Sunteți pe pagina 1din 11

Bancescu Anda

Master BMBA, Anul I

Analiza postelectroforetica prin metoda Western Blot

Metoda Western blot este una din metodele de baza utilizate in laboratoarele de biologie
celulara si moleculara. Folosita corect, aceata metoda duce la rezultate usor de interpretat, unice,
lipsite de ambiguitate, care pot fi utilizate ca atare sau in completarea altor metode de
imunomarcare, in cercetare sau in diagnosticul de laborator.
1. Notiuni generale: definitia metodei, denumirea metodei
Definitie: WB, cunoscuta si sub denumirea de imunoblot, este o tehnica analitica pentru
identificarea unei proteine specifice dintr-o proba de omogenat tisular sau celular, ori din probe
biologice lichide (ser sau LCR).
Tehnica WB aduce informatii concrete si utile care nu pot fi puse la dispozitie prin alte
metode de imunomarcare.
Daca proteina, desi prezenta in proba, este moficata calitativ sau cantitativ, se poate
observa prin prezenta unei benzi mai subtiri, mai groase, pozitionata mai sus sau mai jos fata de
banda proteinei martor sau chiar prin prezenta a doua benzi in loc de una. Aceste modificari fata
de o proba martor, cu o proteina normala, ne da urmatoarele indicatii: fie proteina tinta este
degradata, fie este cantitativ redusa sau in exces, fie este glicozilata sau formeaza multimeri. De
asemenea ne poate ghida catre o investigatie genetica in cazul unei deletii partiale sau duplicatii
in gena respectivei proteine.
De asemenea metoda WB permite compararea expresiei proteinei tinta in mai multe
probe, fie in acelasi tesut, fie in tesuturi diferite, in scop de cercetare sau diagnostic, indicand
modificari patologice sau ca raspuns la un anumit tratament.
W. Neal Burnette a denumit aceasta tehnica, in 1979, ca un joc de cuvinte derivat de la
tehnica Southern blot, o tehnica utilizata pentru detectarea ADN, pusa la punct de Edwin
Southern (1975). In mod similar, tehnica de detectare a ARN, a fost denumita Northern blot, iar
detectarea modificarilor post-translationale a proteinelor se numeste Eastern blot. Metoda WB a
fost pusa la punct in laboratorul prof. George Stark, la Stanford, de catre Harry Towbin si col., in
1979, iar ulterior a suferit multe modificari si imbunatatiri.

1
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

2.Principiul metodei
Pentru identificarea proteinei tinta, proteinele din proba biologica trebuie intai separate in
functie de greutatea lor moleculara prin electroforeza in gel de poliacrilamida, transferate apoi pe
un suport solid, membrana de nitroceluloza sau PVDF, urmand imunodetectia proteinei urmarite,
cu anticorpi specifici.
Odata detectata, aceasta proteina va fi vizualizata printr-una din metodele ce pot fi
utilizate in acest sens, in functie de posibilitatile si experienta laboratorului: chemiluminiscenta,
chimica, imagistica.
WB este asadar o tehnica in 4 pasi:
– Electroforeza in gel a probei care contine proteina de interes;
– Transferul electroforetic al proteinei tinta de pe gel pe membrana (Blotare);
– Imunomarcarea proteinei de interes cu anticorpi specifici;
– Vizualizarea proteinei tinta.

Fig.1 Principalele etape ale metodei Western blot: 1) Electroforeza SDS-PAGE; 2) Transferul
proteinelor de pe gel pe membrana (blotarea); 3) Imunomarcarea si Vizualizarea proteinei de
interes din probele biologice.

2
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

3. Pregatirea probelor biologice


a) Obtinerea lizatului tisular
Este esental ca probele de tesut sa fie pastrate in bune conditii, astfel incat proteinele sa nu fie
distruse. Inca de la recoltarea probelor biologice, acestea trebuie pastrate la rece, pe gheata, in
timpul transportului si manipularii, pentru a reduce la maxim proteoliza, defosforilarea sau
denaturarea proteinelor.
- Tesutul se omogenizeaza astfel incat proteinele celulare sa fie eliberate si solubilizate. Se
utilizeaza o solutie tampon de liza, care contine obligatoriu inhibitori de proteaze si/sau
fosfataze, in care se omogenizeaza tesutul, cu ajutorul unui omogenizator. Raport optim:
1-5 mg tesut/1 ml tampon de liza.
- Centrifugare la 40C, 20 minute, la 12.000 rpm.
- Se recolteaza supernatantul. Se pastreaza timp timp de 2-3 luni la -200C sau pentru mai
mult timp la -800C.
b) Obtinerea lizatului celular
- Celulele se recolteaza din recipientul de cultura,
- se spala se centrifugheaza,
- depozitul de celule se resuspenda in tampon de liza cu inhibitori de proteaze. Toate aceste
operatii se fac pe gheata.
Denaturarea proteinelor se face pe de o parte prin fierbere (la 95-1000C, 5 minute), in
prezenta de SDS (Sodium Dodecyl Sulfat).
Se pierde structura secundara si tertiara a proteinei, se faciliteaza accesul anticorpilor la
epitopi (secventa de aminoacizi recunoscuta de anticorp). SDS este continut in reactivul
Laemmli, in solutia tampon de electroforeza (de migrare) si uneori se poate adauga si in solutia
tampon de liza (in functie de reteta utilizata).

3
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

Fig2. Pregatirea probelor biologice inainte de electroforeza: omogenizarea probei biologice in


tampon de extractie cu un omogenizator Potter; calcularea concentratiei proteice; denaturarea
termica a proteinelor.

2.2.4. Electroforeza in gel


Electroforeza SDS-PAGE, este procedeul prin care proteinele migreaza, in gel, intr-un
camp electric si se separa in functie de greutatea lor moleculara. Se utilizeaza o solutie tampon
de migrare care contine SDS si care se adauga in tancul de electroforeza.

4
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

Fig. 2 Suporturi cu geamuri montate pentru turnarea gelurilor.

Fig. 3 Electroforeza SDS-PAGE: tanc pentru electroforeza; suport cu electrozi pentru geluri.

5
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

5. Transferul proteinelor (Blotarea)


Dupa ce proteinele s-au separat pe gel, urmeaza transferul lor pe un suport mai dur si usor
de manipulat, pentru analiza lor ulterioara. Metoda de blotare in camp electric (Towbin et al.,
1979) este utilizata in cele mai multe laboratoare, fiind fiind rapida si eficienta. Campul electric
este orientat perpendicular pe suprafata gelului si membranei.
Exista doua sisteme principale de transfer al proteinelor de pe gel pe membrana:
– semi-uscat
– umed
- Gelul si membrana sunt asamblate intr-un sistem sandwich, intre hartii de filtru, eventual
bureti, care sa le protejeze si sa le mentina in contact strans. Important: plasarea
membranei sa se faca intre gel si electrodul pozitiv, astfel ca proteinele incarcate negativ
sa migreze dinspre gel spre membrana. In timpul montarii sandwich-ului trebuie sa se
indeparteze cu grija bulele de aer.
- Solutia tampon utilizata in acest caz este solutia tampon de transfer, (asemanatoare
celei de la electroforeza), dar nu contine SDS. Contine metanol, care ajuta proteinele sa
se lege de membrana.
Membranele pentru transfer sunt membrana de nitroceluloza si membrana PVDF
(polyvinylidene difluoride).Transferul se face dinspre catod spre anod. Se mentine fie amperajul,
fie voltajul constant.
Transferul umed. Se utilizeaza un tanc plin cu solutie tampon de transfer, in care se
scufunda caseta/casetele cu sandwich-ul gel/membrana/hartie de filtru/bureti, puse intr-o anumita
ordine si in conexiune cu pozitia fata de catod si anod.

In tanc se pune obligatoriu si un suport care contine gheata (in functie de tipul de suprt se
utilizeaza apa sau tampon inghetat), deoarece in timpul transferului se degaja caldura.

6
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

Fig. 3 Ordinea componentelor sandwich-ului de transfer in cazul modului de transfer


umed

Fig. 4 Transferul umed: tanc de transfer cu capac, suport cu electrozi, suport pentru
sandwich-ul de transfer alcatuit din gel, membrana, hartie de filtru si bureti.

7
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

6. Imunomarcarea

Imunomarcarea proteinei de interes se face cu anticorpi specifici.


Se pot utiliza:
- marcarea directa care utilizeaza un anticorp primar directionat contra proteinei tinta, legat
cu o substanta de marcaj.
- Marcarea indirecta, utilizeaza un anticorp primar anti-proteina tinta si un anticorp
secundar directionat contra anticorpului primar, acesta fiind legat cu substanta de marcaj.
Pasii imunomarcarii:
 Blocarea: previne legarea nespecifica a anticorpilor pe suprafata membranei,prin
incubarea cu o solutie proteica, neutra in raport cu protocolul de imunomarcare. Se
recomanda lapte degresat 5% in tampon TBS (solutie tampon TRIS), ori BSA (bovine
serum albumine) 3-5% in TBS. Pentru detectia fosfoproteinelor se recomanda
blocarea cu BSA, deoarece laptele contine fosfoproteine (caseina) care pot interfera
cu imunodetectia. Timpul de blocare: 30 minute Dupa blocare, membrana se spala cu
TBST (TBS+Tween20, un detergent), 5 min.
 Incubarea cu anticorpi specifici: se incubeaza membrana cu solutia de anticorpi
specifici (marcati sau nu), timp de 2 ore la temperatura camerei sau peste noapte la
rece. Peste membrana se toarna solutie de anticorp de detectie (diluati corespunzator
in TBS. Optimizarea dilutiei anticorpilor sa se faca de fiecare data cand se lucreaza
cu un anticorp nou).
 Pentru a intensifica semnalul, se utilizeaza anticorpi secundari cuplati cu biotina.
 Dupa incubarea cu anticorpul primar, membrana este spalata cu TBST.
 Atat blocarea, spalarile, cat si incubarea cu anticorpi a membranei trebuie facute cu
suficient reactiv cat sa spele bine membrana, pe un agitator. Membrana nu trebuie in
nici un caz sa se usuce.
 Se adauga anticorpul secundar (cuplat cu o enzima, peroxidaza, HRP “horseradish
peroxidase” sau fosfataza alcalina, AP) detectabila prin utilizarea unui substrat care
produce un semnal vizibil, sau un marker fluorescent.

8
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

 Nota: in cazul sistemului ce utilizeaza anticorpi biotinilati, se adauga o enzima


cuplata la streptavidina, care permite cuplarea la biotina de pe anticorp.

Fig.4 Detectia proteinei de interes prin imunomarcare pe membrana: incubare cu anticorpul


primar specific; incubare cu anticorpul secundar cuplat cu o enzima; vizualizarea substantei de
marcaj cu ajutorul unui substrat enzimatic.

7. Vizualizarea proteinei de interes.

Cea mai utilizata enzima ca substanta de marcaj, legata de anticorpul primar, este HRP.
HRP este detectata cand vine in contact cu o solutie cu substrat pentru aceasta enzima, un reactiv
chimic cu care interactioneaza si produce un semnal vizibil, detectabil colorimetric sau
chemiluminiscent.
Substratul pentru HRP este DAB (diaminobenzidina), care produce o culoare maro.
Detectia dureaza de la cateva minute la cateva ore, pana apar benzile vizibile – unde se afla
proteina tinta.
Alternative moderne: chemiluminiscenta, ECL (enhanced chemiluminescence).
Substratul utilizat este luminolul, care este oxidat de HRP in prezenta H2O2, producand lumina.
Aceasta este detectata prin expunera membranei unui film radiologic Timpul de detectie este

9
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

scurt, de la cateva secunde, la 30 minute (rareori mai mult). Filmul developat, poate fi pastrat
permanent, iar vizibilitatea este foarte buna.

Metoda WB aplicata in diagnosticul medical

Diagnosticul infectiilor virale


- Confirmarea testelor HIV in cazuri neconcludente
- Hepatita B
- Confirmarea testelor FIV la feline, in medicina veterinara
Diagnosticul infectiilor bacteriene
- Boala Lyme
Diagnosticul infectiilor parazitare
- Protozoare (exemple: Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum)
- Viermi (exemple: Trichinella spiralis, Fasciola hepatica, Capillaria sp.)
Diagnosticul unor boli prin detectarea proteinelor umane specifice acestora
- Encefalopatia spongiforma bovina (boala Creutzfeldt-Jakob)
- Distrofii musculare
- Unele forme de cancer

10
Bancescu Anda
Master BMBA, Anul I

BIBLIOGRAFIE

 Moore C - Introduction to Western Blotting, LIT CMr 2009 1 © MorphoSys UK Ltd


2009 All rights reserved Published by MorphoSys UK Ltd Endeavour House, Langford
Business Park, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GE, UK
 Bolt M and Mahoney P High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Anal Biochem. (1997) 247,
185-192
 Burnette W N - “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic
detection with antibody and radioiodinated protein, Anal Biochem (1981) 112, 195-203
 Hames B D and Rickwood D - Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach 3
 Rd Edition, The Practical Approach Series, Oxford University Press, 1998.
 Towbin H et al - Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl Acad Sci U S A (1979)
76, 4350-4354
 Towbin H and Gordon J - Immunoblotting and dot immunobinding--current status and
outlook, J Immunol Methods (1984) 72, 313-340

11