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DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LAS PROTEÍNAS

DE LA LECHE
Luisa Álvarez Saldarriaga1 Camila Pérez Bermúdez 2
1640034051, 1640034392
Luisa.alvarez.saldarriaga@unillanos.edu.co.,
maria.perez.bermudez@unillanos.edu.co

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS


Facultad de ciencias básicas e ingenierías
Programa de biología

OBJETIVOS
 Separar las principales proteínas presentes en la leche de vaca.
 Obtener la fracción de caseína de la leche mediante precipitación isoléctrica.

INTRODUCCIÓN
La proteína de la leche (que supone un 3-4% del peso total tiene un alto valor biológico y
esta formada por caseínas (aproximadamente un 80%) y por las proteínas del suero
(aproximadamente 20%). Las caseínas, constituidas por varios tipos de fracciones (α, k y
β-caseínas) Aparecen en forma de micelas formadas por complejos macromoleculares de
fosfoproteíns y glicoproteínas en suspensión coloidal. Por otro lado, las proteínas del suero
son proteínas solubles, principalmente, albumina y globulinas, destacando el contenido en
betalactoglobulina, alfa-lactoolbirmina, inmnoglobulinas, proteasas-peptoas y otros
compuestos nitrogenados minoritarios no específicos como lactoferrina. En cuanto al
contenido en aminoácidos de dichas proteínas, un litro de leche cubre las necesidades de
todos los aminoácids esenciales excepto de los azufrados: metionina y cisteínas
(aminoácido formado a partir del aminoácido esencial metionina), así como de fenilanina.
Además, la absorción de los aminoácidos y la digestibilidad de las proteinas de la leche son
muy altas (Aranceta & Serra, 2005)

Precipitación Isoléctrica, en las proteínas, como en los aminoácidos y cualquier molécula


anfótera, las cargas pueden ser neutralizadas de manera que la carga neta sea sea igual a
cero. Este proceso se realiza al modificar el pH del medio en el que se encuentren estas
moléculas. En el caso especial de las proteínas se alcanza el punto isoléctrico de una de
ellas, esta se precipita, mientras que el resto queda disueltas. La razón es que la
composición química de cada proteína es característica y presenta un número distinto de
gruppos ionizables que se neutralizan a diferente pH. La caseína es una de las
fosfoproteínas de la leche que se precipita a pH e 4.8. Esta propiedad se puede explotar
para purificarla simplemente al acidificar (Segal y Ortega, 2005)

Un espectrofotómetro de haz simple, funciona, de la luz que procede de una fuente se aísla
una banda estrecha de longitudes de onda con un monocromador, la cual a través de una
muestra, se mide mediante un detector. Primero se mide la irradiancia (Po W/m2) que llega
al detector después de pasar por una cubeta de referencia (un blanco de disolvente o de
reactivo), colocada en el comportamiento de muestras. Cuando la referencia se sustituye
por una muestra de interés, algo de la radiación se absorbe, y la irradiancia que incide en
el dectector (P) es menor que Po el cociente P/Po que es un número entre 0 y 1, es la
transmitancia (T). La absorbancia, que es proporcional a la concentración , es A= log Po/P=
-log T. Un espectrofotómetro de haz simple tiene inconvenientes, porque la muestra y la
referencia se deben colocar alternadamente en el camino del haz. Para medidas a distintas
longitudes de ona se debe medir a cada longitud onda. Un instrumento de haz simple es
poco indicado para medir absorbancia en función del tiempo, como en trabajos de cinética,
porque tanto la intensidad de la fuente como la respuesta del detector van variando
lentamente (Harris, 2007)

METODOLOGÍA

En un vaso precipitados de 150 ml, se


depositaron 20 ml de a muestra de leche
(entera marca alquería). Se uso el ácido
clorhídrico para estimular la precipitación de
la caseína, de la cual se agregaron una a una
a tanteo hasta que se observó formaciones
granulares (caseína), se requirieron 20 gotas
(1ml aproximadamente). Se usó un pHmetro
del cual se calibró y determino el pH de la
solución. Se requirió de 20 min hasta que la
caseína se sedimentó completamente. Se
usó papel filtro para hacer la separación
completa del precipitado (caseína) y el
sobrante (suero). Una vez separada la
caseína del suero, esta se pesó y rotuló en
un vidrio de reloj y se guardó en estufa por
cuatro horas aproximadamente. Con el
Ilustración 1.Montaje para la precipitación isoléctrica de
la caseína. suero separado, se realizó un método
colorimétrico del que se tomaron 6 tubos de
ensayo y cada uno se le adicionó 3,0 ml de reactivo de Biuret, y se agregó una solución
adicional: Al primer tubo 2,0 ml de agua destilada, al segundo 0,2 ml de albúmina y 1,8 ml
e agua destilada; al tercer tubo 0,4 ml de albúmina y 1,6 ml de agua destilada, al cuarto
tubo 0,8 ml de albumina y 1,2 ml de agua destilada, al quinto tubo 1,0 ml de albumina y 1,0
ml de agua destilada; al sexto tubo se adicionó 0,5 ml de la muestra de suero extraída y 1.5
ml de agua destilada. Para un total de 5,0 ml de solución a cada tubo de ensayo.
Posteriormente se realizó el método colorimétrico con espectrofotómetro el cual se
determinaron los valores de la absorbancia a 540 rpm y se representaron las gráficas.
Ilustración 2. Determinación de la concentración por el método de Biuret.

RESULTADOS

SOLUCIÓN BLANCO 1 2 3 4 5 MUESTRA


ABSORBANCIA 0,000 0,047 0,093 0,134 0,178 0,221 0,060
Tabla 1. Valores de absorbancia con respecto a las concentraciones de albumina.

0.3
y = 0.2165x + 0.0047
0.25 R² = 0.9998
0.221

0.2 0.178
ABSORBANCIA

0.15 0.134
Series1
0.093 Linear (Series1)
0.1

0.047
0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
CONCENTRACIÓN

Grafica 1. Cura de calibración, representa la absorbancia con respecto a la concentración de albumina


0.3
y = 0.2165x + 0.0047
0.25 R² = 0.9998
0.221

0.2 0.178
ABSORBANCIA

0.15 0.134
Series1
0.093 Linear (Series1)
0.1

0.047
0.05

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
CONCENTRACIÓN

Grafica 2. Representación de la absorbancia con respecto a la concentración de albumina, incluyendo


la muestra problema (coordenada roja)

ANALISIS DE RESULTADOS

Para las diferentes concentraciones de albumina permite realizar un gráfico de calibración


para la absorbancia (Grafica 1) que permite tomar como referencia comparar la muestra
problema, en este caso el suero obtenido a partir de la precipitación de la caseína. Para
esta curva de calibración se representó gráficamente la absorbancia de cinco muestras
frente a una concentración conocida. Entonces, teniendo en cuenta la ley de Lambert-beer
se espera que la curva obtenida de esta relación presente un comportamiento lineal, pes lo
que afirma esta ley es que “la absorbancia de una solución es directamente proporcional al
camino recorrido por la radiación electromagnética y a la concentración de la solución”
(Harris,2007), por ende si la concentración de albumina aumenta, la absorbancia debe
seguir este comportamiento.

De acuerdo con lo anterior, y los datos experimentales de nuestra curva de calibración


(Grafica 1) se cumple este parámetro. Sin embargo, al interpolar en el grafico el valor de
absorbancia de la muestra problema (Grafica 2), se observó que la curva deja de presentar
un comportamiento lineal evidente, aun cuando la medición de la absorbancia de la muestra
problema se realizó a la misma longitud de onda que fue realizada la curva de calibración,
este resultado pudo ser ocasionado por el incorrecto uso del espectrofotómetro en su
lectura de la absorbancia, debido a la contaminación propia de la celda o en la misma área
de trabajo.

CUESTIONARIO
CONCLUSIONES
 La caseína puede ser precipitada en la leche por medio de ácidos diluidos que
disminuyan el pH a 4.6
 La leche es un vehículo óptimo de transporte de sustancias liposolubles como las
vitaminas A,D y E y su contenido graso varía dependiendo de unos productos a
otros.
 La cuantificación de proteínas usando el reactivo de Biuret que es una solución
alcalina de cobre que forma un complejo de color azulado-purpura, con los enlaces
peptídicos de las proteínas, este complejo colorido tiene un máximo de absorción a
540 nm
BIBLIOGRAFIA

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