelo, actuando como activadores o inhibidores enzimáticos.
La materia orgánica condiciona muchas de las propiedades del medio edáfico que
influyen en el sistema suelo-planta y por tanto afecta al crecimiento y desarrollo de la microflora
del suelo (Fresquez y Lindemann, 1982 (Marisa); Grayston et al., 1996(Agus). La hojarasca
constituye una de las principales vías de entrada de materia orgánica al suelo (Tiessen et al.,
1984). La estructura y composición del lecho de hojarasca regula la tasa de mineralización, por
lo que incide de forma decisiva en la producción primaria de los ecosistemas (Hunt et al., 1988).
Los restos vegetales de coníferas se descomponen con lentitud, ya que contienen una baja
proporción en nutrientes con nitrógeno y fósforo(Cowling y Merril, 1966). Sin embargo, la
descomposición de las hojas de plantas fijadoras de nitrógeno es relativamente rápida debido a
su elevada concentración en compuestos nitrogenados; estas plantas además influyen
considerablemente en los microorganismos edáficos, principalmente sobre aquellos implicados
en el ciclo del nitrógeno. Rossiter (1966) indica que las estructuras vegetativas de leguminosas
tienen más del doble de nitrógeno que las gramíneas, y lo mismo ocurre con sus semillas y con
los frutos (semillas más la vaina). Valores parecidos encuentran Gómez Gutiérrez y Duque
Macias (1973) y Duque et al. (1973).
Las plantas son capaces de mejorar el estatus de nutrientes de suelos pobres, tanto
absorbiendo los nutrientes de las capas más profundas y aportándolos de nuevo en las más
superficiales a través de la hojarasca como aumentando la retención de los mismos

33
incrementando la capacidad de intercambio catiónico del suelo (Bernhard-Reversat,
1996)(2609).
El crecimiento microbiano está limitado por la disponibilidad de carbono orgánico. Las
raíces en crecimiento son una fuente vital de carbono para la biomasa microbiana (Whipps y
Lynch, 1983; Helal y Sauerbeck, 1986; Wheatley et al., 1990). Como resultado de todo ello la
rizosfera es rica en microorganismos, Paul y Clark (1989), estiman que la densidad microbiana
es 100 veces mayor abundante que fuera de ella. Pero esta variación es también cualitativa,
como se desprende de los trabajos de Bowen y Foster (1978) en los que comprueban que los
tiempos de generación de Psedomonas sp. y Bacillus sp., creciendo en la rizosfera, son 5.2 y 39
horas respectivamente, en tanto que fuera de ella hay una generación cada 77 y 100 horas.
Norton y Firestone (1991) observan que el 57% de las bacterias son activas en la rizosfera del
pino ponderosa, mientras que sólo el 41% los son en el suelo libre de la influencia de las raíces.
Estos autores proponen que únicamente en el ambiente rizosférico las bacterias encuentran
fuentes de carbono adecuados para mantener sus requisitos metabólicos. Por tanto, la liberación
de compuestos orgánicos por las raíces tiene una influencia decisiva sobre la disponibilidad de
nutrientes y en consecuencia sobre la actividad microbiana (Bowen y Rovira, 1991). Además de
sustrato para las bacterias, estos compuestos orgánicos son importantes, dada su capacidad para
quelar cationes (Marschner, 1991; Vaughan et al., 1993) y para formar agregados telúricos
(Foster, 1990).
Las rizodeposiciones podríamos dividirlas en varios grupos dependiendo de su forma de
liberación:
* Exudados hidrosolubles. Comprenden sustancias de bajo peso molecular que son
liberadas sin la mediación de ninguna actividad metabólica. Su exudación se lleva a cabo a
favor de un gradiente de concentración (Burström, 1955; Bowen y Rovira, 1991).
* Secreciones. Comprenden sustancias de mayor peso molecular, requieren de un
proceso metabólico para su liberación. Pueden liberarse en contra de gradientes de potencial
químico o electroquímico (Hale et al., 1978).
* Lisados que provienen de la autolisis celular y que comprenden el contenido celular y
con el tiempo, toda la raíz (Whipps, 1990)
* Gases como etileno, dióxido de carbono y cianhídrico. Rovira (1956, 1969, 1973)
considera estos gases como parte de los exudados de bajo peso molecular.
* Mucílagos que cubren las raíces de muchas plantas y están compuestas principalmente
por polisacáridos y ácidos poligaracturónicos de alto peso molecular (Marschner, 1986; Watt et

34
al., 1993). Cuando este mucílago se forma en condiciones no axénicas, resulta de la actividad de
la planta y de los microorganismos y recibe el nombre de mucigel (Jenny y Grossenbancher,
1963; Oades, 1978)(A).
Normalmente es imposible distinguir entre los distintos tipos mencionados, por lo que
Uren y Reisenauer (1988) y Rovira (1969) consideran exudados a todas las sustancias orgánicas
liberadas por la raíz. La exudación radical se produce sobre todo en las uniones longitudinales
de las células (Bowen, 1979). Por otra parte los restos de raíces muertas constituyen un 40% del
total de la materia orgánica que entra en el suelo (Lee y Pankhurst, 1992). Este carbono se libera
en la rizosfera que constituye un 2-3% del total del volumen del suelo (Coleman et al., 1978).
Las raíces muertas también aportan compuestos orgánicos y suministran nutrientes al suelo que
influyen decisivamente sobre la biomasa (Joslin y Henderson, 1987; Whipps, 1990), en la
dinámica del ciclo del nitrógeno (McClaugherty et al., 1984) y la producción primaria neta de
los ecosistemas forestales (McClaugherty et al., 1982).
La especie, edad de la planta, estado fisiológico y grado de lignificación del aparato
radical son características que afectan decisivamente a la composición cualitativa y cuantitativa
de los exudados radicales (Hamlen et al., 1972; Lynch, 1990; Gutiérrez Mañero et al., 1994;
Gutiérrez Mañero et al., 1995) y por lo tanto son factores que influyen en la magnitud del efecto
rizosfera. El tipo de proteínas (Juo y Stotzky, 1970) o de carbohidratos (Hamlen et al., 1972)
exudados por las herbáceas depende de la edad de la planta. Los cambios en la exudación con la
edad también se han detectado en leñosas, observándose que las plántulas exudan una mayor
cantidad de carbohidratos (cuantitativa y cualitativamente hablando), mientras que las plantas
adultas exudan más aminoácidos, amidas y ácidos orgánicos (Smith, 1970). Las plantas
perennes suelen exudar una mayor proporción de fotosintatos (40-73%) que las anuales (10-
46%) (Marschner, 1986; Helal y Sauerbeck, 1986). Esto puede ser debido a que las plantas
perennes utilizan parte de estos exudados para sobrevivir a lo largo del año a situaciones de
estrés (Harris et al., 1980). Como regla general, las leguminosas provocan un efecto rizosfera
más pronunciado que los pastizales o los cultivos de grano y esto se potencia aún más en
leguminosas bienales o perennes (Alexander, 1980).
La intensidad y fotoperiodo de luz, la temperatura y el estrés hídrico influyen del mismo
modo, así este último produce un aumento de materia orgánica por un proceso osmótico y
porque hay raíces que no son capaces de resistir esas condiciones. Bajo condiciones de estrés la
planta parece ejercer un control completo sobre los patrones de liberación temporales y
espaciales (Takasi et al., 1984; Pellet et al., 1995; Ryan et al., 1995)(2575).

35
La naturaleza de los exudados ha sido objeto de distintos estudios. Es clásico el trabajo
de Vancura y Hovadik (1965), en el que encuentran que las distintas plantas estudiadas liberan
al exterior aminoácidos, ácidos orgánicos y azúcares de muy diversos tipos. Estos compuestos
son para Kraffczyk et al. (1984) y Sundin et al. (1994) los componentes fundamentales de los
exudados de la mayoría de las plantas. También se han detectado esteroles, ácidos fenólicos,
ácidos grasos, vitaminas, compuestos volátiles, factores de crecimiento, nucleótidos, flavonas,
enzimas y hormonas (Curl y Truelove, 1986; Whipps, 1990). Algunos de estos productos
inciden en la microflora rizosférica alelopáticamente como los dos isoflavonoides (cumestrol y
daizeina), que D`Arcy Lameta y Jay (1987) encuentran como inhibidores o estimuladores de
distintos géneros bacterianos.
Smith (1976) observa que a través de las raíces se liberan gran cantidad de iones
inorgánicos relacionados con los constituyentes orgánicos. Alrededor de un 71% son cationes
(Ca2+, Na+, K+, NH4+, Mg2+) y un 12% de aniones (SO42-, Cl-, PO43-, NO3-), un 11% de ácidos
orgánicos, 5% de carbohidratos y un 1% de aminoácidos (Smith, 1976).
La composición de los exudados varía según la zona de la raíz que estudiemos. Los
azúcares se liberan a lo largo de toda la raíz mientras que los aminoácidos y los ácidos orgánicos
parecen exudarse sobre todo en las zonas más próximas al ápice (Hoffland, 1992; Jones y
Darrah, 1994).
Los ácidos orgánicos son liberados por las raíces para mejorar la nutrición de la planta,
ya que facilitan la movilización de metales como el manganeso (Godo y Reisenauer, 1980;
Uren, 1982). Pero de un modo indirecto la movilización de nutrientes también puede afectar a la
actividad microbiana. El ácido málico y el cítrico forman quelatos estables con el Fe3+ y con
Al3+ (Vaughan et al., 1993)(A)(Jones y Kochian, 1996)(2574), y por lo tanto aumentan la
disponibilidad de fósforo inorgánico (Otani et al., 1996)(2339). Bajo condiciones de toxicidad
de Al3+, se incrementa la liberación de estos ácidos, que forman complejos con el Al3+ y evitan
así su toxicidad (Delhaize et al., 1993; Ryan et al., 1995)(2575). Las deficiencias de hierro y
fósforo aumentan la cantidad de quelantes en los exudados (Gardner et al., 1983; Takagi et al.,
1984; Hofland et al., 1989; Miyasaka et al., 1991)(1053). La deficiencia en hierro aumenta los
niveles de ácido fenólicos que aumentan la movilización de Fe3+ y Mn2+ y facilitan su transporte
y captación (Marschner, 1986; Jolley y Brown, 1987). Además el descenso de pH conlleva la
exudación de estos ácidos, y como consecuencia de este descenso, una mayor disponibilidad de
Fe3+, Mn2+ y Zn2+ y una menor disponibilidad de Mo2+ (Marschner, 1991).

36
El efecto directo de los exudados radicales no se limita a los compuestos orgánicos de
bajo peso molecular, incluye también enzimas como por ejemplo fosfatasas ácidas (Chhonkar y
Tarafdar, 1981), muy importantes para la adquisición de fósforo en suelos ácidos (Haüssling y
Marschner, 1989).
Las bacterias son más eficaces que los hongos utilizando los compuestos de peso
molecular bajo. Estas sustancias constituyen una parte importante de los exudados radicales y
son poco abundantes en las primeras etapas descomponedoras de los restos vegetales muertos.
Por el contrario los hongos metabolizan fácilmente los polímeros de peso molecular elevado,
que son más abundantes en los restos vegetales muertos y por tanto son más eficaces durante el
comienzo de la descomposición de las raíces muertas (Nakas y Klein, 1980). Tales
características metabólicas justifican que las bacterias dependan sobre todo de los exudados
radicales y los hongos de los restos vegetales en descomposición.
Las diferencias en la composición de los exudados hacen que varíe la composición de
las poblaciones microbianas rizosféricas (Curl y Truelove, 1986; Bowen y Rovira, 1991). Como
resultado de este hecho, cada especie y genotipo de planta tiene asociada una microflora
específica (Neal et al., 1970; Neal et al., 1973). Por otro lado, otros compuestos exudados por
las raíces actúan como señales para atraer microorganismos simbióticos, patógenos o
beneficiosos a la rizosfera. La mayoría de estos compuestos son ácidos fenólicos con actividad
quimiotáctica y son activos a bajas concentraciones 10-6-10-12 M (Lopez de Vitoria y Lovell,
1993)(1193). El efecto de quimiotaxis se ha demostrado que no está relacionado con la
capacidad del organismo para metabolizar el sustrato (Reinhold et al., 1985). Estas señales
también estimulan la germinación de esporas y la elongación de hifas en micorriza arbusculares
(Tsai y Philips, 1991) y en ectomicorrizas (Horan y Chilvers, 1990) y provoca cambios en la
morfología de las hifas que preceden a la formación de la micorriza (Giovannetti et al., 1993b).
Los flavonoides también inducen la expresión de los genes nod de Rhizobium (Dharmatilake y
Bauer, 1992; Hungria et al., 1992); la de los genes de virulencia (vir) de Agrobacterium
tumefaciens (Winans, 1992)(1193); la de genes responsables de la reacción de hipersensibilidad
y patogeneidad (hrp) de Erwinia amylovora (Wei et al., 1992)(1193) y de Pseudomonas
solanacearum (Arhat et al., 1992)(1193). Algunos microorganismos tienen quimioreceptores de
alta afinidad por los flavonoides de la planta huesped, dichos quimioreceptores están ligados a
expresión génica (Deacon, 1996). La liberación de estas señales parece ser bastante específica
(Giovannetti et al., 1993a).

37
Las plantas son capaces de limitar la colonización de las raíces por parte de bacterias
patógenas produciendo radicales hidroxil, aniones superóxidos y peróxido de hidrógeno (Doke,
1983; Klotz et al., 1989; Sutherland, 1991). Del mismo modo, las plantas responden a la
colonización por bacterias promotoras del crecimiento, produciendo especies de oxígeno activo
(Katsuwon y Anderson, 1989, 1990). Los fitopatógenos que contienen mayores cantidades de
enzimas capaces de reducir especies de oxígeno activo, como superóxido dismutasa, catalasa y
peroxidasa, son más efectivos como patógenos (Klotz y Hutcheson, 1992)(1141)

1.2.2. Efecto del sustrato y de las comunidades microbianas edáficas sobre la planta

Las características fisicoquímicas de los agregados orgánicos y minerales que


constituyen el suelo son un factor importante que influye en el desarrollo de las raíces, y en su
capacidad de exudación, ya que determina características como la porosidad y por tanto la
aireación, el potencial hídrico, la transferencia de calor, la disponibilidad de nutrientes y el pH.
En general el efecto rizosfera es más pronunciado en suelos arenosos que en los arcillosos y
húmicos, alcanzando los valores más altos en el caso de plantas de dunas de arena y en los
desiertos (Curl y Truelove, 1986; Lynch, 1990). Además la textura del suelo está íntimamente
relacionada con la nutrición vegetal, los cationes retenidos por el complejo adsorbente,
constituyen la fuente principal de nutrientes para la alimentación mineral de las plantas
(Duchaufour, 1978). Así mismo la biodegradación de compuestos xenobióticos, está regulada
por factores fiscoquímicos del suelo, regulando por tanto el catabolismo de estos productos por
parte de las bacterias. Los productos químicos interaccionan con parte de la matriz edáfica
aumentando o disminuyendo su biodegradabilidad (Ivarson et al., 1982; Stotzky, 1986; Knaebel
et al., 1996)(2635).
La humedad del suelo influye cualitativa y cuantitativamente en la exudación radical. El
estrés hídrico es uno de los factores que inducen la exudación radical (Curl y Truelove, 1986;
Whipps, 1990); el número total de bacterias suele ser mayor en suelos que han sufrido un
periodo de estrés, debido a que encuentran en ellos mayor cantidad de materiales orgánicos
solubles en agua procedentes sobre todo de la autolisis celular de los tejidos radicales (Martin,
1977). El estrés hídrico es también uno de los factores que afectan decisivamente en la
liberación de nutrientes asimilables, por procesos puramente físicos, estimulando la actividad
microbiana, fundamentalmente la mineralización (Walworth, 1992), lo que afecta
decisivamente a la planta.

38
Las concentraciones de O2 y CO2 varían de un suelo a otro y de una porción de suelo a
otra, dependiendo de la temperatura, humedad (Yamaguchi et al., 1967)(2198), contenido en
materia orgánica (Abrosimova y Revut, 1964)(2198), profundidad del suelo (Wood et al.,
c1993) y tipo de cultivo (Buyanovsky y Wagner, 1983)(2198). La influencia de las rizobacterias
sobre la planta depende en gran medida de que éstas encuentren óptimos de crecimiento en el
medio en el que se desarrollan, por tanto, variaciones en la concentración de estos gases
afectarán al crecimiento de las poblaciones microbianas y a su capacidad de biocontrol (Kim et
al., 1996)(2198). Pseudomonas fluorescens, por ejemplo, bajo altas concentraciones de CO2,
sintetiza menos sideróforos (Kim y Misaghi, 1992)(2198).
En el suelo conviven gran cantidad de microorganismos, como bacterias, hongos,
actinomicetos, protozoos y algas (Paul y Clark, 1989)(1141). Las modificaciones en la
abundancia de microorganismos, o en las proporciones relativas de grupos individuales, afectan
a la planta a través de las transformaciones de la materia orgánica y de los compuestos
minerales que éstos sinteticen. De todos estos grupos, el más abundante es el constituido por las
bacterias, posiblemente por ser capaces de crecer más rápidamente y por poder utilizar una gran
variedad de compuestos como fuentes de carbono y de nitrógeno. Las bacterias se localizan en
la superficie de las partículas del suelo, pudiendo interaccionar con las raíces de las plantas. De
hecho, la concentración de bacterias entorno a las raíces, es mucho mayor que en el resto del
suelo (Lynch, 1990)(1141). Esto refleja la alta concentración de nutrientes en esta zona, que
permite un elevado crecimiento y metabolismo bacteriano.
La colonización de las raíces es el primer paso de la interacción planta-microorganismo.
La acción de las bacterias depende de su capacidad para establecerse en la rizosfera (Simons et
al., 1996)(2360). Estudios sobre la colonización microbiana de las raíces indican que las
bacterias se distribuyen irregularmente en el rizoplano en función del tipo de planta, del suelo y
de las especies de microorganismos (Asanuma et al., 1979). La estructura tanto física como
biológica de esta zona y los factores que afecten a su funcionamiento, tienen un efecto decisivo
sobre el desarrollo del vegetal.
Puesto que la microflora está íntimamente relacionada con el sistema radicular,
cubriendo parcialmente su superficie, cualquier sustancia beneficiosa o tóxica producida puede
causar una respuesta fisiológica inmediata y profunda. La interacción entre bacterias y raíces
puede ser beneficiosa, perjudicial o neutra para la planta, y en ocasiones, como ya hemos
comentado, el efecto de una bacteria determinada varía según las condiciones del suelo (Lynch,

39
1990). Por ejemplo, una bacteria fijadora de nitrógeno, resulta beneficiosa bajo condiciones de
escasa disponibilidad de este elemento, pero no en suelos abonados.
Las bacterias que favorecen el crecimiento de las plantas se pueden clasificar en dos
tipos, aquellas que establecen simbiosis con determinadas especies de planta (de las que ya
hemos hablado en el apartado 1.1.1.2) y las edáficas de vida libre (Kloepper et al., 1988;
vanPeer y Schipers, 1989; Fremmel et al., 1991)(1141). A las bacterias beneficiosas de vida
libre se las denomina PGPRs (Plant Growth Promoting Rhizobacteria)(Kloepper et al.,
1989)(1141) o YIB (Yield Increasing Bacteria)(Piao et al., 1992; Tang, 1994)(1141). Dentro de
las PGPRs encontramos bacterias pertenecientes a distintos géneros bacterianos como
Azotobacter, Acetobacter, Azospirillum, Burkholderia, Pseudomonas y Bacillus (Brown, 1974;
Elmerich, 1984; Kloepper et al., 1988, 1989; Bashan y Levanony, 1990; Tang, 1994; Okon y
Labandera-González, 1994; Probanza et al., 1996)(1141). Al tratar la planta con la PGPR, ésta
crece mejor, tiene un mejor aparato radical y en general es una planta más sana. Generalmente
se asume que para que una bacteria tenga un efecto sobre una planta, debe estar íntimamente
ligada a su raíz de la planta (Wiehe y Höflich, 1995)(1422). Esta afirmación, aunque en la
mayoría de los casos es cierta, no resulta un requisito indispensable (Murty y Ladha, 1988;
Hong et al., 1991b)(1141).
Las PGPRs pueden afectar al crecimiento de la planta de forma directa o indirecta:
indirecta, evitando o previniendo el ataque de organismos patógenos y directamente a través de
la síntesis de distintos compuestos. Los mecanismos de estimulación del crecimiento vegetal
por parte de estas bacterias son: la mobilización de nutrientes (Lifshitz et al., 1987; Zhoinska et
al., 1992)(989), estimulación del crecimiento de raíces mediante la producción de fitohormonas
(Müller et al., 1988; Bothe et al., 1992)(989) o la producción de sideróforos (Kloepper et al.,
1980; Leong, 1986) y antibióticos (Haas et al., 1992)(989). La producción de sideróforos y
antibióticos permite además a las PGPRs competir satisfactoriamente con patógenos y otras
bacterias saprofíticas (Weller, 1988)(989).
Las moléculas de sideróforos secretadas por las PGPRs quelan la mayor parte del Fe3+
presente en el suelo, y esto evita que los patógenos proliferen debido a la carencia de este
nutriente (O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141). La bacteria que sintetiza el sideróforo, toma el
complejo hierro-sideróforo mediante un receptor específico localizado en la membrana
bacteriana (O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141). Las plantas no se ven afectadas por el secuestro
de hierro por parte de las bacterias, ya que la mayoría de las plantas son capaces de crecer en
medios con concentraciones de Fe3+ mucho más bajas que los microorganismos (incluso 1000

40
veces menores) (O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141). Además, algunas plantas son capaces de
capturar el complejo sideróforo-hierro (Crowley et al., 1988; Bar-Ness et al., 1991, 1992; Wang
et al., 1993)(1141). La capacidad de los sideróforos para actuar como supresores de patógenos
depende de la planta, el fitopatógeno a eliminar, la composición del suelo, la bacteria PGPR y la
afinidad del sideróforo por el hierro (Glick, 1995)(1141).
Si el efecto de la PGPR fuese únicamente suministrar Fe3+ a la planta, su efecto positivo
en el crecimiento de la misma variaría según las concentraciones de hierro presente en el suelo.
Sin embargo, no es así, por tanto el sideróforo bacteriano debe contribuir a la nutrición de la
planta, aumentando su crecimiento, aunque en la mayoría de los casos este efecto sea pequeño
(Glick, 1995)(1141). Estos fitosideróforos son útiles también en casos de déficit de aluminio o
intoxicación por aluminio (Gardner et al., 1983; Hoffland et al., 1989; Miyasaka et al., 1991;
Takagi et al., 1984). La unión de estos fitoquelantes (como ácidos orgánicos) con cationes es lo
suficientemente eficaz como para formar complejos que puedan ser luego reabsorbidos por la
raíz (Mori et al., 1991); se liberan malato y citrato en grandes cantidades y forman quelatos con
metales en suelos calizos, que puede ser un mecanismo para proporcionar nutrientes a la raíz en
casos de deficiencia o toxicidad. Se ha comprobado que los ácidos orgánicos son capaces de
movilizar manganeso (Godo y Reisencuer, 1980; Uren, 1982)(PUBL LU), fósforo, y hierro,
siendo los dos ácidos grasos mencionados más eficientes a la hora de movilizar este último
nutriente (Strom et al., 1994)(lu). En suelos calcáreos se observan síntomas causados por la falta
de nutrientes, debido a la baja solubilidad de óxidos e hidróxidos en solución, la liberación de
quelantes puede jugar un importante papel en el aumento de la disponibilidad de nutrientes. En
este sentido, las bacterias capaces de liberar ácidos orgánicos parecen tener una importancia
decisiva, ya que las plantas no son capaces de liberar vía exudación este tipo de compuestos en
estos suelos (Strom et al., 1994)(lu).
Otra propiedad de algunas bacterias, es la capacidad de controlar patógenos mediante
antagonismos o competencia (Burr y Caesar, 1984; Schroth et al., 1984; Gaskins et al., 1985;
Davison, 1988). Muchas bacterias y en particular Pseudomonas y Bacillus son capaces de
controlar patógenos, sobre todo hongos, sintetizando pequeñas moléculas que son antifúngicos
como la pirrolnitrina, pioluteorina, tropolona, etc. (Howell y Stipanovic, 1979; Howell y
Stipanovic, 1980; Lindbergh, 1981). Sin embargo, algunas bacterias del género Pseudomonas
son capaces de inducir resistencia por parte de la planta, incrementando la velocidad y los
niveles de síntesis de compuestos fenólicos en el tallo, llamados fitoalexinas (Lemanceau y
Alabouvette, 1993)(653). La señal responsable de la inducción de resistencia y del aumento de

41
acumulación de fitoalexinas está inducida por los lipopolisacáridos de la bacteria (Lemanceau y
Alabouvette, 1993)(653). Otro posible mecanismo de acción para reducir la actividad patógena
de hongos es la detoxificación del ácido fusárico (Harbone, 1983)(653)
Otros mecanismos empleados por las PGPRs para controlar la actividad de los
fitopatógenos son: la síntesis de antibióticos (Schnider et al., 1994)(1141); la síntesis de
cianhídrico (Voisard et al., 1989)(1141); la capacidad de hidrolizar ácido fusárico (Toyoda y
Utsumi, 1991)(1141); la producción de enzimas capaces de hidrolizar la pared de los
fitopatógenos (Lim et al., 1991)(1141); la competencia con los patógenos por nutrientes y
nichos ecológicos (Kloepper et al., 1988; O´Sullivan y O´Gara, 1992)(1141)(Devliegher et al.,
1995)(1927); la inducción de resistencia a patógenos tras tratar la planta o la semilla con la
PGPR (van Peer et al., 1991; Tuzun y Kloepper, 1994)(1141)(Tuzun y Kloepper, 1995)(1798);
Liu et al., 1995)(1350).
Por otro lado las PGPRs utilizan distintas vías para facilitar de modo directo el
crecimiento de la planta. Entre estos mecanismos podemos citar: la fijación de nitrógeno;
producción de sideróforos que proporcionan hierro a la planta; la síntesis de hormonas que
favorecen el crecimiento de la planta; solubilización de minerales como el fósforo y síntesis de
compuestos de bajo peso molecular, enzimas y moduladores del crecimiento vegetal (Brown,
1974; Kloepper et al., 1986, 1989; Davison, 1988; Lambert y Joos, 1989; Glick et al., 1994a,
1994b)(Noel et al., 1996)(1945). Cada bacteria en particular puede afectar al crecimiento de la
planta utilizando uno o varios de estos mecanismos. Por ejemplo, Azospirillum incrementa le
crecimiento de leguminosas, produciendo hormonas, aumentando la capacidad de la planta para
asimilar agua y nutrientes y favoreciendo la actividad de Rhizobium, es decir, incrementando la
cantidad de nódulos por planta (Okon y Itzigsohn, 1995)(1541).
La existencia de bacterias capaces de fijar nitrógeno tanto de vida libre como
estableciendo simbiosis con la planta se ha argumentado en puntos anteriores, así como la
existencia de plantas capaces de utilizar los complejos hierro-sideróforo de la bacteria (Crowley
et al., 1988; Bar-Ness et al., 1991, 1992; Wang et al., 1993)(1141).
El mecanismo de acción de las PGPRs más directo es la producción de fitohormonas.
(Brown, 1974; Tien et al., 1979)(1141). Algunas especies de los géneros Pseudomonas,
Azospirillum, Azotobacter y Bacillus favorecen el crecimiento de la planta mediante la
producción de ácido indol-acético (AIA), giberelinas o citoquininas en la rizosfera de las plantas
cuando éstas están en estado de plántula (Brown, 1974; Nieto y Frankenberger, 1989; Lebuhn et
al., 1994). Probanza et al.(1996), encuentra que entre las rizobacterias de aliso hay algunas del

42
género Bacillus que estimulan claramente la germinación y el crecimiento vegetal.
Posteriormente se comprobó que el efecto puede deberse, entre otros factores, a la producción
de auxinas de Bacillus (Gutierrez Mañero et al., 1996)
Otra hormona implicada en la acción de las PGPRs es el etileno. Se ha demostrado, que
Pseudomonas putida es capaz de sintetizar la 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC)
deaminasa (Jacobson,1993; Jacobson et al., 1994)(1141). Esta enzima hidroliza el ACC,
precursor inmediato de la biosíntesis del etileno en plantas. El etileno, estimula la germinación,
rompe la dormición de las semillas (Esashi, 1991)(1141) y actua sinérgicamente con otros
microorganismos como las bacterias fijadoras simbióticas (DeFreitas et al., 1993)(617) .
Existe una alta especificidad entre el genotipo de la planta y el de la bacteria con
respecto a la capacidad de la bacteria para estimular el crecimiento de la planta (Provorov et al.,
1994(1737); García de Salomone y Döbereiner, 1996)(1902).
La actividad y la supervivencia de las bacterias PGPR en la rizosfera depende de
factores físicos como pH, textura, estatus de nutrientes, humedad y temperatura, contenido en
materia orgánica y de interacciones biológicas en la rizosfera. Por este motivo, la inoculación de
PGPR en la rizosfera de diversas plantas en ocasiones, resulta errática (Germida y Walley,
1996)(2498). Sin embargo, este hecho no es del todo negativo, puesto que pequeñas cantidades
de estas bacterias pueden afectar positivamente a la planta, y además interaccionan
sinérgicamente con otros microorganismos que también promueven el crecimiento vegetal
como las micorrizas o fijadoras simbióticas.
La mayoría de las plantas se encuentran micorrizadas y el término micorrizosfera
(Rambelli, 1973)(A) se ha utilizado para describir la porción de suelo bajo la influencia de las
raíces micorrizadas. La presencia de micorrizas altera significativamente la composición física,
química y microbiológica de la rizosfera (Katznelson et al., 1962; Oswald y Ferchau, 1968;
Rambelli, 1973; Linderman, 1988), mejorando el crecimiento de la planta. Las micorrizas
benefician a la planta aumentando su resistencia a patógenos, mejorando su nutrición (sobre
todo la captación de fósforo) y protegiéndola de diversas toxinas (Harley y Smith, 1983)(A).
Algunas bacterias rizosféricas afectan al crecimiento de la planta de forma negativa, bien
causando daños en los tejidos radicales, o bien produciendo metabolitos tóxicos que inhiben el
crecimiento y desarrollo del sistema radical (Brian et al., 1951; Sarathchandra et al.,
1996)(2115). Este tipo de bacterias deletéreas denominadas DRBs (Deleterious rhizobacteria),
pertenecen mayoritariamente al género Pseudomonas (Elliott y Lynch, 1984) y han sido aisladas
de gran cantidad de ecosistemas (Woltz, 1978; Suslow y Schroth, 1982)(2115). Estas bacterias

43
inhiben el crecimiento de raíces, mediante la producción de metabolitos extracelulares tóxicos
(Woltz, 1978; Fredrickson y Elliot, 1985)(2115), aunque también pueden reducir los índices de
germinación (Probanza et al., 1996), provocar lesiones en las raíces, aumentar la sensibilidad de
la planta al ataque de patógenos, y reducir la formación de pelos radicales (Elliott y Lynch,
1985)(2115). La mayoría de las toxinas producidas por las DRB son metabolitos secundarios de
bajo peso molecular (Durbin, 1983; Bolten et al., 1989)(2115). Sin embargo Bolten y Elliott
(1989) sugieren que los metabolitos producidos por diversas Pseudomonas, que inhiben el
crecimiento de las raíces, no están bajo el mismo control que el resto de los metabolitos
secundarios. Estos metabolitos suelen ser compuestos de bajo peso molecular (Bolten et al.,
1989)(2115). El efecto de estas bacterias en condiciones de campo, no suele detectarse, ya que
no provocan síntomas identificables en las plantas, pero sin embargo reducen
considerablemente la producción vegetal (Sarathchandra et al., 1996)(2115).
Por otro lado, aunque en el suelo existen bacterias patógenas para las plantas, los
patógenos más importantes desde un punto de vista agrícola son hongos, como los
pertenecientes a los géneros Fusrium, Pythium y Rhzoctonia (Glick, 1995)(1141).

1.3. Vicia villosa Roth.


El Género Vicia está encuadrado taxonómicamente en el Orden Fabales, dentro de la
Familia Fabaceae. Este Género comprende cerca de 140 especies, que se distribuyen en Europa,
Asia, NorteAmérica, Sudamérica y este de África (Kupicha, 1981)(1238). Las relaciones
infragenéricas se han estudiado clasificándose en dos Subgéneros: Vicilla y Vicia, y cada
Subgénero se divide en 17 y 5 secciones respectivamente (Kupicha, 1976, 1981)(1238).
Vicia villosa es una planta herbácea de duración anual o bienal, y en raras ocasiones
perenne o vivaz. Posee indumento desde densamente peloso hasta casi lampiño. Los tallos son
angulosos, poco consistentes, ramosos y trepadores, pueden alcanzar hasta 1.5 m de longitud.
Las hojas llevan entre 5 y 10 pares de foliolos y terminan en zarcillos ramosos que
utilizan para apoyarse en soportes. Los foliolos son desde linear-lanceolados hasta aovado-
alargados y miden entre 15 y 25 mm. Las hojas poseen estípulas pequeñas, las superiores
lanceoladas y enteras y las inferiores semisagitadas y más o menos desgarradas.
Las flores se agrupan en racimos laxos y unilaterales y llevan entre 3 y 30 flores, estas
miden entre 12 y 20 mm, abriéndose todas casi a la vez. Los estilos son dorsalmente
comprimidos y en manojos abaxiales (Endo y Ohashi, 1995)(1237). El cáliz tiene los dientes
muy desiguales, los inferiores son mucho mas largos que los superiores. La corola es lampiña

44
tres veces más larga que el cáliz y con los pétalos provistos de largas uñas de tonalidad
blanquecina; el limbo del estandarte es marcadamente más corto que la uña y por lo común
teñido de violeta; las alas son casi de igual longitud que el estandarte, pero su tonalidad es más
clara.
La legumbre está pediculada y en su ápice tiene un pico bien marcado procedente de los
restos del estilo agrandado y endurecido. Tiene forma linear-oblonga, con una longitud de entre
20 y 40 mm y una anchura de 5 a 9 mm, es aplanada, lampiña y oscuramente reticulada, de
coloración marrón; contiene de 2 a 8 semillas que vienen a medir entre 3 y 4 mm de diámetro.
Florece de abril a septiembre, siendo una planta de polinización cruzada (Zhang y
Mosjidis, 1995)(2327). Una floración temprana es una característica importante para la
producción de cultivos en los ambientes mediterráneos (Siddique et al., 1993; Loss y Siddique,
1994)(2327). En condiciones naturales se encuentra en campos de cereales o en estaciones
ruderales, aunque también se cultiva artificialmente.
Se considera especie endémica de la región mediterránea y tal vez de la Europa
suboriental, pero en la actualidad se ha difundido por gran parte de Europa alcanzando la mitad
meridional de la Península escandinava y también las zonas más extremas del Africa
septentrional y del Asia occidental (Guinea, 1953).
V. villosa presenta diversas ventajas frente a otras especies de leguminosas como:
producir gran cantidad de biomasa y soportar mejor el frío intenso y otras condiciones de estrés
que otras leguminosas como Trifolium hirtum (Volseky et al., 1996).(2477); estar adaptadas a
un alto rango de pH desde 5 a 8 (Siddique y Loss, 1996)(2327); ser más tolerante a
enfermedades producidas por ácaros del suelo, bastante frecuentes en continentes como
Australia, que otras especies de Vicia (Siddique y Loss, 1996). (2327).

1.3.1. Características nutritivas de V. villosa

Muchas especies del género Vicia se han utilizado para consumo animal desde
tiempos remotos debido a su elevado poder nutritivo y a su resistencia en condiciones
extremas. Sin embargo, su uso se ha visto restringido en alimentación animal debido a la
presencia de alcaloides tóxicos. Existe variación genética en la concentración de compuestos
tóxicos en las vezas (Siddique y Loss, 1996)(2327).
Los efectos tóxicos de los alcaloides no son acumulativos, y éstos son rápidamente
excretados por el riñón. Por lo tanto se pueden consumir grandes cantidades de Vicia siempre

45
que la cantidad de alcaloides no exceda un nivel determinado. Las semillas de V. villosa son
aptas para la alimentación de ganado, ya que contienen menos de un 2% de canavinina
(Enneking, 1995)(2327).
Los alcaloides juegan un papel muy importante para las plantas, ya que estos actúan
como defensas contra la infección por bacterias, hongos y contra la predación por herbívoros
(Wink, 1992; Wink et al., 1995). La gran diversidad estructural de los alcaloides, reduce las
posibilidades de que los herbívoros creen resistencia a todos ellos aumentando de este modo
su toxicidad (Wink, 1993; Schmeller, et al., 1994).
Las leguminosas tienen un alto contenido en azúcares (más de un 50%) y la energía
por unidad de peso es parecida a la de los cereales (Ranalli, 1995)(1449).
Uno de los factores que limita el consumo de leguminosas, es su capacidad para
producir gas en el tracto gastrointestinal. Trabajos antiguos (Lienner, 1980) muestran que
tanto en animales como en el hombre, la ingesta de leguminosas produce grandes cantidades
de gas en el intestino, compuesto en proporciones variables de anhídrido carbónico,
hidrógeno y metano en menor cuantía. De estos estudios se concluye que los causantes de la
flatulencia son los α-galactósidos: rafinosa, estaquiosa, verbascosa y ajucosa, que se
acumulan en el intestino grueso, donde son utilizados por las bacterias anaerobias en su
metabolismo, dado que por la ausencia de enzimas hidrolizantes no pueden ser degradados en
el tracto intestinal. Son estos gases los responsables de la flatulencia que se manifiesta en
forma de nauseas, contracciones musculares, diarreas y malestar general.
Parece que existen otros compuestos que pueden tener un efecto sinérgico. Así,
pectinas, glucanas, hemicelulosa, celulosa y ligninas aunque no son digeribles, pueden ser
utilizadas por microorganismos en el intestino grueso produciendo gases al fermentar
(Fleming, 1981).
Las semillas de leguminosas normalmente contienen carbohidratos de bajo peso
molecular, como oligosacáridos de rafinosa y sacarosa. Estos compuestos son metabólicamente
importantes como reservas de energía y su síntesis y acumulación varía con las condiciones
ambientales. Sin embargo, se han descrito pequeñas diferencias en el tipo de carbohidratos y en
su estabilidad (Hymowitz et al., 1972; Yasui et al., 1985). En todas las especies de Vicia
aparecen: sacarosa, almidón, verbascosa y galactosa, siendo la sacarosa el azúcar que predomina
en las semillas de V. villosa. Derivados galactosil y pinitol se encuentran en bajas cantidades en
V. villosa (Yasui et al., 1987)(1238)

46
La fibra está constituida por celulosa, hemicelulosa, lignina y pectinas (Selvendran y
Robertson, 1990). El análisis de este parámetro es necesario en cuanto que refleja la porción
de Vicia que no es digerida, y desde un punto de vista nutricional también da una idea de la
calidad del mismo (Jung y Allen, 1995). Existen distintos trabajos donde se indica que un
elevado contenido de fibra en la dieta disminuye la digestibilidad de la materia orgánica
(Loewe y Meyer, 1974; Smolders et al., 1990; Olsson y Ruudvere, 1995), por lo tanto es un
aspecto económico importante puesto que incide en el gasto en pienso para el ganadero y en
la productividad animal (Jung y Allen, 1995). La digestibilidad de la materia orgánica está
relacionada positivamente con el contenido citoplasmático celular y negativamente con los
constituyentes de la pared celular, principalmente lignina (Demarquilly y Jorriege, 1981). Es
precisamente la lignina la que limita la digestibilidad de la pared celular, protegiendo a los
polisacáridos de la acción enzimática (Jung y Deetz, 1993). Una alternativa para aumentar la
digestibilidad de la dieta es tratarla previamente con enzimas tipo celulasa, hemicelulasa o
pectinasa que disminuyan el contenido en fibra (Muck, 1993; Weinberg et al., 1995). Van
Soest (1994) concluye que el contenido en fibra de la planta aumenta con el desarrollo de la
misma al mismo tiempo que su digestibilidad va disminuyendo.

1.3.2. Usos de V. villosa

Más de 20 cultivos de grano se cultivan en el mundo como fuentes de proteínas; estos


cultivos corresponden con 8 familias incluyendo mono y dicotiledóneas. Se encuentran especies
en distintas áreas geográficas y climáticas incluyendo zonas templadas, tropicales húmedas,
áridas, tierras altas, sabana y tierras bajas (Ranalli, 1994). 1449.
Los cultivos ricos en proteínas se dividen en dos: semillas oleaginosas, que
proporcionan alimento rico en proteínas tras la extracción del aceite y semillas de leguminosas
que se consumen enteras o molidas. Las leguminosas de grano contienen un 25-30% de
proteínas y normalmente menos de un 2% de aceite (Ranalli, 1994). 1449
Por otro lado, a partir de la reforma de la PAC aprobada en Consejo de Mayo 1992, la
gestión del mercado de proteaginosos entre las que se encuentra la veza, ha sufrido una fuerte
transformación pasando al régimen de apoyo en la producción de cultivos herbáceos. Así la
producción de proteaginosas ha pasado de 2.9 millones de toneladas en 1987-88 a 5.6 millones
de toneladas en 1993-94 y pese a todo, en 1992 la CE importó casi un millón de toneladas. El
92% de la producción de leguminosas de la CE se obtiene de España. En el marco de las

47
modificaciones introducidas por el Consejo de Ministros en los actuales regímenes de apoyo a
los productores para lograr el objetivo de que a medio plazo se cultiven en España 280.000 ha
más de estos productos.
Las vezas tienen un considerable potencial como leguminosas de forraje y como cultivo
de grano (Siddique y Loss, 1996).2327.
Por todos estos motivos V. villosa es una de las plantas más utilizadas en Estados
Unidos en los llamados cultivos de invierno (Guinea, 1953). Namoi es una variedad de floración
tardía y produce pocas semillas y un bajo índice de cosechado, y sin embargo es más apropiada
para el pastoreo y la producción de heno.
Esta planta se usa para la nutrición del ganado, como suplemento de otras leguminosas
de grano para el pastoreo de rumiantes y ovejas y comida para cerdos sustituyendo a otras
leguminosas de grano en un porcentaje de 10-20%.
Debido a un aumento en el uso de fertilizantes químicos, en la actualidad existen
excelentes razones para incrementar la producción de leguminosas fijadoras de nitrógeno, ya
que la fertilidad residual de un cultivo de leguminosas es de entre 40-50kg N ha-1 (Ranalli,
1994). 1449. La rotación de cultivos con leguminosas anuales proporciona nitrógeno a los
cultivos de cereal creciendo en rotación con ellos debido a la fijación de nitrógeno (Wright,
1990; Green y Biederbeck, 1995)2079. El manejo de sistemas agrícolas intensivos depende de
la adición de fertilizantes agrícolas para mantener las cosechas. Con estos sistemas de
producción, las capacidad del suelo para retener nitrógeno disminuye con la disminución de
carbono orgánico como resultado de menores entradas de restos vegetales y la aceleración de la
descomposición de los restos provenientes de la siega. El nitrógeno residual de los fertilizantes
puede pasar a óxidos de nitrógeno por desnitrificación y al lavado de nitratos con la
contaminación de aguas que esto conlleva. Por tanto, para reducir la erosión, mejorar la
estructura del suelo, los ciclos de nutrientes, los procesos microbiológicos y reducir las
contaminaciones, se están buscando otros sistemas alternativos como los cultivos mixtos y
cultivos de cobertura que aportan cantidades significativas de nitrógeno al cultivo principal
(Vigil et al., 1991) y reducen las pérdidas de este nutriente por lavado (McKenney et al.,
1993).615.
Como resultado de su capacidad para fijar nitrógeno en simbiosis con Rhizobium y su
alto valor nutritivo V. villosa suele utilizarse en rotación de cultivos (Holderbaum, 1990;
Wagger, 1989b; Blevins, 1990). El cultivo de maíz con V. villosa, aumenta el cultivo en un
123%. En suelos con textura media con alto contenido en materia orgánica, la rotación de

48
cultivos contribuye substancialmente al efecto positivo de un cultivo previo de leguminosas en
el cultivo de maíz (Stute y Posner, 1995)(1356)(papel aparte).
Un inconveniente de la rotación de cultivos es que los frutos de esta planta se abren y la
semilla germina en el cultivo siguiente. Este problema puede ser solventado con el uso de
herbicidas. Sin embargo si el cultivo siguiente es de leguminosas, no existen herbicidas
específicos para eliminar solo a la veza. (2327).
Uno de los usos más extendido de esta especie es la de cultivo mixto con cereal
(Anderson, 1975; Bull y Mayfield, 1992)2327. Varios cultivos anuales se han evaluado en
cultivos mixtos (Creamer, 1994), así como en monocultivos (Abdul-baki y Teasdale, 1993b;
Stivers y Shennan, 1991). Se ha observado que el cultivo mixto de V. villosa con tomate tiene
un efecto beneficioso sobre éste último. Las cosechas eran superiores y la calidad del fruto era
superior que en cultivos convencionales, lo que supone en una mayor ganancia económica
(Kelley et al., 1995). Reynolds et al. (1994) comprueban cómo en cultivos mixtos de cereales
con leguminosas, en lugares con contenidos en nitrógeno bajos en el suelo, la producción de
cereal no se veía afectada por la presencia de la leguminosa; sin embargo, se demuestra que el
transporte de nitrógeno hasta el cereal es más eficaz en presencia de la leguminosa que si se
fertiliza el cultivo con fertilizantes químicos. Esto se debe a la conexión directa que existe entre
la raíz de la leguminosa y la del cereal a través de las micorrizas fúngicas. Este dato se refleja en
la cantidad de proteínas que se encuentra en los granos del cereal en cultivos con leguminosas y
sin ellas.
Otro sistema alternativo, es el uso de cubiertas orgánicas. Este sistema consiste en
sembrar una leguminosa de cobertura y una vez florecida, segarla dejando el residuo sobre el
suelo, residuo que formará una cubierta orgánica. La cobertura orgánica reduce la erosión del
suelo, la necesidad de fertilizantes, aumenta la cantidad de materia orgánica, incrementa la
capacidad de retención hídrica y reduce la competencia por malas hierbas y la necesidad de usar
herbicidas (Abdul-Baki y Teasdale, 1993). El uso de cobertura orgánica en lugar de polietileno
negro, generalmente proporciona mejores cosechas y retrasa la producción, con lo cual ésta
coincide con los precios más altos de la temporada. Las Vicias, al fijar nitrógeno proporcionan
este elemento a los cultivos siguientes, con lo cual se puede reducir e incluso eliminar el uso de
fertilizantes. Además el uso de polietileno es caro y presenta la desventaja de su eliminación
(Servis, 1992). La combinación de mejoras ambientales así como económicas hacen de la
cobertura con V. villosa un sistema alternativo atractivo para el cultivo de otras plantas como el
tomate (Kelly et al., 1995). (1571).

49
V. villosa se ha usado como cobertura en cultivos de tomate aumentando
significativamente la producción y por tanto los beneficios económicos. Los costes de
producción de este tipo de cultivo son mayores puesto que hay que pagar la semilla y su
cosechado. Sin embargo, los beneficios debidos a una mayor cosecha de tomate, así como la
reducción de la fertilización nitrogenada compensan los costes de producción. En un suelo sin
Vicia, usando fertilizantes podríamos conseguir producciones parecidas y a un coste similar, sin
embargo los niveles de fertilizantes excederían los recomendables y aumentarían la
contaminación. V. villosa, aparte de introducir nitrógeno en el sistema, actúa de forma
beneficiosa mejorando la estructura del suelo y la eficiencia en el uso del agua (Decker et al.,
1994). Los resultados eran mejores que en cultivos bajo cobertura de polietileno negro (Abdul-
Baki y Teasdale, 1993a). Con los sistemas de cobertura de V. villosa la necrosis foliar era
menor, lo que permite a las plantas mantener más tiempo su área foliar y sintetizar más
fotosintatos durante un periodo de tiempo más largo, lo que incrementa la producción (Abdul-
Baki et al., 1996). (2120).
Además de influir en la fertilidad del suelo, los residuos de leguminosas de invierno
influyen en las poblaciones de malas hierbas en tierras sin labrar por su proximidad a la
superficie del suelo, zona donde germinan las semillas. La cobertura orgánica reduce la cantidad
de radiación que llega al superficie del suelo, baja la temperatura máxima del mismo pero tiene
poco efecto en la temperatura mínima (Hoyt y Hargrove, 1986; Bristow, 1988; Fortin y Pierce,
1991). Además la cubierta mantiene la humedad del suelo en niveles más altos que el suelo
desnudo (Hoyt y Hargrove, 1986; Bristow, 1988). La humedad del suelo y la temperatura son
parámetros relacionados, ya que la radiación recibida por el suelo, no empieza a calentar hasta
que la demanda de evaporación no se satisface (Bristow, 1988). La germinación de las semillas
de malas hierbas esta afectada por la magnitud y las fluctuaciones de temperatura y humedad
(Egley, 1986). Por lo tanto los cultivos de cobertura influyen en la germinación de malas hierbas
a través de la temperatura y la humedad del suelo, así como a través de la luz (Teasdale y
Mohler, 1993). (682). Las temperaturas del suelo bajo V. villosa no se reducen lo suficiente
como para evitar la germinación de las semillas de malas hierbas, como mucho retrasan la
germinación. Esta planta tiene una mayor influencia en la germinación de malas hierbas a través
de la reducción de la amplitud entre la temperatura máxima y mínima diaria. Algunas semillas
necesitan una amplitud de por lo menos 10°C para germinar. (601). Estas plantas también
reducen, retardan o en ocasiones favorecen la emergencia de malas hierbas ya que alteran las

50
condiciones físicas y por tanto los micrositios de la germinación de semillas (Teasdale y
Mohler, 1993). (682)
La producción de biomasa de esta planta oscila entre 2140 y 9010 kg ha-1 en la
primavera, indicando la potencialidad de esta leguminosa para suprimir malas hierbas a través
de la competencia durante el crecimiento en primavera y a través de la cobertura que ofrece tras
la senescencia (Holderbaum et al., 1990; McVay et al., 1989). Además sustancias producidas
por los residuos de V. villosa parecen producir procesos alelopáticos que interfieren en la
germinación de las semillas de malas hierbas (White et al., 1989; Bradow y Connick,
1990).(662). En estos sistemas aparecen gran cantidad de insectos, babosas y culebras que se
alimentan de parte de las plántulas de las malas hierbas. 648
V. villosa viva elimina más malas hierbas que cuando se usa residuo seco (Teasdale y
Daughtry, 1993). Sin embargo, esta planta se descompone relativamente rápido, por lo que
permite que emerjan, más tarde, muchas de estas plantas. Teasdale et al. (1991) observan que al
aumentar los niveles de V. villosa reducen linealmente la densidad de malas hierbas. (684).
La utilización de leguminosas como abono verde proporciona al suelo ganancias de
nitrógeno(por fijación), mejora su conservación y disponibilidad y supone una cubierta contra la
erosión del agua y del viento. Este abono puede sustituir a los fertilizantes comerciales en los
sistemas agrícolas (Welty et al., 1988; Andrén et al., 1990; Follett et al., 1991; Hargrove, 1991)
y se ha propuesto como estrategia de manejo para sistemas con bajas entradas de nutrientes y
para tierras marginales (Vlek et al., 1981; Biederbeck, 1990).2079. El uso de cultivos de grano
de leguminosas como abono verde es un modo de reducir la cantidad de fertilizantes
nitrogenados en la producción de maíz (Stute y Posner, 1995)(1356)(papel aparte). Cerca de un
20% del nitrógeno de las leguminosas es captado por el primer cultivo, tras el abonado, pero los
beneficios persisten en cultivos posteriores (Ladd et al., 1983; Ladd y Amato, 1986; Janzen et
al., 1990). Además el abono verde va haciéndose disponible gradualmente para cultivos
posteriores, lo que contrasta con la disponibilidad del nitrógeno comercial (Groffman et al.,
1987; Jans-Hammermeister et al., 1994b).2079. Estudios que comparan la respuesta de un
cultivo de no leguminosa que sigue a uno de leguminosa con la respuesta a distintas
concentraciones de nitrógeno comercial indican que los beneficios del abono verde con
leguminosas es mayor que el predicho por las estimas de 15N (Welty et al., 1988; Badaruddin y
Meyer, 1990; Blevins et al., 1990; Utomo et al., 1990)(2079).

1.4. Plan de trabajo y objetivos

51
Las modificaciones de distintas características edáficas (fisicoquímicas y
microbiológicas) que se dan en torno a plantas diazotrofas han sido objeto de distintos estudios
previos (Gutiérrez Mañero, 1987; Llinares, 1990; Probanza, 1991 y Pozuelo, 1991; Probanza,
1994). La mayor parte de estos estudios se han centrado en los efectos de la planta sobre el suelo
circundante a diferentes distancias y profundidades de la misma, estudiando los
microorganismos de los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y sus actividades potenciales.
En la presente memoria se estudia el efecto de V. villosa sobre su rizosfera, las
características bióticas y abióticas de la misma y el efecto de bacterias rizosféricas de
poblaciones naturales de V. villosa sobre la germinación y crecimiento de dos variedades
comerciales de esta especie.
El objetivo fundamental de este estudio sobre el que convergen todos los que a
continuación se desglosan, es el poder ofrecer un plan de manejo que optimice la producción
aprovechando las características productivas de la planta y su influencia sobre el sustrato
edáfico. Al mismo tiempo el estudio del sistema rizosférico pretende aprovechar la posible
adaptación de las bacterias rizosféricas de V. villosa al sistema rizosférico de esta,
previsiblemente resultado de procesos de coevolución, para seleccionar cepas PGPRs con futura
aplicación biotecnológica que permiten mejorar las técnicas de producción. Este último aspecto
enlaza con el anterior conduciendo a un estudio integral de la planta con su medio para
desarrollar técnicas dirigidas hacia una agricultura sostenible.
Por todo ello el trabajo está estructurado en dos partes diferenciales.

Dirección suelo-planta:
1. Estudio de las bacterias asociadas a la rizosfera de V. villosa, creciendo en
poblaciones naturales. Se estudió su composición taxonómica a nivel de género y grupos
fisiológicos del ciclo del nitrógeno a los que pertenecen y la variación a lo largo del ciclo
fenológico de la planta.
2. Estudio de la diversidad genética de las bacterias pertenecientes a los géneros
bacterianos mayoritarios de cada momento de muestreo.
3. Efecto de los metabolitos producidos por las bacterias mayoritarias sobre la velocidad
y tasa de germinación.

52
4. Efecto de los metabolitos producidos por las bacterias mayoritarias sobre el
crecimiento de la veza. Efectos sobre plantas pertenecientes a la variedad Namoi y Látigo
(nitrógeno total y distintos parámetros biométricos de la parte aérea y radical de las plantas).

Dirección planta suelo:


1. Estudios en condiciones de laboratorio para conocer el efecto que dos variedades
comerciales de Vicia villosa tienen sobre los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y sobre
parámetros fIsicoquímicos edáficos relacionados con dicho ciclo. Paralelamente también se
controlan parámetros biométricos de las plantas. Para todo ello se hace un seguimiento durante
todo el ciclo vital de la planta, haciendo los correspondientes análisis en tres estadíos de ésta,
vegetativo, floración y fructificación, coincidiendo los tres con actividades agrícolas
tradicionales llevados a cabo con esta planta.
La selección de las dos variedades (Namoi y Látigo) se realizó teniendo en cuenta sus
características de crecimiento y aprovechamiento diferencial de las mismas, para lo cual se
realizaron las pruebas biométricas oportunas. La hipótesis de trabajo es que dos variedades con
características en su crecimiento bien distintas demandarán nutrientes y exudarán productos
orgánicos a través de su aparato radical siguiendo patrones diferentes, lo cual podría tener su
efecto correspondiente sobre la dinámica del ciclo del nitrógeno y por lo tanto sobre la
productividad del suelo y de la planta. Estos factores junto con la variable "momento de
muestreo" en función de la etapa del ciclo vital de las plantas, suponemos que interaccionan de
manera decisiva, por lo que habría que tener en cuenta todos los factores mencionados a la hora
de hacer un balance cuyo objetivo sea decidir el momento adecuado para cosechar en función de
la variedad seleccionada.
2. Estudios en condiciones de campo para conocer el efecto que las dos variedades
comerciales de V. villosa tienen sobre los grupos funcionales del ciclo del nitrógeno y sobre
parámetros fIsicoquímicos edáficos relacionados con dicho ciclo.
3. Paralelamente también se controlan parámetros biométricos y bioquímicos de las
plantas, para conocer las ventajas nutricionales y de producción de una y otra variedad. Para
todo ello se hace un seguimiento durante todo el ciclo vital de la planta, haciendo los
correspondientes análisis en tres estadíos de ésta, vegetativo, floración y fructificación,
coincidiendo los tres con actividades agrícolas tradicionales llevados a cabo con esta planta.

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