BIOTECNOLOGIA

BIO “bios” TECNOLOGIA:

BIOLOGIA: +
Ciencia que estudia la vida
“Estudia las técnicas,
herramientas
y materiales en un
proceso”

BIOTECNOLOGIA

B I O T E C N O L O G I A
ALGUNAS DEFINICIONES
¾ Uso integrado de la microbiología, bioquímica y la ingeniería para obtener
aplicaciones tecnológicas de los microorganismos, células animales, células
vegetales y de las fracciones derivadas.

¾ Consiste en la explotación industrial de microorganismos, células animales,

células vegetales y de las fracciones sub-celulares.

¾ La utilización de moléculas obtenidas biológicamente, estructuras celulares,

células u organismos para llevar a cabo procesos específicos

NUMEROSAS APLICACIONES

•Industria de fermentación •Tratamiento y valorización de sub-productos

•Industria agroalimentaria agroindustriales y de efluentes
•Industria química y farmacéutica •Producción de alcohol
•Producción de biogas

1
SE CARACTERIZA POR SU CARÁCTER INTERDISCIPLINARIO

IA
OG
OL

CA
BIOLOGIA

BI

UIMI
MOLECULAR

RO
C

BIOQ
MI BIOTECNOLOGIA

INGENIERIA

ADEMAS:
Química matemáticas
Ingeniería enzimática Informática
Ingeniería genética Automatización
Ingeniería Economía

ALGUNOS ACONTECIMIENTOS IMPORTANTES EN EL

DESARROLLO HISTORICO DE LA BIOTECNOLOGIA

AÑO ACONTECIMIENTO

AC Cerveza, pan, vino, lácteos fermentados, pescado fermentado, koji

S XVII Producción de vinagre y ácido acético(inmovilización de células)
1857 Fermentación láctica (L. Pasteur)
1908 Enzimas inmovilizadas sobre carbón
1916 β-D-fructofuranosidasa inmovilizada sobre alúmina
1917 Karl Ereki acuña el término biotecnología
1928 Primer transplante de nucleo en células embrionarias de salamandra
1935 Cultivo in vitro de tejidos vegetales
1940 Se crea la escuela de ingeniería biológica en el MIT
1943 Producción industrial de penicilina
1952 Clonación de sapos mediante transplante de núcleos
1953 Se determina la estructura del DNA (Watson y Crick)
1958 Regeneración de plantas a partir del cultivo de tejidos
1961 Publicación de Biotechnology and Bioengineering
1961-6 Se descifra el código genético .....

2
AÑO ACONTECIMIENTO

1963 J.B.S. Haldane acuño el término CLON

1964 Transformación de esteroides por células inmovilizadas
1967 Uso industrial de glucosa isomerasa inmovilizada
1967 Se aísla la DNA ligasa
1969 James Shapiero y Johnathan Beckwith aislaron el primer gen
1970 Howard Remin y David Baltimore, aislaron la primera enzima de restricción
(transcriptas inversa)
1972 Khorana y col. Sintetizan un gen de RNAt
1972 Paul Berg crea la primera molécula de DNA recombinante
1973 Stanley y Cohen y Herbert Boyer crean el primer organismo
recombinante (E. Coli)
1975 Kholer y Milnstein describen la producción de anticuerpos monoclonales
1976 Se desarrollan técnicas para secuenciar el DNA
1978 Genentech produce insulina humana en E. coli
1979 “Sciences de la vie et société” (Gros, Jacob & Royer)
1980 Se presenta el informe Spink
1980 La corte suprema de EE. UU. Acepta patentar microorganismos manipulados
genéticamente
.....

AÑO ACONTECIMIENTO
1981 La federación europea de biotecnología da la definición de término
“Biotecnología”)
1982 Se aprueba en Europa el uso de la primera vacuna recombinante para
animales
1983 Transformación en plantas con plasmidio Ti recombinado
1984 Kary B. Mulis desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa: PCR
1985 S. Willadsen clona una oveja mediante transplante de núcleo
1986 S. Willadsen clona una vaca
S. Willadsen clona una vaca usando células embrionarias diferenciadas
1988 Se patenta en EE.UU. un ratón recombinado susceptible a cáncer.// Se
publica el método PCR
1990 Se aprueba una terapia génica en humanos
1996 Ian Wilmut y Keith Cambell clonan a Dolly usando células mamarias
1997 Se clona Polly, una oveja, usando células de piel

3
 GRANDES ETAPAS EN EL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA

BIOTECNOLOGIA DE PRIMERA GENERACION: USO EMPIRICO DE

MICROORGANISMOS Y ENZIMAS PARA PRODUCIR BEBIDAS ALCOHOLICAS,
LACTEOS, VINAGRE, FERMENTADOS TRADICIONALES

BIOTECNOLOGIA DE SEGUNDA Y TERCERA GENERACION: AISLAMIENTO Y

USO DE ALGUNOS MICROORGANISMOS,
EXTRACCION Y PURIFICACION DE ALGUNAS ENZIMAS Y LA ERA DE LOS
ANTIBIOTICOS

BIOTECNOLOGIA DE CUARTA GENERACION: UTILIZACION OPTIMA DE

MICROORGANISMOS Y ENZIMAS, CULTIVO DE TEJIDOS Y ANTICUERPOS
MONOCLONALES, MEJORAMIENTO DE CELULAS, TECNOLOGIA DEL ADN
RECOMBINANTE

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA

 SE USA TECNICAS BIOLÓGICAS PARA LA PRODUCCIÓN,

TRANSFORMACIÓN Y/O PRESERVACIÓN DE ALIMENTOS:
Producción de bebidas alcoholicas, productos fermentados (yogourt, queso, embutidos)
proteína unicelular, fermentación de cacao, café y té.

 PRODUCCION DE MATERIAS PRIMAS, ADITIVOS Y COADYUVANTES

EMPLEADOS EN LA INDUSTRIA ALIMENATRIA:
Producción de aminoácidos, vitaminas, enzimas, ácidos orgánicos biopolímeros,
colorantes, potenciadosres de sabor, etc.

 ES UTILIZADA EN ASPECTOS ANALÍTICOS Y DE CONTROL DE CALIDAD:

Enzimas empleadas en la determinación de componentes específicos, micoorga-nismos
empleados en evaluación nutricional (vitaminas, aminoácidos, coles-terol, etc.) y
biosensores enzimáticos.

4
 LA BIOTECNOLOGIA TIENE VENTAJAS COMPARATIVAS,
RESPECTO A LA QUIMICA TRADICIONAL:

 Se aprovecha las propiedades funcionales de los

microorganismos.

 Los microorganismos se multiplican rápidamente y tienen un

metabolismo extremadamente activo.

 Bajo ciertas condiciones producen grandes cantidades de

sustancias (metabolitos), en relación a su tamaño.

 Las bioconversiones son altamente especificas. Ejem.

Transformación de lactosa.

 Las bioconversiones se realizan en un medio poco desnaturante,

a temperaturas biológicas, emplean agua como solvente y no
tiene necesidad de catalizadores poluentes.

ALGUNOS APORTES IMPORTANTES DE LA BIOTECNOLOGIA

EN DIFERENTES SECTORES

SECTOR EJEMPLOS
Selección de variedades, plantas y animales obtenidos por
AGRICULTURA
diversas técnicas incluyendo clonación
ENERGETICO Producción de biogas, producción de etanol
Desarrollo de métodos y procedimientos de monitoreo
MEDIO AMBIENTE
Desarrollo de técnicas de tratamiento de desechos industriales
Nuevos métodos de tratamiento y preservación de alimentos
Producción de aditivos
ALIMENTARIO
Enzimas utilizadas en el procesamiento de alimentos
Producción de proteína unicelular
Desarrollo de métodos de diagnóstico utilizando enzimas,
sensores enzimáticos
Uso de microorganismos y enzimas en la elaboración de drogas
MEDICO
complejas (ejemplo esteroides)
Nuevos antibióticos
Uso de enzimas en terapias
MINERIA Extracción de minerales (lixiviación microbiana)
QUIMICO Producción de ácidos orgánicos (cítrico, acético)

5
 IMPACTO DEL DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA
EN LA PRODUCCION DE QUESO Y DE CERVEZA

ETAPA QUESO CERVEZA

Primera Uso empírico de bacterias lácticas Uso empírico de levaduras

generación Uso empírico de quimosina Proceso empírico de malteado

Aislamiento y uso de bacterias lácticas Uso de cultivos puros de levaduras

Segunda
Extracción, purificación y caracterización de quimosina Esclarecimiento de la naturaleza enzimática del malteado
generación
Uso de papaína para la clarificación en frío

Propagación masiva de bacterias lácticas Mejor control de la fermentación

Tercera Selección de cultivos lácticos mejorados Fermentación continua para la producción de cerveza

generación Sustitución de quimosina por proteasa microbiana Producción y uso de amilasas y ß-glucanasas

producida en gran escala Uso de enzimas para la producción de cervezas ligeras

Tecnología del ADN recombinante para la producción de Ingeniería genética para la obtención de levaduras amilolíticas

Cuarta quimosina y mejoramiento de bacterias lácticas Cultivo de tejidos e ingeniería genética para el mejoramiento de

generación Utilización optima de enzimas y microorganismos para la cebada

maduración acelerada y generación de sabores Procesos con microorganismos yenzimas inmovilizadas

ESQUEMA DE LA PRODUCCION E INTEGRACION

DE LAS TECNICAS BIOTECNOLOGICAS

¾TECNICAS DE ANALISIS
¾Cultivo de células animales ¾Optimización de los fenómenos de ¾Cromatografía:HPLC, CPG
¾Células vegetales transferencia ¾Sondas
¾Microorganismos, etc... ¾Automatización ¾Anticuerpos
¾Desarrollo de nuevos sensores ¾Electroforésis

¾FERMENTADOR
¾EXTRACCION Y
PURIFICACION
¾BIO-REACTOR
¾PRE-CULTIVO ¾PRODUCTOS
¾CELULAS ¾Alimentarios
¾Farmacéuticos
¾Energía
¾Químicos

¾Microfiltración
¾Células y enzimas
¾Optimización

tangencial
¾Manipulación

inmovilizadas

¾Ultrafiltración
¾Cromatografía
¾genética

liquida preparativa,
HPLC.

6
 ESQUEMA OPTIMO DE UNA PRODUCCION BIOTECNOLOGICA
Y DE LA UTILIZACION DE ENZIMAS

CELULAS
(Biomasa)
INMOVILIZACION
BIO-REACTOR •Acido orgánico
METABOLITO •Aminoácido

PRE-CULTIVO •Antibiótico
CELULAS
EXTRA / INTRA EXTRACCION Y/O
CELULAR PURIFICACION

MANIPULACION
GENETICA
ENZIMA

INMOVILIZACION REACTOR INMOVILIZACION

REACTOR

PRODUCTO
FINAL

EJEMPLOS DE PRODUCCION Y APLICACIONES DE BIOMASA

MICROORGANISMO EJEMPLOS APLICACIONES

S. Cerevisiae Levadura de panificación Panadería y cervecería

S. Carlsbergensis Levadura de cevecería

Chorela sp. Algas

Spirulina sp.
Pseudomonas sp. Bacterias Proteína unicelular (SCP)
Methalomonas sp.
Candida sp. Levaduras
Aspergillus sp. Hongos
Trichoderma sp.
Lactobacillus sp.
Pediococcus sp. Fermentos lácticos
Leuconostoc sp Starters
Lactobacillus sp.
Bifidobacterias sp Probióticos
Streptococcus sp.
Bacillus sp. Activadores de degradación

Bacillus turingensis Insecticidas

Bcillus sphearicus
Seudomonas fluorescens Fungicidas Biopesticidas
Bacillus subtilis
Trichoderma sp

7
 EJEMPLOS DE PRODUCCION DE METABOLLITOS POR
FERMENTACION

TIPO DE METABOLITO PRODUCTOS MICROORGANISMO

- Acido glutámico - Brevibacterium sp.

- Leucina
Aminoácidos
- Lisina
- Triptofano
- Bacitracina
- Cefalosporina
- Cloranfenicol
- Gramicidina
- Mitomicina
Antibióticos - Monensina
- Neomicinas
- Penicilinas
- Polimixina
- Streptomicina
- Virginiamicina
Alcoholes - Etanol
- Butanodiol/acetoina
- Corinebacterium sp.
- Corinebacterium sp.
- Corinebacterium sp.
- Bacillus subtilis
- Cefaslosporium sp.
- Streptomices venezuelae
- Bacillus brvis
- Streptomices caespitosus
- Streptomices cinnamonensis
- Streptomices fradiae
- Penicilium crisogenum
- Bacillus polimixa
- Streptomices griseus
- Streptomices virginiae
- Sacharomices cerevisiae
- Zymomonas movilis
- Leuconostoc sp
- Aerobacter aerogenes
- Bacillus subtilis
- Serratia marcenscens

Enzimas - Alfa-amilasa - Bacillus licheniformis

- Aspergillus oryzae
- Celulasas - Aspergillus niger
- Trichoderma viride
- Pectinasas - Aspergillus niger
- Aspergillus foetidus
- Beta-galactosidasa - Aspergillus niger
- Kluyveromices marxianus

- Proteasas - Bacillus subtilis

- Bacillus licheniformis

- Lipasas - Mucor miehi

- Aspergillus niger,
- Rhizopus oryzae
Acidos orgánicos - Acido acético - Acetobacter sp.
- Acido cítrico - Aspergillus niger
- Candida lipolitica
- Acido láctico - Lactobacillus sp..
- Acido málico - Lactobacillus brevis
- Acido pirúvico - Pseudomonas aeruginosa
- Acido succínico - Bacilluis sp
Polisacaridos - Dextrana - Acetobacter sp.
- Leuconostoc mesenteroides
- Alginato - Pseudomonas, sp
- Xantana - Xantomonas sp.
Vitaminas - Caroteno (pro vita. A) - Choanefora sp.
- Rhodotora sp.
- B6 - Aspergillus sp.
- B12 - Propionibacterium sp.

8
 MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS

AGRICULTURA QUIMICA Y
(2%) ENERGIA (8 %)
Otros (6 %)
Vitaminas (3%)
Hormonas (9%)

Vacunas
FARMACIA (42 %)

Reactivos
de diagntico (30%)

Antibióticos (52%)

INDUSTRIA
ALIMENTARIA (48 %)

9
 MERCADO MUNDIAL DE PRODUCTOS BIOTECNOLOGICOS
EN 1995

3100
3500 3000

Millones de dolares 3000

2500
2000 1500

1500 1000
900
800 700
1000
500
0

MONOSODICO
A. CITRICO
FRUCTOSA

LISINA
ETANOL

ENZIMAS

QUIMICOS
GLUTAMATO

FINOS

ORGANISMOS UNICELULARES, CENOCITICOS O

MULTICELULARES SIN DIFERENCIACION

BACTERIAS
PROCARIOTAS
ALGAS AZUL-VERDE

MOHOS, LEVADURAS
EUCARIOTAS
PROTOZOARIOS, ALGAS

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 DIFERENCIAS ENTRE CELULAS EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS

PROCARIOTA EUCARIOTA

Estructuras genéticas:
• número de cromosomas 1 >1
• membrana nuclear - +
• DNA nuclear unido a histonas - +

• DNA en organelos - +

Estructura citoplasmica:
• naturaleza de los ribosomas citoplásmicos 70s* 80s

• naturaleza de los ribosomas de los organelos ninguna 70s

- +
• mitocondrias
- +o-
• cloroplastos

-5 x 10-15 g(1) 3 x 10-12 ó 0.5 x 10-12

Cantidades relativas de DNA

*S=UNIDADES SVEDBERG

COMPARACION DE LAS CARACTERISTICAS DE CELULAS ECUCARIOTAS Y

PROCARIOTAS

(1) Indica el tamaño del RIBOSOMA, medido por la velocidad de sedimentacion en ultracentrifugacion.
S = Valor Svedberg
(2) La reproducción parasexual incluye conjugación, transducción y transformación.

11
 CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES ENTRE LAS CELULAS
EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS
EUCARIOTAS: PROCARIOTAS:
Protistas superiores Protistas inferiores

- Membrana nuclear - Sin membrana nuclear

- Constituido de ADN asociado a proteínas (Histonas) - Nucleo difuso en el citoplas-ma
NUCLEO

- Organizado en muchos cromo-somas, visibles al microscopio - Constituido de ADN Casi la totalidad

al momento de la división del ADN celular
- La forma y número de cromosomas son característicos de la - Cromosoma único
especie
- Estructura compleja: retículo endoplasmático - Sin retículo endoplásmatico
CITOPLASMA

- Movimiento continuo - Sin movimiento

- Numerosos ribosomas, libres o sobre los sitemas membranarios - Numerosos ribosomas, lugar de
síntesis de proteínas
- No está presente en todos los protistas superiores - Constante en todos los protistas
- Rol de protección inferiores
- Compuesta de una red macromolecular que asegura su rigidez - Rol de protección
PARED

y resistencia - Red macromolecular

- No contiene mucopéptidos parietales: en Algas ¿Celulosa; - Mucopéptidos o glicopep-tidos
Hongos ¿ quitina. parietales

- Organos especializados: Mitocondrias - No tienen mitocondrias

RESPIRACIÓN

- Las enzimas necesarias están localizadas a nivel de la

membrana citoplásmica y de los mesosomas

- División binaria de la célula - División binaria de la célula

REPRODUCCION

- División nuclear: mitosis - División nuclear: amitosis

- Posible reproducción sexual por fusión de dos - Fenómenos sexuales raros y diferentes:
células, con: - Conjugación sin fusión celular
- Fusión nuclear, formación de un zigote - Transferencia de material genético de una célula a otra
- División nuclear: meiosi - No hay división nuclear
- Algas eucariotas - Algas azul-verde
FOTOSINTESIS

- Transforman la energía solar en energía química, en - Bacterias fotosintéticas

los cloroplastos - Sin cloroplastos
- Cromatoforos

- Ameboide sobre un soporte rígido para eucariotas sin - No tienen movimiento ameboide (Pared rígida)
pared - Posible movimiento por contracción de flagelos (estructura
MOVIMIENTO

- Contracción de flagelos en el medio líquido diferencial y simple)

(protozoaris-algas)

12
 FAMILIAS DE BACTERIAS IMPORTANTES EN LOS PROCESOS
BIOTECNOLOGICOS

GRUPO T IP O

1 B a c te ria s fo to s in té tic a s
2 B a c te ria s d e s liz a n te s
3 B a c te ria s c o n re v e s tim ie n to
4 B a c te ria s c o n y e m a s o a p é n d ic e s
5 E s p iro q u e ta s
6 B a c te ria s e s p ira le s o c u rv a d a s
7 B a c ilo s y c o c o s G ra m -n e g a tiv o s a e ro b io s
8 B a c ilo s G ra m -n e g a tiv o s a n a e ro b io s fa c u lta tiv o s
9 B a c ilo s G ra m -n e g a tiv o s a n a e ro b io s
10 C o c o s y c o c o b a c ilo s G ra m -n e g a tiv o s
11 C o c o s G ra m -n e g a tiv o s a n a e ro b io s
12 B a c te ria s G ra m -n e g a tiv a s q u im io lito tro fa s
13 B a c te ria s p ro d u c to ra s d e m e ta n o
14 C o c o s G ra m -p o s itiv o s
15 C o c o s y b a c ilo s fo rm a d o re s d e e s p o ra s
16 B a c te ria s d e m o rfo lo g ía b a c ila r G ra m -p o s itiv a s n o fo rm a d o ra s d e e s p o ra s
17 A c tin o m ic e to s y o rg a n is m o s re la c io n a d o s
18 R iq u e ts ia s
19 M ic o p la s m a s

Fuente: Adaptado de Bergey,s Manual of Systeniatic Bacteriology, Vol 3. J.T. Staley, Ed. Baltimore: Williams &
Wilkins, (1989)

ALGUNAS BACTERIAS DE IMPORTANCIA BIOTECNOLOGICA DE

ENTRE LOS 19 GRUPOS BACTERIANOS

GRUPO Y FAMILIA GENERO PROCESO

7. Cocos y bacilos Gram-negativos aerobios
Pseudomonaceae Pseudomonas Proteína de origen unicelular (SCP) a partir de
metanol, oxidación de esteroides / hidrocarburos,
polisacáridos (alginatos), oxidación de alcoholes
Mythilomonadaceae Methilomonas SCP a partir de metanol
Methylococcus Oxidación del metano
Azotobacteriaceae Azotobacter Fijación no simbiótica del nitrógeno
8. Bacilos Gram-negativos anaerobios facultativos
Enterobacteriaceae Escherichia Muchos procesos diferentes, producción de
aminoácidos (lisina)
Aerobacter Nucleótidos, ácido 2-cetoglutárico, pululanasa, ácido
6-aminopenicilánico, quimosina recombinante
12. Bacterias Gram-negativas quimiolitotrofas
Thiobacillus Lavado de cobre, cinc, hierro, manganeso, otros
sulfuros
13. Bacterias metanógenas
Methanenobacteriaceae Methanobacterium Metano a partir de afluentes
Methanococcus
Nocardiaceae Nocardia Oxidación de hidrocarburos, esteroides

13
14. Cocos Gram-positivos
Micrococcaceae Micrococcus Oxidación de hidrocarburos, cultivos iniciadores para
productos cárnicos
Streptococcaceae Streptococcus Producción de ácido láctico, diacetilo; cultivos
(Lactococcus) iniciadores de quesos y otros productos lácteos
fermentados
Pediococcaceae Pediococcus Cultivos iniciadores para productos cárnicos
Leuconostoc Producción de dextrano; cultivos iniciadores para
quesos y vino (heterofermentación)
15. Bacilos y cocos formadores de esporas
Bacillaceae Bacillus Antibióticos, enzimas, aminoácidos y vitaminas (B2,
B12)
Clostridium Butanol, acetona, ácido butírico, toxina botulínica
16. Bacterias de morfología bacilar Gram-positivas no formadoras de esporas
Lactobacillaceae Lactobacillus Ácido láctico, productos lácteos fermentados,
embutidos y productos vegetales fermentados;
ensilado, alteración de alimentos
Bifidobacterium Bifidoyogur, bifidotabletas
17. Actinomicetos y organismos relacionados
Grupo Corineforme Corynebacterium Oxidación de hidrocarburos, aminoácidos
Arthrobacter Transformación de esteroides
Cellulomonas Fermentación de la celulosa
Propionibacteriaceae Propionibacteria Vitamina B12; ácido propiónico, fermentación del
queso
Mycobacteriaceae Mycobacterium Oxidación de hidrocarburos y esteroides

ALGUNOS HONGOS DE IMPORTANCIA BIOTECNOLOGICA

GENERO PRODUCTOS
Mucor ♦ Acidos orgánicos, enzimas
Rhizopus ♦ Acidos orgánicos, enzimas
Blakeslea ♦ ß-Caroteno
Choanephora ♦ ß-Caroteno
Ashbya ♦ Riboflavina
Cryptococcus ♦ Riboflavina
Candida ♦ Ácido cítrico
Rhodotorula ♦ Lípidos
Saccharomyces ♦ Etanol, vino, cerveza
Saccharomycopsis ♦ Proteínas
Torulopsis ♦ Ácido cítrico
Aspergillus ♦ Enzimas, antibióticos, ácidos orgánicos
Cephalosporium ♦ Antibióticos
Penicillium ♦ Antibióticos, ácidos orgánicos, enzimas
Fusarium ♦ Proteína, grasa
Gibberella ♦ Sustancias semejantes a hormonas, giberelinas

14
 CARACTERISTICAS ESENCIALES DE LOS
MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL

™ Cultivo puro, libre de otros microorganismos y de fagos

™ Capaz de producir fácilmente células vegetativas y esporas u otras unidades
de propagación
™ Que crezca vigorosamente en el medio, una vez inoculado en los
fermentadores
™ Que permita obtener el producto de interés en corto tiempo
™ Que permita obtener el producto deseado, preferiblemente sólo, libre de
contaminantes tóxicos o no, y que sea de sea de fácil purificación
™ En lo posible que se proteja de la contaminación, por ejemplo creciendo a pH
ácido o a alta temperatura o que produzca inhibidores de otros
microorganismos
™ Capaz de ser modificado con agentes mutagénicos, pero estables en
ausencia de estos
™ Fáciles de conservar durante largos periodos de tiempo

CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

 Representa la evolución de la población celular durante el cultivo.

 Permite caracterizar la actividad de la población celular.
‹La velocidad de división de las celular.
‹Los cambios en estado fisiológico.
 Considerando un cultivo de microorganismo realizado en
condiciones ideales:
‹EL cultivo es de tipo discontinuo (Batch).
‹El fermentador es infinitamente mezclado, lo que permite
obtener un sistema homogéneo.
‹Las condiciones de cultivo (pH, Temperatura, aireación,...) son
constantes y favorables al desarrollo del microorganismo.
‹En estas condiciones se obtiene las curvas de crecimiento
siguientes:

15
 ESQUEMA DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO EN
FERMENTACION BATCH

A B

Log N

N
I II III IV V VI I II III IV V VI

t t

N = Número de células por unidad de volumen. t= Tiempo.

La curva de crecimiento puede ser dividida en seis períodos, cuatro de los cuales (I,
III, V, VI) constituyen fases en las que el microorganismo se encuentra en un estado
fisiológico particular. Los estados II y IV constituyen transiciones entre dos fase
diferentes.

I. FASE DE LATENCIA
‹ Ocurre inmediatamente después de la inoculación y constituye
un periodo de adaptación de las células al sustrato presente en
el medio.
♦ No hay división celular.
♦ La duración del período de latencia depende de varios factores,
naturaleza del medio, tamaño del inoculo.
• Si el cultivo que se va a utilizar como inoculo se encuentra
en fase logarítmica, puede no existir un período de
latencia, sin embargo si el inoculo se toma de un cultivo
que se ha detenido por limitación de un sustrato el período
de latencia puede ser grande

II. FASE DE ACELERACION

‹ Cuando la fase de adptación se termina, se inicia el crecimiento
y aumenta la velocidad específica de división.

16
III. FASE LOGARITMICA

♦ La fase de crecimiento logarítmica o exponencial es el período durante el

cual la velocidad específica (o tasa) de crecimiento exponencial alcanza
un máximo y permanece constante.
♦ La concentración de las células aumenta exponencialmente.
♦ La composición y fisiología de las células permanecen invariables.
♦ Desde un punto de vista industrial es importante, ya que esta fase está
asociada a la producción de proteínas celulares, enzimas que intervienen
en la hidrólisis de macromoléculas (proteasas, celulasas, amilasa,
pectinasas, .....) y otros productos asociados al metabolismo primario

IV. FASE DESACELERACIÓN

‹ Hay disminución de la división celular por agotamiento del medio de

cultivo. En efecto desaparecen una serie de compuestos necesarios para
el crecimiento y eventualmente hay acumulación de inhibidores
resultantes del metabolismo microbiano (alcohol, antibióticos, ....)

V.FASE ESTACIONARIA
‹ La concentración de las células alcanza su nivel máximo
‹ El crecimiento celular se detiene pero conserva buena actividad metabólica
‹ Se dan cambios fisiológicos importantes y modificaciones en la estructura
bioquímica de las células.
‹ El desequilibrio en la composición del medio, conduce a la acumulación de
productos del metabolismo (metabolitos primarios).
‹ También hay producción de metabolitos secundarios (ácidos orgánicos,
antibióticos,....).
‹ Las condiciones de cultivo durante esta fase son propicias para la
diferenciación celular, es decir la formación de células con estructuras
particulares (espora, conidias, .....); esta diferenciación puede tener gran
interés en bio-industrias en la producción de células resistentes (Bacillus,
Clostridium, Streptomyces, hongos,....).

VI. FASE DE MORTALIDAD

‹ Esta fase resulta de una autólisis de las células vegetativas por acción de
las propias enzimas de la célula.
‹ Siempre existe una división celular por consumo de la materia orgánica
liberada por las propias células, sin embargo la velocidad de crecimiento es
inferior a la de mortalidad.

17
 REPRESENTACION ESQUEMATICA DE LA CURVA DE
CRECIMIENTO (N), CONSUMO DE SUSTRATO (S) Y
FORMACION DE PRODUCTO (P)

Log N
P N
S S

‹ Considerando un cultivo discontinuo (batch) en un reactor infinitamente

mezclado, durante la fase de crecimiento exponencial se tiene:

d X
= µX X
d T
d N µ N
= N
d T

X = Cantidad de biomasa en g de materia seca /L

N = Número de células / mL
µ = Velocidad específica de crecimiento (h-1)
T = Tiempo (h)

♦ Con la ecuaciones anteriores se define la velocidad o tasa de crecimiento

(µ)

µX = 1 dX
X dT

18
De la ecuaciones anteriores se deduce que:

dX
= µ dT
X

Integrando esta ecuación entre el tiempo T0 y T, se tiene:

LnX - Ln X 0 = µ (T -T 0)

µ
LogX - Log X 0 = 2 .3 0 3 ( T - T 0 )

X = X 0 eµ (T -T 0)

La velocidad específica de crecimiento se puede calcular gráficamente a través de

la pendiente de la recta (µ ó µ/2.303) o también usando las ecuaciones:

µ = 2 .3 0 3
(L o g X - L o g X 0)
∆T

µ =
(L n X - L n X 0)
∆T

La tasa de crecimiento, determinada en fase exponencial donde ningún elemento

nutritivo es limitante, nos da la tasa de crecimiento máxima: µ=µmax.

‹ La tasa de crecimiento depende del tipo de microorganismo

‹ Depende además de las condiciones de cultivo

 Naturaleza y concentración de sustrato.

 Las condiciones aireación (microorganismos aerobios).
 Temperatura y pH (en ciertos casos el potencial redox y la fuerza
iónica).
 Las condiciones de mezcla, cuando la transferencia de materia es un
factor limitante.
 La presencia de inhibidores.
 El tiempo de generación, que representa el tiempo necesario para que
la población microbiana se duplique (ejem. de X a 2X), está dado por:

(Ln2X - Ln X) 0.693
g= ∆T =
µ
=
µ

19
 TASAS DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE
GENERACIÓ
GENERACIÓN DE ALGUNOS MICROORGANISMOS

Microorganismo µmax (h-1) g (h)

Bacilus subtilis 1.70 0.4
Pseudomonas putida 1.00 0.70
Escherichia coli 2.30 0.30
Nitrosomonas sp 0.07 10.0
Candida tropicalis 0.70 1.00
Sacaromices cerevisiae 0.35 2.00
Aspergillus sp. 0.53 1.30

CINETICA MICROBIANA

‹ Por analogía a la ecuación de MICHAELIS MENTEN, se estableció la

ecuación de MONOD en 1949.
‹ Suponiendo que todos los elementos nutritivos son adicionados al
medio en exceso, salvo el sustrato (S) considerado factor limitante, se
tiene:

µ = µmax S
KS + S

µ = Tasa o velocidad específica de crecimiento (h-1).

µmax = Tasa de crecimiento máxima (h-1).
S = Concentración de sustrato limitante (g/L).
Ks = Constante de saturación (g/L). Concentración de sustrato necesaria para obtener ½
de la tasa de crecimiento máxima

20
 µ µmax Ks depende del
microorganismo y
de la naturaleza del
sustrato limitante
µmax/2 ‹ Un valor alto de Ks
indica poca afinidad
por el sustrato
‹ Un valor bajo de Ks
indica alta afinidad
S por el sustrato

µ µmax
A una concentración
determinada de sus-
µmax/2
trato: a medida que Ks
aumenta, disminuye la
tasa de crecimiento
S

Los valores de Ks son pequeños para los compuestos normalmente usados en medios de cultivo.
Estos valores son del orden de 10-5-10-6 M en el caso de azúcares (como glucosa) e inferiores a 10-6
M para los aminoácidos y vitaminas.

VALORES DE Ks PARA DIFERENTES MICROORGANISMOS

Microorganismo Sustrato limitante Ks (M)
Echerichia sp. Glucosa 2.2 . 10 -5
Aspergillus sp. glucosa 2.8 . 10 -5
Candida sp. glicerol 4.9 . 10 -5
Sacharomices sp. glucosa 14.0 . 10 -5
Pseudomonas sp. metanol 2.0 . 10 -5
Aspergillus sp. arginina 2.9 . 10 -6

De manera general los valores de Ks explican porque los microorganismos son capaces de
purificar rápidamente los medios en un determinado compuesto. por ejemplo alcanzando
concentraciones tan bajas, del orden de 10-5 M la velocidad de crecimiento (y por tanto la
velocidad de consumo de este) disminuyen a la mitad con respecto a las condiciones de sustrato no
limitantes (generalmente del orden de 0.05 m en sustrato). Las aplicaciones en el campo de la
contaminación se basan en esta propiedad de asimilación de los microorganismos.

21
♦ Combinando las ecuaciones de la velocidad de producción de

células y la cinética de crecimiento

dX
r X = = µ X
dT

♦ Reemplazando µ por la ecuación de MONOD:

µ
r X = K Sm+a x SS X

♦ En el caso microorganismos aerobios, el oxigeno es un

elemento esencial que es considerado como sustrato, por tanto
se aplica la ley de Monod.

µ = µmax [O2]
K [O ] + [O2]
2

[O2] = Concentración de oxígeno disuelto en el medio.

K[O2] = Constante de afinidad por el oxigeno.
rX = Velocidad de producción de células (g/Lh)

CINETICA DE MONOD EN SISTEMAS

PARTICULARES

 Inhibición del crecimiento por el sustrato

 Inhibición del crecimiento por productos del

metabolismo

 Transferencia de masa limitante

22
 CASO DE INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR EL SUSTRATO
‹La ecuación de Monod considera que
1 /K i C re cie n te
la tasa de crecimiento es máxima (µ = rx
µmax) cuando el sustrato S se aporta al
medio de cultivo en exceso.

‹Sin embargo si se aporta sustrato a

altas concentraciones, principalmente
azúcares, moléculas orgánicas
(alcoholes, ácidos....) y sales, puede
S
disminuir o detenerse la división
celular.

‹ La siguiente ecuación es una variante de

S
la ecuación de Monod que tiene en µ = µ m ax
K S + S + S n +1
cuenta el efecto inhibidor de ciertos Ki n

sustratos.

Ki = Constante de inhibición del sustrato (g/L).

n, en la mayoría de casos es igual a 1.

‹Ki es menor cuando el efecto inhibidor del sustrato es alto

‹Cuando se utilizan sustratos con un alto efecto inhibidor como
etanol, ácidos orgánicos ....., es necesario realizar procesos
particulares como el cultivo “fed batch.”.
‹El efecto inhibidor es importante en procesos de desconta-
minación microbiológica como en:
• Degradación bacteriana de hidrocarburos que contaminan
aguas y suelos.
• Destrucción de sustancias tóxicas presentes en zonas
contaminadas.
• Tratamiento de aguas de granjas piscícolas, reducción del
contenido de amoniaco y nitrito

23
 INHIBICION DEL CRECIMIENTO POR PRODUCTOS DEL
METABOLISMO

La división celular es acompañada de la síntesis de metabolitos

que son excretados y acumulados en el medio de cultivo. Algunos

de estos metabolitos que se acumulan en el medio pueden tener

un efecto inhibidor y reducir la tasa de crecimiento, este es el caso

del etanol, los ácidos orgánicos, los antibióticos......

La variante de la ecuación de Monod en este caso es:

µ = φ S D onde φ = µ m a x f (P )
KS + S

Según el caso de inhibición, la función “f”, puede ser:

P = Concentración del producto

•Lineal
φ = µ m a x (1 - K ’ i P ) responsable de la inhibición
(g/L)
K’i = Constante de inhibición asociada
•Exponencial
φ = µ max e ( -K ’i P)
al producto

φ = µ
•Hiperbólica 1 K ’i
φ = µ m ax m ax
P K ’i + P
1 + K ’i

El caso de las fermentaciones lácticas y

alcohólicas, son dos casos típicos de
inhibición por los productos formados
µ = µ m a x ( K ’i ) ( S )
(ácido láctico y etanol). En estos casos K ’i + P KS + S
se da un tipo de inhibición hiperbólica:

24
 TRANSFERENCIA DE MASA LIMITANTE
La transferencia de materia puede constituir un factor limitante para el
crecimiento y desarrollo de un microorganismo, principalmente cuando
las condiciones de mezcla en el fermentador son poco eficaces (alta
viscosidad, fermentadores grandes..)
En condiciones de transferencia ineficiente la velocidad específica de
crecimiento (µ) depende de:
µt, relacionado con la transferencia del sustrato hacia la célula.
µmax, relacionado con el metabolismo del sustrato en la célula.

1 1 1 µ + µ max
= + = t
µ µ max µt µ max µ t

La ecuación general de transferencia de masa está dada por: Φ S = h s (S - S c)

ΦS = Flujo de sustrato por unidad de superficie (Kg/m2 s)
S = Concentración de sustrato en el medio (Kg/m3 )
SC = Concentración de sustrato alrededor de la célula (Kg/m3 )
hS = Coeficiente de transferencia de masa entre el medio de cultivo y la superficie
de la célula (m/s)

La velocidad de consumo de sustrato (rs = -(dS/dT)), es función del flujo de

transferencia de masa (ΦS) y la superficie de transferencia entre las células y el medio
(AC m2/m3 ):
rS = Φ S A C (Kg/m3 s)

Reemplazando ΦS en la ecuación anterior, se tiene la ecuación global de

transferencia de sustrato entre el medio y la célula:

rS = A C h S (S − S C )

La superficie celular por unidad de volumen de células se determina de la

siguiente manera:
- Para los microorganismos esféricos (cocos y levadura....): 6/dc
- Para los microorganismos bastonados (Bacillus y Clostridium....): 1/0.22dc
- Para los microorganismos miceliares (hongos y Streptomyces....): 1/0.25dc
Donde dC es el diámetro medio de las células
6 X
En el primer caso AC está dado por: A C =
dC ρC
Donde:
Ac= Superficie celular por unidad de volumen de cultivo (m2/m3)
X = Concentración de células en el medio (Kg/m3)
ρc= Densidad de las células (Kg/m3)

25
Reemplazando Ac en la ecuación de transferencia de masa se obtiene el
consumo de sustrato:

6h S
rS = Φ S A C = X (S − S C )
ρCd C

La tasa de crecimiento puede representarse también por:

rX µ X rS
Y x/s = = µ = Y X /S
rS rS X

Donde YX/S, es el coeficiente de transformación de sustrato (S) en

biomasa (X) (Kg de células formadas/Kg de sustrato consumido).

Reemplazando rs en la ecuación anterior se tiene el componente

µt:
6 hS
µT = Y X /S (S - S C)
ρC dC

Reemplazando µt en la ecuación 1 1 1 µ +µ
= + = t max
global de la tasa de crecimiento µ µmax µt µmax µt
se tiene:
6 hS
µ max [ Y X /S ] (S - S C )
ρC dC
µ=
6 hS
µ max + [ Y X /S ] (S - S C )
ρC dC

Si se supone que Sc<<<S, entonces (S - Sc) » S, y reemplazando

en la ecuación anterior se encuentra el modelo de Monod:

µ max S
µ=
KS+ S KS =
µ max
Donde: 6 hS
Y X /S
ρC dC

Es una expresión que permite

un cálculo aproximado de Ks

26
 INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DEL MEDIO SOBRE EL
CRECIMIENTO

‹La temperatura ejerce una influencia determinante sobre el metabolismo

celular.

‹El crecimiento microbiano , al igual que las reacciones enzimáticas, se bloquea

a baja temperatura y se acelera por el aumento de este parámetro, a
temperaturas altas se perturba dicho crecimiento por la alteración de ciertos
componentes (enzimas, ácidos nucleicos) o estructuras celulares (membrana
citoplásmica).

‹La tasa de crecimiento es optima en un rango estrecho de temperatura, según

esta se distingue tres categorías de microorganismos:

• Sicrófilos: Tiene una temperatura optima de crecimiento próxima a los

5 °C. No crecen a temperaturas mayores a los 25 °C.

• Mesófilos: Temperatura optima de crecimiento próxima a los 30 °C. No

crece a temperaturas < a 15 °C y > a 45 °C.

• Termófilos: Se desarrollan favorablemente a temperatura próximas a los

55 °C no crecen a temperaturas < a 37 °C y >65 °C.

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

DE DIVERSOS MICROORGANISMOS
TEMPERATURA (°C)
MICROORGANISMO
Mínima Optima Máxima
Bacillus subtilis 15 30-37 55
Escherichia coli 10 30-37 45
Lactobacillus casei 10 28-30 40
L. termófilus 30 50-63 65
Nitrobacter sp. - 25-28 -
Pseudomonas aeruginosa 0 37 42
Streptococus pirogenes 15 37 40
Streptomices termofilus 20 40-45 50
Candida parapsilosis 0 20-25 30
Sacaromices cerevisiae 0-5 28-36 40-42
Aspergillus niger - 37 <60
Btritis cinera 0 20-25 30
Rizopus sp. 7 25-30 35

27
 Diferentes modelos se han propuesto para evaluar la influencia de
de
la temperatura sobre el crecimiento de las cé
células. A continuació
continuación
dos de ellos

LA ECUACIÓ
ECUACIÓN DE ARRHENIUS
♦El crecimiento microbiano es debido a un conjunto de reacciones enzimáticas,
donde una de ellas limita al complejo. Esta reacción limitante determina la tasa de
crecimiento máxima. La dependencia de la tasa de crecimiento de la temperatura se
establece por analogía a la cinética enzimática a través de la relación de
ARRHENIUS:

µmax = A exp −∆H1* E

( RΤ )

E = Fracción másica de la enzima específica referida a la biomasa

∆H1* = Entalpía de activación de la reacción limitante (Kj / mol)
A = Constante (h-1)
R = Constante universal de los gases ( 0.00831 Kj °K / mol)
T = Temperatura absoluta (°K)

♦Esta expresión es valida en una rango estrecho de temperatura, próximo a la

temperatura optima de crecimiento.

GENERALIZACION DE LA ECUACION DE ARRHENIUS

La ecuación de Arrhénius se puede modificar, de manera que se pueda aplicar a un rango muy
grande de temperatura. Para esto se supone que la enzima que limita el crecimiento puede existir
sobre dos configuraciones distintas: una forma activa y otra inactiva. El equilibrio de estas dos
formas depende de la temperatura y puede ser formulado como sigue:
−∆ H 2
ƒI = Fracción de la enzima inactiva
ƒA = Fracción de la enzima activa
ƒI = ƒA K exp ( RΤ
)
K = Constante
∆H2 = Entalpía de inactivación (Kj / mol)

Por definición: ƒA + ƒI = 1, considerando esto en

la ecuación anterior queda:
ƒA =
1
−∆H2
1 + K exp ( R Τ
)

Considerando la fracción de enzima activa en

la ecuación de Arrhénius, se tiene:
µ m a x = A ex p ( − ∆ H 1 * ) ƒ A E
R Τ

( − R∆ HΤ 1 )
* E
Reemplazando ƒA en la ecuación precedente se A exp
tiene la expresión general de tasa de crecimiento µ m ax =
−∆ H 2
máxima: 1 + K ex p ( R Τ
)

28
 Esta última relación se representa en la siguiente figura:

EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACION SOBRE LA TASA DE

CRECIMIENTO MAXIMA DE UN MICROORGANISMO MESOFILO

µ max
Curva de activación
Curva de inactivación

10 20 30 40 50 T (°C)

‹ Linearizando la ecuación de Arrhenius, ∆H 1 * 1

Lnµ max = Ln( AE) −
se tiene: R T
Donde -∆H1*/ R representa la pendiente de la recta semilogarítmica.

♦ Los valores de ∆H1 * encontrados en la literatura están

comprendidos entre 45 y 130 Kj/mol.

♦ Los valores de ∆H2 se pueden ƒA =

1
−∆H2
calcular a partir de la ecuación: 1 + K exp ( RΤ
)

♦ Los valores de ∆H2 reportados en la

literatura, se encuentran entre 188 y
388 Kj/mol

( −∆R HΤ1 ) E
*
♦ Encontrados los valores de cambio A exp
µ max =
en las entalpías se puede encontrar
la temperatura optima de crecimiento
1 + K exp ( −∆R HΤ2 )
de la siguiente manera:
∆H 2
T ( optima ) =
(dµmax/dT) = 0, se obtiene ⎡ ⎛ ∆H 2 ⎞⎤
R .Ln ⎢ K .⎜⎜ − 1 ⎟⎟ ⎥
⎣⎢ ⎝ ∆ H 1 * ⎠ ⎥⎦

29
 INFLUENCIA DEL pH DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO
MICROBIANO

‹La tasa de crecimiento de un microorganismo dado, en ciertas condiciones

toma un valor máximo para un pH o una zona de pH optima.

‹Las bacterias son generalmente neutrófilas, es decir crecen mejor a pH

próximo a 7. Algunas de ellas que tienen metabolismo acidógeno (producción

de ácidos orgánicos por vías metabólicas: ácido láctico, acético,...) crecen

bien a pH 3. Algunas de ellas que oxidan los compuestos azufrados en

sulfatos (thiobacillus) bajan el pH a 1.

‹Las levaduras y hongos se desarrollan bien en una amplia zona de pH

comprendida entre 3 y 8

‹La constante Ks no es afectada significativamente por el pH ni la

temperatura.

‹ En la literatura se reportan diversas ecuaciones que relacionan la tasa de

crecimiento con el pH. La más utilizada es la ecuación polinomial siguiente:

µmax = a (pH)2 + b (pH) + c Donde a, b y c son constantes

.
‹ En la figura se representa dicha ecuación
EVOLUCION DE LA TASA DE CRECIMIENTO EN FUNCION DEL pH PARA LA MAYORÍA DE
BACTERIAS

µ m ax

4 7 10 pH

‹ Las constantes a, b y c se encuentran con medidas experimentales.

‹ El pH optimo se encuentra igualando la primera derivada de la ecuación
anterior a 0:
d(µmax/pH) = 0 pH (optimo) = -b / 2a

30
 CINETICA DE PRODUCCION DE METABOLITOS

‹ En muchos procesos de fermentación nos interesa la producción de

un metabolito determinado.

‹ El seguimiento de estos procesos se hace a través de la evolución de

la concentración del producto formado.

‹ En paralelo a la determinación de la curva de crecimiento celular se

traza la curva del producto formado (P, en g/L).

‹ La velocidad de producción se determina, en cualquier momento a

partir dicha curva:
dP
rP =
dT
rp = Velocidad de producción (g/L de medio . h)
P = Producto formado (g/L)
T = Tiempo (h)

De la misma manera que la velocidad específica de crecimiento (µ), se define la

velocidad específica de producción del metabolito “χ” como:

dP rp 1 dP
rP = = χX.......... ⇒ χ = =
dT X X dT
χ = Velocidad específica de producción del metabolito (g/g de biomasa . h)

En industria de fermentación se utiliza la noción de productividad o

rendimiento horario, que se define como la relación entre la cantidad de
producto obtenido y la duración total del ciclo de producción.

Pf
PRODUCTIVI DAD =
Ttotal
Donde:
Pf = Concentración de producto final (g/L de medio)
Ttotal = Duración total del proceso (h).

En un proceso “batch” la duración total (Ttotal) se determina como:

Ttotal = TN + TR + TS +TC +TV
TN = tiempo de lavado del fermentador
TR = tiempo de llenado de fermentador
TS = tiempo de esterilización
TC = tiempo de cultivo
TV = tiempo de vaciado del fermentador

31
‹La productividad permite evaluar el proceso de fermentación:
sirve para estudiar la rentabilidad y dimensionamiento de la
instalación.

‹La tendencia de la curva de producción de metabolitos depende

de la curva de crecimiento. La relación existente entre las dos
curvas varía de un metabolito a otro según:

 Su naturaleza
 Su lugar en la actividad bioquímica celular
 Los mecanismos de las reacciones metabólicas que lo
originan.
‹La clasificación de Gaden de 1955 distingue tres tipos de
metabolitos

Metabolitos de primer tipo

Metabolitos de segundo tipo
metabolitos de tercer tipo

Metabolitos de primer tipo: la síntesis Metabolitos de segundo tipo: también

está ligada directamente al crecimiento están ligados al crecimiento celular, pero
de las células y por lo tanto al son diferentes en el tiempo con respecto a
metabolismo del sustrato principal (S). la degradación del sustrato.

Log X Log X
P P
S S S
X
X S

P
P

t
t

Log X
P S
S X

Metabolitos de tercer tipo: No están P

ligados al crecimiento ni al catabolismo
del sustrato principal.

32
 ‹Los productos del primer y segundo tipo provienen del metabolismo primario,
están constituidos por compuestos esenciales al metabolismo de síntesis de
los constituyentes de la célula:
Ejemplos: Primer tipo producción de etanol (Fermentación alcohólica)
Segundo tipo producción de ácido láctico (fermentación láctica)
Primer o segundo tipo, excreción de enzimas
Primer tipo producción de aminoácidos

‹Los productos del tercer tipo provienen del metabolismo secundario y no son
esenciales para el crecimiento celular.

‹El estudio de la cinética de producción de metabolitos consiste en establecer

las relaciones matemáticas (modelos) que caracterizan la curva de producción.

‹La velocidad producción de metabolitos de primer tipo ligada al crecimiento

microbiano:
dP dX dP dX
=α Ο = YP/ S
dT dT dT dT
YP/x = Cantidad de metabolito producido por unidad de biomasa
(g de producto / g de células).

♦ La velocidad de producción de metabolitos

dP dX
de segundo tipo, parcialmente ligado =α + βX
al crecimiento , se representa por: dT dT

‹ Cuando hay inhibición como conse-

dP dX
cuencia del aumento de metabolitos =α + β X - γP n
dT dT
en el medio se utiliza:
α, β y γ son parámetros que dependen de las condiciones de cultivo
es decir:
Son parámetros que dependen de las condiciones de cultivo:
α = ƒ1 (pH, T°, [O2 ],......)
ß = ƒ2 (pH, T°, [O2 ],......)
γ = ƒ3 (pH, T°, [O2 ],......)

‹ En lo que concierne a los metabolitos del tercer tipo (metabolitos

secundarios), las ecuaciones muy complejas y establecidas
empíricamente.

33
 TECNICAS PARA DETERMINAR POBLACION
MICROBIANA

 El aumento de la población microbiana resulta de la reproducción

de las células.

 Los organismos unicelulares como las bacterias y levaduras se

reproducen por fisión celular (reproducción asexual).

 Las dos células bacterianas resultantes de la fisión son idénticas.

sin embargo algunas levaduras pueden dar lugar a dos células
diferentes (célula madre y célula hija), lo que conduce a una
población heterogénea.

 Los hongos, bacterias y levaduras filamentosas, crecen

alargamiento y ramificación. de acuerdo a las condiciones del
medio se puede formar micelio difuso o pellet.

 El comportamiento de la población microbiana debe considerarse

para seleccionar una técnica de medición de la biomasa.

 Existen diversas técnicas para determinar biomasa, sin embargo ninguna

de ellas es aplicable a todos los casos y los resultados que se obtienen no
son totalmente satisfactorios ya que probablemente están sujetos a errores
y posibles interferencias.

Los métodos se clasifican en dos categorías:

DIRECTOS: Determinan la concentración de células presentes en el medio,

se aplican en el caso de levaduras y bacterias no
filamentosas.

INDIRECTOS: Utilizan indicadores bioquímicos relacionados con el aumento

de la biomasa (constituyentes celulares) o propiedades
asociadas al crecimiento (consumo de oxigeno, aumento de la
viscosidad.....).

Se emplean cuando los métodos directos no son aplicables

(microorg. filamentosos) o cuando se desea simplificar la
determinación con el objetivo de una automatización. Es
necesario establecer una correlación adecuada entre la
biomasa y el parámetro considerado.

34
 RECUENTO EN MICROSCOPIO
Las células se cuentan en un microscopio con la ayuda de una “célula” de numeración.
Existen diferentes tipos de células de numeración:

La elección de un tipo de “célula” de numeración dependerá del tamaño de

microorganismo. Entre los tamaños promedio de los diferentes microorganismos se tiene:

¾Algas unicelulares....................> 20 µm.

¾Levaduras................................. 8 – 10 µm
¾Bacterias....................................1 – 4 µm

Ventajas y desventajas del recuento en microscó

Ventajas
• Método simple y rápido
• Resultados inmediatos
microscópio
Desventajas
• Difícil de utilizar en caso de células pequeñas
(<1um), como algunas bacterias
• Difícil en el caso de células de mucha movilidad
• Riesgo de error durante el recuento visual en el
microscopio*
• Riesgo de error en el caso de medios con sólidos
insolubles o suspenciones
• Técnica no aplicable a organismos filamentosos
• No utilizable para microorganismos filamentosos
• Es recomendable para suspensiones que tiene
alrededor de 106 células/mL**
• Imposible distinguir células vivas de células
muertas

35
 RECUENTO EN AGAR
 La suspensión celular se inocula sobre placas Petri que contienen un
medio cuya composición tiene agar y otros elementos que favorecen
el desarrollo de los microorganismos.
 Se incuba a la temperatura optima de crecimiento del microorganismo
y se cuentan las colonias después de 24 ó 48 horas.

VENTAJAS DESVENTAJAS
• Solo se enum era las células • Requiere de tiem po prolongado y
vivas gran cantidad de m aterial (placas con
• No hay problem a por sólidos agar, tubos de dilución,...)
solubles en el m edio • Resultados por defecto cuando
• Puede ser utilizada para toda la existen células asociadas
gam a de concentraciones • Riesgo de im precisión por la
celulares (a condición de utilizar preparación de num erosas diluciones
diluciones adecuadas) • No utilizable para m icroorganism os
filam entosos

DETERMINACION DE LA MATERIA SECA

La biomasa se recupera por centrifugación o filtración, se lava con agua
destilada para eliminar los sólidos retenidos entre las células y se seca a 105
°C hasta peso constante.

VENTAJAS DESVENTAJAS
• Método riguroso • No permite distinguir células vivas de
células muertas
• Técnica simple y fácil de utilizar • Poco reproducible a bajas
concentraciones celulares
• Utilizable para microorganismos • No utilizable en para medios con
filamentosos material insoluble
• No permite un resultado inmediato
(secado +- 24h)
• Resultados por defecto debido a
perdidas durante la separación y
secado

36
 TURBIDIMETRIA (DETERMINACION OPTICA)

 Se basa en la dispersión de un rayo luminosos debido a las partículas

en suspensión.
 En este caso se establece una relación entre la DO y la materia seca
(g/l).
 En la zona lineal se puede escribir la siguiente ecuación:
DO= ε l X

DO

DO= densidad óptica

ε = coeficiente de turbidez(l/g cm) CORRELA
l = ancho de la célula de medición (cm) LINEAL.

X = concentración de biomasa (g/l)

PARA UNA LOGINTUD
DE ONDA DETERMINADA

El coeficiente de turbidez depende de:

• La longitud de onda elegida (generalmente
X(g/L)
se trabaja entre 500 y 700 nm).
• De la forma y la talla (estado fisiológico)
del microorganismo.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA
TURBIDIMETRIA

Ventajas Desventajas
 Técnica simple y fácil  No permite diferenciar células muertas de
de utilizar células vivas
 Método rápido y de  Las medidas son sensibles a los cambios
resultados inmediatos fisiológicos del las células
 Posible uso en  Es necesario establecer una curva de
automatización calibración de materia seca
 Método no destructivo  No utilizable en medios que contienen
material insoluble o emulsiones
 Es necesario suspensiones homogéneas
 No utilizable para microorganismos
filamentosos

37
 RECUENTO ELECTRONICO
‹ Dentro y fuera de un tubo, que contiene un orificio calibrado, se encuentran
dos electrodos de platino inmersos en un electrolito.
‹ Se aplica una tensión continua en los bornes de los electrodos.
‹ Las células pasan a través del orificio, gracias a una aspiración, y desplazan
un volumen de electrolito igual a su propio volumen.
‹ Esto genera un impulso eléctrico cuya
amplitud es proporcional al volumen de Dispositivo
de medida

la célula. Vacío

‹ Permite numerar hasta 5000 células /s,

además permite diferenciarlas según su Células
volumen. los resultados se presentan en
una curva de distribución de tamaños
‹ Es importante para las levaduras ya que Electrolítos

además de numerarlas permite Electrodos

dimensionarlas

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL RECUENTO

ELECTRONICO

Ventajas Desventajas
 Método rápido  Técnica sofisticada
 Resultados instantá-  No permite diferenciar células vivas de
neos células muertas
 Resultados por defecto cuando hay células
asociadas
 No aplicable en medios con partículas
insolubles
 Riesgos de obstrucción del orificio
calibrado

38
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS
INDIRECTOS

Método Ventajas Desventajas

Determinación de  Se utiliza para todos los microorganismos  No permite diferenciar células
proteínas  Técnica simple y rápida vivas de células muertas
 Interferencia con las proteínas del
medio
Determinación de  Se utiliza para todos los microorganismos  Técnica difícil y costosa
ADN  Está ausente en el medio de cultivo  No permite diferenciar células
vivas de células muertas
ATP-  Se utiliza para todos los microorganismos  Técnica costosa
 Ningún riesgo de interferencia con el medio de  Resultados influenciados por el
cultivo estado fisiológico de las células*
 Método rápido y simple
 Se distingue células muertas de células viva

NADH por fluorimetría  Se utiliza para todos los microorganismos  Técnica sofisticada

 Ningún riesgo de interferencia con el medio  Resultados influenciados por el estado

de cultivo fisiológico de las células*

 Método rápido y simple

 Se puede utilizar para medidas en línea

 Se distingue células muertas de células viva

Determinación de una  Se utiliza para todos los microorganismos  Método aproximado y poco

actividad enzimática  Ningún riesgo de interferencia con el medio reproducible

de cultivo  Algunas interferencias debido a las

 Método rápido y simple células muertas

 Resultados influenciados por el estado

fisiológico*

Consumo de sustrato y  Utilizable para determinaciones en línea.  Método de estimaciones groseras

variación Parámetros

del cultivo

39
 MODELIZACION DE CULTIVOS EN
FERMENTADOR FERMENTADOR
Se puede distinguir , sobre la base de la técnica de

alimentación de sustrato, diferentes principios de cultivo en

fermentador.

Cultivo "Batch" (Sistema cerrado): Es la técnica más simple

donde la totalidad de elementos nutritivos están presentes en
el medio de cultivos antes de la inoculación. Ningún elemento

esencial es adicionado durante el cultivo.

Las células se desarrollan hasta agotar
completamente los sustratos del medio o
sufrir inhibición por los productos de
reacción.

• El ciclo de producción en el cultivo discontinuo o "batch" consta de las

siguientes etapas:
− Llenado del fermentador con el medio de cultivo completo
− Esterilización del fermentador y del medio
− Inoculación del fermentador
− Período de cultivo con agotamiento del medio
− Recolección de la biomasa y/o del medio conteniendo uno o más metabolitos
− Lavado del fermentador

• Cultivo "Feed batch" (Sistema semi-abierto) : Se procede a un aporte

progresivo de sustrato al medio de cultivo, con el objetivo de mantener
constante la concentración de un sustrato esencial (ejemplo : fuente de carbono)
o fragmentar el aporte de este de manera que se evite riesgos de inhibición.

• Cultivo contínuo (Sistema abierto) : Se añade solución nutritiva estéril

continuamente al bioreactor y se retira una cantidad estéril equivalente de
solución utilizada de los nutrientes con microorganismos. Se mantiene
constante el volumen en el reactor.

40
 MODELO DE CULTIVO EN BATCH

Hipótesis:
•El fermentador es infinitamente mezclado (homogéneo)
•No hay mortalidad celular.
•No hay formación de producto.
•El único sustrato limitante es la fuente de carbono.
•Se aporta oxígeno en exceso.
S
En estas condiciones se aplica la ecuación de Monod: µ = µ max
KS + S

V = Volumen de cultivo (m3)

S = Concentración de sustrato limitante (g/L), con una variación de S0 a Sf
X = Concentración de biomasa (g/L), con una variación de X0 a Xf.
V, S, X

dX
rX = ⇒ VdX = Vr X dT
dT
dX dX S S
rX = ⇒ = µX ........ µ = µ max ...... ⇒ rX = µ max X
dT dT KS + S KS + S

X y S son medidos durante el cultivo; mientras µmax y Ks

son parámetros característicos de las cepas. Estos son
constantes si las condiciones no se alteran durante la fermentación.

El consumo de sustrato se expresa de la siguientes manera:

dS r r
rS = − = X + m S X............Siendo, YX / S = X
dT YX / S rS

rS = Velocidad de consumo de sustrato (g/L h)

rX = Velocidad de producción de biomasa (g/L h)
YX/S = Coeficiente o rendimiento de conversión de sustrato
en biomasa (g de biomasa/ g de sustrato).
mS = Constante de mantenimiento (g de sustrato/g células.h)

mS =Representa la velocidad de consumo de sustrato que

proporciona la energía indispensable para mantener una
actividad metabólica mínima de las células cuya división se ha
detenido.

mSx =Representa el consumo total de sustrato para mantener la

biomasa (g de sustrato/L.)

41
 MODELO DE CULTIVO “FED BATCH”
BATCH”
‹ Es un cultivo discontinuo que es alimentado en elementos nutritivos
durante la fermentación (sistema semi-abierto).
‹ Estos elementos nutritivos pueden ser la fuente de carbono, ciertos
precursores o el medio completo, ..... .
‹ La alimentación puede ser intermitente o continua y de flujo constante o
variable.
‹ El cultivo fed batch se utiliza en la producción de biomasa, aminoácidos,
ácidos orgánicos, alcoholes y algunas enzimas
‹ Es importante en el caso de sustratos
Q, Sa
inhibidores, cuando hay represión
catabólica o efecto glucosa
S X
V P
V=Volumen de cultivo en el
fermentador (L)
Q= Flujo o caudal de alimentación
VF
(L/h) Vo
Sa=Concentración de sustrato limi-
tante en la alimentación (g/L).

EMPLEO DE LA FERMENTACION FED BATCH EN LA

PRODUCCION DE METABOLITOS

‹Se utiliza en el caso de metabolítos no asociados al crecimiento de las

células (segundo y tercer tipo)
‹Las condiciones de síntesis del producto no son compatibles con el
crecimiento de las células
‹Sin embargo se requiere alta concertación de biomasa para lograr la
síntesis de gran cantidad de producto XP

‹Una solución frecuentemente PERIODO DE CRECIMIENTO PERIODO DE PRODUCCION

Batch Fed-batch
utilizada consiste en realizar
P
X, P, V

la fermentación en dos períodos: V

X
primero un período de crecimiento
seguido de un periodo de producción
del metabolíto
T(h)

42
 HIPOTESIS:

• No hay mortalidad celular.

• Se aporta oxígeno en exceso
• La fuente de carbono es el sustrato limitante
• Los otros nutrientes se aportan en cantidades suficientes

La mayor parte de las ecuaciones utilizadas para los cultivos

batch, se aplican al periodo “fed-batch”.

Periodo de crecimiento (batch): Periodo de producción del

V= cte metabolíto (fed batch)
Se utiliza las siguientes ecuaciones

dV
dX µ S V ≠ Constante ⇒ >0
= rX → rX = max X dT
dT K S +S
dS rX
= −rS → rS = + mS X
dT YX / S

Balances de masa en el proceso:

S ≈ 0 : Durante el cultivo “fed-batch” el sustrato es completamente consumido a
medida que se va adicionando.
V0 (V = V0 ) : Volumen del medio de cultivo al inicio de la producción
VF (V < VF ) :Volumen al final de la producción
XP: Concentración de las células al inicio del periodo de producción

BALANCE DE BIOMASA:
‹La población total de células en el fermentador permanece constante:
V X = Constante (g)

‹El incremento en células es nulo:

d( VX)
= 0 .... con rX = 0 (no hay crecimiento)
dT

‹La variación de la concentración de biomasa depende de la dilución por

adición de sustrato: dX dV X
= −
dT dT V

43
 BALANCE DE SUSTRATO
La variación de la concentración de sustrato en el fermentador depende de:
‹La velocidad de consumo de sustrato por la célula (rS)
‹La dilución del medio por la adición de sustrato: (− dV S )
Sa dT V
‹El aporte de sustrato al fermentador: (Q )
V
‹Con estas consideraciones la variación en la concentración de sustrato está
dada por: dS dV S Sa
= − rS − +Q
dT dT V V

Considerando que la concentración en sustrato permanece constante y

próxima a 0 (S ≈ 0), la ecuación anterior se reduce a : dS dV S Sa
= −rS − +Q
dT dT V V

BALANCE DE PRODUCTO
La variación en la concentración del metabolito depende de:
‹La velocidad de producción está dada por rp
dV P
‹La dilución del producto por la adición de sustrato, está dada por (− )
dT V
dP dV P
= rP − con ⇒ rP = χ X
dT dT V

dV
Además , =Q (Q = Constante)
dT

En resumen:
⎛ dX ⎞
‹Las ecuaciones del periodo de rX = 0 ⇒ ⎜ = 0⎟
⎝ dt ⎠
producción de metabolitos de un Sa ⎛ dS ⎞
rS = Q ⇒ ⎜ = 0⎟
cultivo fed batch son: V ⎝ dt ⎠
dP P
= rP − Q ⇒ (rP = χ X )
dt V
‹ En el periodo de crecimiento
(correspondiente al cultivo “batch”), rX
rS = + mS X
se tiene: YX / S

‹ En el periodo de producción se tiene:

rP YP/S: Rendimiento de conversión de sustrato en producto (g de
rS = + mS X
YP / S producto/g de sustrato)

CONSIDERANDO LA MORTALIDAD CELULAR:

dX X Kd: Es la tasa de mortalidad celular (h-1)

= rX = − K d X − Q
dT V

La mortalidad celular tiene un efecto sobre la amplitud de la fase de producción, pero no afecta
la concentración final de producto. Por tanto sólo la productividad global del proceso es
afectada.

44
 EMPLEO DE LA FERMENTACIÓN FED BATCH EN LA PRODUCCION DE BIOMASA

Las hipótesis son similares a las mencionadas para la producción de metabolitos:

Presenta también dos períodos:

♦ Período de cultivo “batch” que corresponde a la constitución celular (pie de cuva)
♦ Período de cultivo “fed-batch” donde se procede al aporte progresivo de sustrato.

Las ecuaciones para el periodo batch se vieron anteriormente y para el periodo fed batch son
las siguientes:

PARA LA BIOMASA

La variación de la concentración de células depende de lo siguiente:

•Velocidad de división celular (rX)

⎛
•La dilución de las células en el medio dV X ⎞ dX dV X Q
⎜− ⎟ = rX − = µX − X
⎝ dT V ⎠ dT dT V V

PARA EL SUSTRTATO
dS dV S dV Sa dS S Sa Q
= −rS − + = −rS − Q + Q = [Sa − S] − rS
dT dT V dT V dT V V V

PARA EL VOLUMEN dV Variación del volumen de V0 a Vf

=Q
dT Caudal variable de Qmin a Qmax

Caso de un sustrato inhibidor

La alimentación (Q) se efectúa S X
de tal manera que se mantenga
la concentración en sustrato (S) INICIO DE LA
INICIO DE LA
ALIMENTACION
ALIMENTACION
por debajo de un valor crítico.
La instalación consta de un
PIE DE CUVA

PIE DE CUVA

sistema de medición en línea de S=CONSTANTE

dicho sustrato. El equipo ajusta
continuamente el flujo de
alimentación (Q) de manera que
0 T0 T 0 T0 T
la concentración (S) se
mantenga por debajo del valor
dS Q
crítico. S = constante. ....... = 0 ......... ⇒ [Sa − S ] = rS
dT V
rX
rS = + mSX
YX / S
Para la biomasa
dX Q S
= µX − X y µ = µ max
dt V KS +S

45
Caso de una levadura (ejm. Sacharomices cerevisiae)
sensible al efecto glucosa:
En este caso el fermentador es alimentado por una solución concentrada
de glucosa (Sa) en función de un parámetro que caracteriza el estado
fisiológico de la levadura. El parámetro elegido es el cociente respiratorio
(QR), que se define como la cantidad de CO2 producido por la levadura y
la cantidad de oxígeno consumido. QR debe estar próximo a 1 para un
buen funcionamiento del fermentador

Si QR > 1...⇒ El regulador disminuye la alimentación de

glucosa
Si QR = 1...⇒ El regulador mantiene constante la
alimentación de glucosa
Si QR < 1...⇒ El regulador aumenta la alimentación de
glucosa

VENTAJAS DEL CULTIVO “FED-

FED-BATCH”
BATCH

♦ Permite la utilización de sustratos que a cierta concentración

inhiben el crecimiento celular. Ejemplo hidrocarburos, etanol,
....
♦ Aumenta la concentración de biomasa y la productividad,
respecto a la producción “batch”.
♦ Favorece un metabolismo en detrimento de otro (fermentación o
respiración).
♦ La producción de metabolítos asociados a la fase estacionaria
gracias a la modulación del aporte de un sustrato (antibióticos,
hormonas, enzimas).

 Un cultivo “fed-batch” presenta menos riesgos de contaminación

y mutación que el cultivo continuo.

 Un cultivo “fed-batch” necesita de un sistema de regulación y de

control más costoso que en modo “batch” y además es más
difícil de poner a punto.

46
 PROCESOS EN LOS QUE SE HA UTILIZADO LA
FERMENTACION “FED-
FED-BATCH”
BATCH”
PRODUCTO TIPO DE ADICION
Levadura Melaza, fuente de N, P y Mg
Glicerol Azúcar, carbonato de Na
Acetona y butanol Mosto
Riboflavina Carbohidratos
Penicilina Glucosa y amonio
Proteasas Glucosa e hidrolizado de caseina
Novobiocina Varias fuentes de C y N
Acido glutámico Amonio
Griseofulvina Carbohidratos
Rifamicina Glucosa, ácidos grasos
Giberelina Glucosa
Vitamina B12 Glucosa
Tetraciclina Glucosa
Acido cítrico Carbohidrato y amonio
Lisina Etanol y urea; etanol y amonio
Proteína unicelular Metanol
Estreptomicina Glucosa y amonio

CULTIVO CONTINUO

‹ Se trata de un sistema abierto donde se añade continuamente solución

de nutrientes y se retira una cantidad equivalente de suspensión
celular (medio utilizado + células). De esta manera el volumen de
medio en el fermentador permanece constante.

‹ Se caracteriza por establecer un estado estacionario (estable)

permaneciendo todas las condiciones constantes (medio en que se
encuentran las células, población celular y estado fisiológico).

Qa, Sa Qs, X,
S, P V: Volumen de cultivo en el fermentador (L)
Q: Caudal de alimentación (L/h)
Sa: Concentración en sustrato limitante (g/L).

S V

V X P Generalmente (dV/dt)=0
Qa = Qs = Q

47
 Q
La tasa de dilución está dada por: D= (h-1)
V
El tiempo de permanencia del medio en el fermentador está dado
por: V 1
τ= = (h)
Q D

Ejemplo: si D = 0.5 h-1, significa que el caudal de alimentación es tal

que en una hora se renueva la mitad del volumen del fermentador. En
este caso el tiempo de permanencia es de 2 horas.

La concentración de biomasa (X), de sustrato (S) y de producto (P)

dependen del caudal de alimentación (Q) y por tanto de la tasa de
dilución (D):

BALANCE DE BIOMASA
Cambio neto en la biomasa = Crecimiento - salida

dX
= rX − DX = µX − DX = (µ − D)X
dT

BALANCE DE SUSTRATO
Cambio neto en la concentración de sustrato = Entra - Sale - Consumo

dS
= DSa− DS − rS = (Sa − S)D − rS
dT

BALANCE DE PRODUCTO
dP
= r P − DP
dT

‹ Una fermentación continua se inicia con un cultivo en batch, el

que continua hasta que las células alcancen una concentración o
estado fisiológico dado. Luego se empieza la fermentación
continua propiamente dicha.
‹ El cultivo continuo se diferencia del cultivo batch o fed-batch por
una alimentación continua de sustrato y retiro de una cantidad
equivalente de suspención celular, manteniendo constante el
volumen en el fermentador

48
 En un cultivo continuo la
evolución de la biomasa, sustrato y
X Sa
producto depende de la tasa de

g
dilución “D”. DX

Dmax: Tasa de dilución correspondiente

S
a la productividad máxima.
Dc: Tasa de dilución crítica. Dc=µmax 0
0 Dmax Dc
D
EFECTO DE LA TASA DE DILUCION SOBRE LA
Siempre D < Dc. CONCENTRACION DE BIOMASA EN EQUILIBRIO (X),
DE SUSTRATO (S), EL TIEMPO DE GENERACION (g) Y
En efecto si D >Dc o D > D max LA PRODUCTIVIDAD (DX)

dX dX S
D > µmax.......... ⇒ = (µ − D)X........ <0 X
dT dT B AT CH CO N T IN U A D >D C

S Sa
S

La concentración de cae hasta desaparecer y ser

reemplazada por medio fresco. Entonces se X
X 0

T
dice que se ha lavado completamente el
EVOLUCION DE PARAMETROS DE UN CULTIVO
CONTINUO CON LAVADO
cultivo.

‹En la práctica se elige D tal que: (0 < D ≤ Dc) ó (0 < D ≤ µmax). En

todos los casos de valores posibles de tasa de dilución los parámetros de
cultivo tienden hacia un estado estacionario “aparente”, definido por el
establecimiento del equilibrio:

‹En el periodo de transición (antes de llegar al equilibrio) la biomasa

aumenta y el contenido de sustrato disminuye debido al consumo

dX (dX/dt) >>> 0, que significa que la biomasa

= (µ max − D)X con (µ max − D) >>> 0
dT
aumenta rápidamente

dS
= (Sa − So)D − rS con So ≈ Sa (dS/dt) <<< 0, que significa que la sustrato
dT
Por lo tanto rS >> (Sa − So)D disminuye debido al consumo

‹ Cuando se establece el equilibrio:

dX dX
“X” y “S” tienden al equilibrio:
= (µ − D ) X = 0 =0 ⇒ µ−D= 0 X Xeq y S Seq
dT dt

49
 QUIMIOSTATO
‹En el caso del quimiostato la tasa
Inicio de la
de crecimiento alcanzada en el LnX alimentación
Batch Quimiostato
equilibrio µeq < µmax, es el resultado Xeq
de una concentración limitante en
sustrato Seq. Es entonces la
concentración en sustrato limitante µ < µmax

en el equilibrio lo que controla el

cultivo continuo.
Seq

T
‹El nombre quimiostato se debe a
que el estado estacionario resulta ESTABLECIMIENTO DEL EQUILIBRIO
EN UN CULTIVO CONTINUO TIPO
de la acción limtante de un
QUIMIOSTATO
elemento químico
dX dX
D < µmax.......... ⇒ = (µ − D)X........ >0
dT dT

SE INCREMENTA LA BIOMASA: X→Xeq; S→Seq µ→µeq

‹ El Cultivo es controlado por la concentración en sustrato. En efecto

la estabilidad del sistema se basa en la limitación de la tasa de

crecimiento por la concentración en sustrato limitante (C, N, P, S,

O2.....).

‹ Al iniciar el quimiostato los parámetros de cultivo varían hasta alcanzar el estado

estacionario (equilibrio).

‹ El estado estacionario resulta de la acción limitante de un elemento químico del

medio de cultivo (sustrato limitante).

‹ Consideremos un modelo simple con un sólo sustrato limitante (fuente de carbono)

el oxígeno se aporta en exceso y la mortalidad celular es despreciable. En estas

condiciones:

X = Xeq (concentración de biomasa en el equilibrio)

S = Seq (concentración de sustrato en el equilibrio)

50
 En equilibrio se aplican las siguientes ecuaciones:

dX S
= µX − DX = 0 µ = µmax .....⇒µ = D
........en el equilibrio
dT KS + S
dS
= − r S − DS + DSa = 0 Seq KS D
dT D = µmax ..........⇒ Seq=
KS + Seq µmax− D

D(Sa − Seq) = rS
rX
rS = + m S Xeq
Y X/S
rX DXeq
D(Sa − Seq) = + m S Xeq = + m S Xeq =
Y X/S Y X/S
⎛ D ⎞
Xeq ⎜⎜ + m S ⎟⎟
⎝ Y X/S ⎠

YX / S D
Xeq = (Sa − Seq)
D + mS YX / S

La concentración de sustrato limitante en el equilibrio, depende

únicamente de la tasa de dilución {Seq = KS (D/µmax-D)}. Es
independiente de la concentración del sustrato limitante en la
alimentación (Sa). Como KS, es muy pequeña, Seq será muy pequeña
cuando D<<Dc (Ver Figura):

‹Se observa que cuando la tasa de

dilución varía entre 0 y Dmax, sólo
X
Sa existe una variación muy pequeña
de “S” y “X” en equilibrio.
g

DX ‹Si se desprecia la energía de

mantenimiento mS:

Xeq ≈ YX/S (Sa - Seq)

S

La concentración celular en el
0 equilibrio es función de la
0 Dmax Dc concentración de sustrato limitante
D en el equilibrio (Seq

51
‹Considerando que Seq es muy pequeña (Seq<<<Sa), se tiene:
Xeq ≈ YX/S Sa

‹El tiempo de generación (g) disminuye cuando aumenta la tasa de dilución:

Ln2 Ln2
g= ................ ⇒ µeq = D............ ⇒ g =
µeq D
‹La productividad varía según:
Pr oductividad = Xeq D = YX / S (Sa − Seq) D (g/Lh)

‹La productividad máxima se obtiene al hacer ⎨(d Productividad /d Xeq) =0⎬

La productividad es máxima para:

⎧⎪ KS ⎫⎪
D = Dmax = µ max ⎨ 1 − ⎬
⎪⎩ K S + Sa ⎪⎭

En resumen lo observado en la ecuaciones anteriores para Xeq y Seq con respecto

a la tasa de dilución (D) permite concluir que los cultivos en quimiostato utilizan
una gama de tasa de dilución comprendida entre 0 y Dmax (varios valores de
Seq).

Desde un punto de vista práctico, los quimiostatos pueden constituir una

herramienta valiosa en muchos estudios fundamentales :

♦ Permite proveer de microorganismos en fase de crecimiento exponencial

para una tasa (estandarización).

♦ Mantiene las condiciones constantes para un largo período, con una gran
cantidad de células, facilita el estudio de selección de mutantes.

♦ Los quimiostatos pueden trabajar eficientemente con bajos niveles de

nutrientes, lo que permite la simulación de condiciones naturales en
estudios ecológicos.

♦ Los quimiostatos son ventajosamente utilizados en la determinación de

parámetros cinéticos Ks y µmax:
♣ Esta determinación se basa en la gráfica: 1/µ = ƒ(1/S).
♣ En el quimiostato se evalúa: 1/D = ƒ(1/Seq)
En este último caso tres o cuatro determinaciones son suficientes
para establecer los parámetros cinéticos.

El cultivo continuo en quimiostato, cuya tasa de dilución puede variar entre 0 y

Dmax, es interesante para la optimizar de medios de cultivo en fermentación.

52
 TURBIDOSTATO
‹La tasa de dilución se puede elegir de tal manera que se igual a a tasa de crecimiento

máxima : D = µmax
dX
= ( µ max − D ) X = 0 Puesto que X = Xo = cte .
dT

‹En estas condiciones el sustrato no es un factor limitante y la

concentración de células en el equilibrio puede elegirse
arbitrariamente.
‹En términos generales, en el quimiostato la tasa de crecimiento (µ) es
controlada por la tasa de dilución (D) que mantiene la concentración
en sustrato limitante constante.
‹En el turbidostato, la concentración en biomasa (X) es con frecuencia
controlada a través de la regulación de la tasa de dilución.

‹Se basa en mantener constante la concentración celular (turbidez).

‹Las variaciones en la turbidez indican modificación de la biomasa y se miden

gracias a un dispositivo óptico alimentado por una bomba..

‹De esta forma al biomasa requerida se mantiene constante regulando la tasa

de dilución (D).

‹El turbidostato contiene en exceso todos los elementos nutritivos y el

microorganismo crece con una tasa próxima a µmax.

‹El turbidostato es menos empleado que el quimiostato, debido a la dificultad

de medir la turbidez en fermentadores de paredes opacas. Actualmente se
emplean métodos indirectos como la producción de CO2 ó el consumo de O2
que responden a los cambios ocurridos en la población microbiana.

53
 LnX
X

3 TURBIDOSTATOS
DIFERENTES
3

Batch
2
µ=µmax
1

INICIO DE LA
ALIMENTACION

Como el cultivo está en fase de crecimiento

exponencial:
dX
= (µ − D )X = 0 ⇒ µ-D = 0
dT
µ = µ max
µ ma x = D
La tasa de dilución se elige de tal manera que
esta sea igual igual a µmax

EN RESUMEN LOS DIFERENTES MODELOS DE

FERMENTACION CONTINUA SON

TASA DE TIPO DE CULTIVO EVOLUCION DE LOS

DILUCION CONTINUO PARAMETROS

X--Æ0
D > µmax Lavado
S--ÆSa
X ----Æ Xeq
D < µmax Quimiostato S-----Æ Seq
µ--Æ µeq = D
X = Cte
D = µmax Turbidostato
µ = µmax

54
 PROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO CONTINUO

Contaminación e inestabilidad genética

Î La contaminación es un serio problema principalmente cuando la fermentación
se realiza por largos períodos.

Î La contaminación y aparición de mutantes dependerá de la tasa de crecimiento

de estos (µc) respecto al microorganismo original (µo) .Hay tres posibilidades:

− µo < µc: La población de microorganismo mutante o contaminante aumenta

rápidamente y reemplaza progresivamente al microorganismo original. Es un
problema del cultivo continuo de pequeña tasa de crecimiento.

− µo = µc: La población de microorganismo mutante o contaminante tiene una tasa

de crecimiento igual a la del microorganismo original. Se puede controlar si la
velocidad de entrada del contaminante o de mutación son bajas mutante Es un
problema del cultivo continuo de pequeña tasa de crecimiento.

− µo > µc: La población de microorganismo mutante o contaminante es baja. No

ocasiona problemas salvo que la velocidad de entrada del mutante o velocidad de
mutación sean altas.

Î La contaminación en el cultivo continuo es un problema difícil de resolver a escala

industrial. Sin embargo ciertos medios o condiciones de cultivo (pH ácido o
alcalino, medio mineral, sustratos específicos,....) limitan considerablemente las
infecciones.

Î Las mutaciones espontáneas son muy difíciles de controlar.

APLICACIÓN DEL CULTIVO CONTINUO

Î PRODUCCIÓN DE VINAGRE (FERMENTACIÓN ACÉTICA)

‹ Producción de ácido acético a partir de soluciones de etanol y otros
nutrientes.
‹ La presencia de etanol y el pH bajo durante la producción limitan el
riesgo de infecciones.

Î TRATAMIENTO BIOLOGICO DE AGUAS RESIDUALES

AGUA TRATADA

REACTOR DECANTACION
AEROBIO

RECIRCULACION DE BIOMASA

55
Î PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA UNICELULAR (SINGLE-CELL PROTEIN)

Na
K
Agua Mg Metanol

Preparación Esterilización
del medio continua
Fermentación
continua

Centrifugación

Reciclaje

Secado

Single-cell protein

EL PROCESO BIOTECNOLOGICO

CONSERVACION AMPOLLA
LIOFILIZADA
(VARIOS MESES)
RECUPERACION, EXTRACCION

REGENERACION SOBRE CALDO

NUTRITIVO Y REPIQUE EN AGAR
INCLINADO (24 h-10 DIAS)
PURIFICACION

PRIMERA ETAPA DE MULTIPLICACION

SOBRE MEDIO LIQUIDO
(15 a 24 h)

PRODUCCION EN
FERMENTADOR PRINCIPAL
(24 a 150 h)
SEGUNDA ETAPA DE MULTIPLICACION
EN FERMENTADOR
24 a 36 h

56
 ESQUEMA DE UNA INSTALACION AUTOMATIZADA DE FERMENTACION

GAS MEDIDAS
PREPARACION DEL •CO2
MEDIO DE CULTIVO ESTERILIZACION •O2
BIO-REACTOR •T° cultivo
•T° esterilización
•Velocidad de agitación
•Potencia consumida
•pH
•Viscosidad
•Potencial redox
PREPARACION DEL INOCULO

CONTROLES
•T°
COMPRESOR •P
•pH
•Caudal de gas
FILTRO •Espuma
ESTERILIZANTE •Agitación,.....

FILTRO DE ACEITE

BASES TECNOLOGICAS Y MICROBIOLOGICAS EN LA CONCEPCION DE

BIORREACTORES

P P,X

rP

Ciné
Cinética
X µ
rX, rS, r0

Medio
Reactivos pH, T°, CL,η,σ Sustrato

Fenó
Fenómenos de
transferencia
N, P/V; TM, KT, Qa, KLa

Agitació
Agitación-aireació
aireación

57
 BIORREACTOR

MANTIENE EN CONTACTO: CELULAS-LIQUIDO (S)-GAS

SUSTRATOS: MEDIO CELULAS

TRANSFERENCIA PRODUCTOS: CELULAS MEDIO

DE MASA: REACTIVOS: MEDIO MEDIO

O2 : GAS MEDIO CELULAS

TRANSFERENCIA DE MEDIO INTERCAMBIADOR

CALOR
CÉLULAS MEDIO INTERCAMBIADOR

ASEPTICO
MANTENER LA INTEGRIDAD DE LAS CÉLULAS

Addition de
base et/ou acide
Sortie d’
d’air
Arrivé
Arrivée de l’
l’inoculum

Broyeur de mousse

Systè
Système d’d’agitation
à palettes

Sonde tempé
température Pré
Prélèvements
Sonde O2 et/ou pH

Milieu de culture

Circuit de
refroidissement
et maintien de
tempé
température

Arrivé
Arrivée d’
d’air filtré
filtré

sché
schéma gé
général d’
d’une Moteur
cuve de fermentation

58
 TRANSFERENCIA DE OXIGENO
‹Es esencial en el metabolismo aerobio productor de energía: aceptor final de
elctrones y protones producidos por las reacciones de oxidación.

‹Ciertas bacterias (Clostridium), no poseen las enzimas necesarias para el

metabolismo aerobio. De otra parte el H2O2 que ciertas ciertas bacterias producen
y no pueden eliminar inhibe su crecimiento.

‹El oxígeno interviene en mecanismos de regulación del metabolismo de manera

directa, como inductor o represor de las enzimas respiratorias. Pero también de
manera indirecta por su rol en le metabolismo energético

‹La demanda de oxígeno es representada por Qo2 que se define como la cantidad
de oxígeno consumida por unidad de tiempo, volumen y por unidad de biomasa.
QO2X (mmoles de O2/L h)

‹Igualmente la cantidad de Co2 producida durante la fermentación se

representa por:
QCO2X (mmoles de CO2/L h)

EVOLUCION DEL CONSUMO DE OXIGENO DURANTE EL

CRECIMIENTO MICROBIANO

X
K L aC*

CL

QO 2

QO 2X

La tasa de crecimiento se puede escribir: O2

µ = µm
K O2 + O 2

Se puede deducir que si concentración de O2 es inferior a la concentración

crítica (O’2), la tasa de crecimiento es inferior a la tasa de crecimiento
máxima y proporcional a la concentración de oxígeno.

59
 MODALIDADES DE LA TRANSFERENCIA DE OXIGENO
Etapas en la transferencia de oxígeno
Etapa 1

Etapa 2
Célula
Etapa 5
BURBUJA Etapa 3
GASEOSA

Etapa 4

Película líquida

Película gaseosa

Las teorias más importantes para establecer la ecuación de

transferencia de oxígeno son:

‹La teoría de las películas laminares

‹La teoria de la difusión continua

TEORIA DE LAS PELICULAS LAMINARES

‹ Al interior de la burbuja de
gas se establece un
gradiente de presión parcial INTERESA GAS-LIQUIDO
de oxígeno debido a la
presencia de la película
Película
gaseosa gaseosa Ci
P
‹ La prseión parcial de
oxígeno en la interfase Pi,
esta en equilibrio con la
concentración Ci de oxígeno FASE GASEOSA Pi
CL
disuelto FASE LIQUIDA

‹ En el líquido se establece un Película

líquida
gradiente de concentración
de oxígeno disuelto debido a
la película liquida.

60
Para establecer la ecuación de transferencia se supone que:

Que el regimen es estacionario (independiente del tiempo) y que equilibrio

entre Pi y Ci se alcanza instantaneamente cuando el gas y el líquido se
ponene en contacto.

dC L
La ecuación de transferencia es: = K G a (P − P*) = K L a (C * −C L )
dt
Donde:

dCL/dt = Velocidad de transferencia de oxígeno (mmoles de O2/L h)

KG = Coeficiente global de trnasferencia de masa respecto a la película gaseosa
(Cm/h)
KL = Coeficiente global de trnasferencia de masa respecto a la película líquida
(Cm/h)
a = Superficie específica de transferencia (Cm2/Cm3)
P* = Presión parcial de oxígeno (atm) en equilibrio con CL
C* = Concentración de oxígeno disuelto (mmoles de O2/L) en equilibrio con la
presión parcial de oxígeno en la fase gaseosa (P)

TRANSFERENCIA DE OXIGENO SEGUN LA TEORIA DE DIFUSION

CONTINUA

• La transferencia de oxígeno se da a
través de una película única de
pequeño espesor y en regimen C*
estacionario
• Suponiendo un mecanismo de transferencia
unidireccional, la ley de Fick se escribe: BURBUJA LIQUIDO
DE GAS
dC L CL
= K L a (C * −C L )
dt
e
Donde:
dCL/dt = Velocidad de transferencia de oxígeno (mmol O2/Lh)
KL = Coeficiente de transferencia de masa (cm/h)
a = Superficie específica de transferencia (Cm2/Cm3)
CL = Concentración de O2 disuelto en el líquido (mmolO2/L)
C* = Concentración de O2 disuelto, en equilibrio con la burbuja de gas
(mmolO2/L)

• En todas las ecuaciones C*, representa la concentración de

oxígeno disuelto correspondiente a la saturación.

61
 Durante la ferementación:
dC L
= K L a (C * −C L ) − Qo 2 X
dt

Donde Qo2X representa la cantidad de O2 consumido por unidad

de volumen (mmoles/Lh)

En ausencia de microorganismos se tiene:

dC L
= K L a (C * −C L )
dt

Si la transferencia de O2 es cero (no hay agitación

aireación):
dC L
= − Qo 2 X
dt

Si no hay variación en la concentración de O2 disuelto

(CL, cte): dC L Qo 2 X
=0 K La =
dt C * −C L

METODOS PARA DETERMINAR KLa

La medición de KLa (h-1), denominado también coeficiente

voluméterico, permite determinar la capacidad de transferencia de
oxígeno del reactor

Los factores sobre los que se puede actuar para influir en la

velocidad de transferencia son: KLa y C* -CL

‹ Reemplazando el air por oxígeno puro se aumenta el

potencial de transferencia C* -CL
‹ Para aumentar KLa es necesario trabajar sobre la agitación

‹ Método del sufito

‹ Método de la glucosa oxidasa
‹ Método microbiológico
‹ Métodos de determinación con sensores
• Método estático
• Método dinámico

62
 OXIDACION DEL SULFITO
• Se basa en la oxidacion del sulfito a sulfato en presencia de un catalizador.
• Se añade al medio de fermentacion Na2SO3 (1N) y catalizador (10-3 M Cu2+ o Co2+) y se
inicia la aireación en las condicones que se quiere determinar Kla.
• La reacción de oxido reducción es la siguiente es la siguiente:
SO3 -- + H2O SO4-- + 2 H + + 2 e -
1/2 O2 + H2O + 2 e - 2 OH -
• La velocidad de la reacción es limitada por la velocidad de disolución del oxígeno
• A diferentes intervalos de tiempo se toma una muestra y se determina el sulfito residual
por yodometria
SO3 -- + n I2 + H2O SO4-- + 2 I - + 2 H + + (n-1) I2
• El yodo en exceso se determina por :
2 S2O3 -- S4O6 --- + 2 e - I2 + 2 e -
2I -

• Siempre que se tenga sulfito CL es cero (reacción rápida)

dCL K L a C * = Velocidad de oxidacion del sulfito
= K La (C * −CL ) − Qo2 X
dt Pendiente de la recta concen. de sultifo vs tiempo

• Es un metodo simple y poco costoso. Es necesario evitar que las muestras tomadas esten expuesta
al aire
• Tiene la desventaja de que la solución de sulfito no reacciona de la misma manera que el cultivo

METODOS ESTATICOS (EN AUSENCIA DE

MICROORGANISMOS) O DE DESGASIFICACION ESTATICA
‹ En ausencia microorganismos y en
las condiciones en que se
desarrollará la fermentación se
determina el KLa. Detener la
CL aireación e
inyectar N2
‹ Después de saturar el medio en
oxígeno disuelto, se detiene la
aireación y se inyecta N2 en la
solución.

‹ La concentración de O2 disuelto
Retomar la
tiende a cero aireación

‹ Después de retomar la aireación, la

concentración de O2 disuelto 0
aumenta; este aumento depende de t
la capacidad de transferencia del
equipo.

63
De dos maneras se puede determinar KLa
Método 1: Método 2:

Integrando la ecuación:
Considerando que: dC L
dC L = K L a (C * −C L )
= K L a (C * −C L ) − Qo 2 X dt
dt
Al momento de retomar la aireación t0 y CL =
0, para un tiempo t el valor CL
Pero Qo2X=0
dC L
dC L ∫ C * −C L = K L a ∫ dt
= K L a (C * −C L )
dt C*
Ln = K La t
dCL C * -C L
dt Luego gráficamente se obtiene

Ln C*/ (C*-CL)
)α
)α
α = KLa
α = KLa
C*-CL
t

METODO DINAMICO (DESGASIFICACION DINAMICA)

Tiene la gran ventaja de determinar el KLa durante el desarrollo de la
fermentación. Consta de las siguientes etapas:

dC L
Î En primer lugar se debe llegar al = 0 = K L a (C * −C L ) - Qo 2 X
equilibrio entre la transferencia y dt
consumo de oxígeno (CL=cte).
Qo 2 X
CL = C * −
Despejando se obtiene: K La

Î En segundo lugar se detiene la dC L

= - Qo 2 X
aireación y por tanto KLa = 0; luego dt
Detener la
CL aireación
CL
Î En tercer lugar se reestablece
las condiciones de aireación y
Qo2X(
la ecución se puede escribir : Retomar la
aireación
1 dC L
CL = − ( + Qo 2 X ) + C *
K L a dt 0
t

64
 Para diferentes intervalos de CL
tiempo se determina CL a
través del sensor y los cálculos
se realizan según la gráfica
siguiente: 1/KLa (
1 dC L
CL = − ( + Qo 2 X ) + C *
K L a dt
dCL
+Qo2X
dt

El problema también se puede resolver matemáticamente

METODO DEL BALANCE GASEOSO

Es un método interesante ya que permite la determinación del KLa “en
linea” y su siguimiento durante la fermentación. Se basa en la ecuación
global de transferencia de oxígeno. dC L
= K L a (C * −C L ) - Qo 2 X
dt

Puesto que en el equilibrio CL es constante, se tiene: Qo 2 X

K La =
C * −C L

A través del balance gaseoso, se determina el consumo de oxígeno:

Q1 (L/min)
P1 (atm)
T1 (°K)
F1 (molO2)

7,31 . 10 5 ⎛ P0 Q 0 Y0 PQ Y ⎞
Qo 2 X = ⎜⎜ − 1 1 1 ⎟⎟
V ⎝ T0 T1 ⎠

Qo (L/min) CL
Po (atm) V Midiendo a través de sensores
To (°K)
Fo (molO2) CL y conociendo C*, se puede
determinar KLa

65
Cuando se emplea grandes fermentadores, es necesario

tener en cuenta ciertas precauciones. En efecto el aire que

es introducido en la base del tanque, a medida que asciende

se empobrece en oxigeno, por lo qe se aplica la sigiete

ecuación:

Qo 2 X
K La =
(C * e − C L ) − (C * s - C L )
C * e − CL Donde C*e y C*s, son las
Log
C * s − CL concentraciones de
saturación en oxígeno
correspondientes a la
entrada y salida
respectivamente.

INFLUENCIA DE LOS CONSTITUYENTES DEL MEDIO SOBRE LA

TRANSFERENCIA DE OXIGENO

Influencia de las sales

La presencia de sales modifica la concentración de oxigeno
disuelto en la fase acuosa y las características de dispersión:
Disminuye el KL y aumenta la superficie especifica (a), el valor
de KLa generalmente aumenta.
K L a (sal )
Se observa la relación: ≈ 10
K L a (agua )

Agentes tenso-activos
Disminuye el diámetro de las burbujas de gas (aumenta la
superficie) y de otra parte forma películas rígidas alrededor de
las burbujas. Disminuye el coeficiente de transferencia.

Compuestos orgánicos miscibles de bajo peso molecular

Aumenta la superficie de transferencia debido a una
disminución de la tensión superficial.

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