CAPITOLUL IV

METODE FIZICO - CHIMICE DE ANALIZĂ BIOCHIMICĂ

4.1. pH - generalităţi
pH-ul este o noţiune fizico-chimică prin care se caracterizează reacţia unui mediu (acidă,
bazică sau neutră) şi reprezintă concentraţia ionilor de hidrogen prezenţi în mediul respectiv.
Concentraţia ionilor de hidrogen dintr-o soluţie poate varia între limitele 1-10-14, fiind corelată
cu concentraţia ionilor de hidroxil, conform relaţiei produsului ionic al apei:
[ H+] . [OH-] = 10-14
Întrucât limitele de variaţie ale acestor concentraţii sunt foarte largi, se foloseşte termenul de
pH, introdus de Sorensen, care reprezintă logaritmul zecimal negativ al concentraţiei ionilor de
hidrogen adică exponentul sau puterea la care trebuie ridicat numărul 10 (baza logaritmului
zecimal), pentru a exprima valoarea concentraţiei în echivalenţi gram de ioni de hidrogen.
1
pH = -lg[H ]= lg 
+

[H+]
Legătura dintre pH şi [H ]este dată de relaţiile:
+

1
+
[H ]= 10 -pH
= 
10pH
pH-ul poate varia între limitele 0-14.
Soluţiile cu pH =7 sunt neutre, cele cu pH< 7 sunt acide iar cele cu pH > 7 sunt alcaline.
În lichidele biologice pH-ul are valori relativ constante, care pot însă varia între limite
strânse, de exemplu:
 în sânge pH = 7,3 - 7,5 media fiind de 7,36
 în stomac pH = 1,5- 2,5
 în intestin pH= 7,8 - 8,7
În cazuri patologice se pot produce modificări ale valorilor normale ale pH-ului. Astfel, în
sânge scăderea pH-ului sub limitele normale se numeşte acidoză (în caz de diabet, de acumulare
de corpi cetonici sau acid lactic), iar creşterea pH-ului sanguin peste limitele normale se numeşte
alcaloză.
Determinarea pH-ului se poate face prin două metode: colorimetrice şi potenţiometrice.

4.1.1. Determinarea pH-ului cu hârtie indicatoare

Principiul metodei
Determinarea pH-ului se bazează pe proprietatea indicatorilor de a-şi modifica culoarea în
funcţie de concentraţia ionilor de hidrogen. Hârtia indicatoare de pH este impregnată cu diferiţi
indicatori (indicatori universali). Este o metodă colorimetrică.
Hârtia indicatoare de pH se prezintă fie sub forma unor carnete sau pliante, fie sub forma
unor discuri închise într-o cutie de material plastic pe al cărei capac sunt indicate nuanţele de
culori etalon corespunzătoare diferitelor valori de pH.

Fig.4.1. Hârtie indicatoare de pH (mod de prezentare)

Modul de lucru:
Dintr-o bandă de hârtie indicatoare de pH se taie cu o foarfecă mai multe porţiuni mici. Cu o
pensetă se ia o bandă şi se umectează în soluţia a cărui pH vrem să-l determinăm. Banda se va
colora şi apoi se compară culoarea benzii cu culoarea de pe scala etalon de culori. Identitatea de
culoare înseamnă identitatea de pH.

36
 4.1.2. Metoda potenţiometrică de determinare a pH-ului
Principiul metodei
Determinarea pH-ului pe cale potenţiometrică este o metodă electrochimică şi se bazează
pe măsurarea diferenţei de potenţial electric care se stabileşte între doi electrozi introduşi în soluţia
de analizat. Unul dintre electrozi, cel negativ, este electrodul indicator, cel mai utilizat fiind
electrodul de sticlă sau de măsură (figura 4.2).

Fig.4.2. Electrod de sticlă Fig. 4.3. pH- metrul

Al doilea electrod, cel pozitiv este un electrod de referinţă (electrod de calomel sau electrod
de AgCl) al cărui potenţial este întotdeauna constant.
Cei doi electrozi se leagă la bornele + şi - ale unui aparat numit potenţiometru sau pH-
metru, care este un milivoltmetru electronic. Valoarea intensităţii curentului de măsurat este astfel
foarte mică împiedicând descărcarea pilei galvanice formată din cei doi electrozi, în timpul
măsurării.
Modul de lucru
 Se spală electrozii în paharul Berzelius cu apă distilată şi se clăteşte cu soluţie tampon de
etalonare cu pH cunoscut.
 Electrozii se introduc într-o soluţie tampon cu pH cunoscut. Cu un termometru se măsoară
temperatura soluţiei. Butonul compensator de temperatură se aduce la valoarea temperaturii
de lucru.
 Se conectează electrodul de calomel la borna (+) şi electrodul de sticlă la borna (-) a
aparatului.
 Se verifică dacă aparatul este potrivit la tensiunea de alimentare în priza stabilizatorului.
 Se conectează stabilizatorul la reţea şi după 5 minute se aduce întrerupătorul 1 în poziţia de
funcţionare. Becul roşu semnalizator trebuie să se aprindă.
 După 5-10 minute (timpul de încălzire al aparatului), comutatorul se aduce de pe poziţia de
zero pe poziţia de lucru dorită (pe domeniul de pH de la 0-7 sau de la 7-14).
 Acul indicator al instrumentului de măsurat se aduce prin rotirea butonului de fixare a pH-ului,
la pH-ul soluţiei tampon.
 Se verifică buna funcţionare a aparatului cu cel puţin o soluţie tampon etalon. Aparatul trebuie
să indice pH-ul soluţiei. În felul acesta aparatul este gata pentru lucru.
 Se introduc electrozii în soluţia a cărui pH vrem să-l determinăm şi se aduce comutatorul pe
poziţia 0-7 pH. Dacă acul se opreşte în acest interval, pH-ul soluţiei cercetate se găseşte în
domeniul acid şi se citeşte pe scala aparatului. Dacă acul depăşeşte valoarea 7, se mută
comutatorul pe domeniul 7-14 de pH. Se citeşte valoarea căutată pe scala aparatului care în
acest caz se găseşte în domeniul alcalin.

4.2. Sistemele tampon

Sistemele tampon sunt amestecuri de soluţii care au proprietatea de a menţine practic

constant pH-ul soluţiei la diluarea acesteia respectiv la adăugarea de cantităţi mici de acizi sau de
baze tari.
Sistemele tampon pot fi constituite din:
1) Acizi slabi şi sărurile lor cu baze tari;
2) Baze slabe şi sărurile lor cu acizii tari;
3) Săruri primare şi secundare ale acizilor polibazici.
Valoarea pH-ului unui sistem tampon este dată de ecuaţia Henderson-Hasselbach:

37
 [ A-]
pH = pK + log 
[ AH ]
Exemplul din prima categorie este amestecul de acetat de sodiu (CH3-COONa) şi acid
acetic (CH3COOH). Mecanismul de acţiune al acestui sistem tampon la adăugarea de acizi tari
este următorul:
CH3COO-+ Na+ + CH3-COOH + H+ Cl- = Na+ Cl - + 2CH3COOH
În locul fiecărui echivalent gram de acid clorhidric se va forma un echivalent gram de acid
acetic care fiind un acid slab, practic nu disociază şi pH-ul soluţiei se modifică foarte puţin în urma
blocării ionilor de hidrogen introduşi în soluţie prin formarea acidului slab, nedisociat.
Mecanismul de acţiune al aceluiaşi sistem tampon la adăugarea de baze tari va fi în acest
caz:
CH3-COO- + Na+ + CH3COOH + Na+ + OH-= 2 CH3COO- + 2Na+ +H2O
Ionii de hidroxil introduşi în soluţie prin baza tare vor reacţiona cu ionul carboxil din molecula
de acid acetic, cu formarea unei molecule de apă, de asemenea, practic nedisociată. pH-ul soluţiei
nu se va modifica nici în acest caz deoarece ionii de hidroxil nu rămân liberi în soluţie.
Sistemul tampon descris va avea acţiunea de tamponare maximă la valori pH = pKa şi
intervalul de tamponare va fi pKa ± 1,7.
Pentru a obţine un efect de tamponare într-un interval mai mare de pH se folosesc sisteme
tampon universale care conţin acizi polibazici şi sărurile primare şi secundare ale acestora.

4.2.1.Prepararea unui sistem tampon universal

Modul de lucru
Se iau 9 eprubete curate şi uscate numerotate de la 1 până la 9, şi se introduce cu ajutorul
unei pipete volume de amestec de acid citric 0,1 M şi acid boric 0,1 M în raport de 1/1(25 ml acid
boric 0,1M + 25 ml acid citric 0,1M) şi soluţie de NaOH 0,1 N în cantităţile prevăzute în tabelul nr.1.
Tabel nr. 4.1 Sistem tampon universal
Nr. epr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
amestec 7,7 6,1 4,8 3,9 3,7 3,55 3,3 2,9 2,1
acizi

NaOH 2,3 3,9 5,2 6,1 6,3 6,45 6,7 7,1 7,9
0.1M
pH 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Culoarea roşu roşu- porto- galben verde- verde albas violet violet
indicat. portocaliu caliu gălbui -tru roşcat

În fiecare eprubetă se mai introduc cu ajutorul unei pipete picurătoare câte 6 picături de
indicator universal şi se agită. Se obţin soluţii cu valori de pH cuprinse între 3 şi 11 (coloana a 4-a),
iar culoarea soluţiei după introducerea indicatorului universal variază între roşu şi violet roşcat
(coloana a 5-a din tabel).Sistemul tampon va avea acţiunea de tamponare în tot intervalul de pH
menţionat, deoarece fiecare dintre cele 3 constante de aciditate ale acizilor folosiţi (acidul citric şi
acidul boric) vor acţiona ca sisteme tampon independente în intervalul de tamponare de pKa ± 1,7.
HO CH COOH OH
CH COOH B OH
CH2 COOH OH

Acid citric Acid boric

Interval de tamponare Interval de tamponare

acid citric acid boric
pKa1 = 3,06 1,36 - 4,76 pKa1 = 9,14 7,44 - 10,84
pKa2 = 4,74 3,04 - 6,44 pKa2 = 11,74 10,04- 13,4
pKa3 = 5,40 3,70 - 7,10 pKa3 = 13,80 12,10- 14

38
 4.2.2.Punerea în evidenţă a acţiunii de tamponare a sistemului tampon
Experienţa 1
Una dintre soluţiile sistemului tampon se împarte în 3 fracţiuni. Se toarnă încă în două
eprubete câte 1/3 din conţinutul eprubetei nr.5 care are pH =7.
Într-una din eprubete se adaugă 2 - 3 picături de HCl 0,1n, iar în alta 2-3 picături de NaOH
0,1n. Se compară nuanţa celor două eprubete cu cea a eprubetei în care nu s-a introdus nici acid
nici bază. Se constată că în nici o eprubetă culoarea nu s-a modificat ceea ce înseamnă că pH-ul
soluţiilor a rămas constant datorită acţiunii sistemului tampon.
Experienţa 2
Se iau 3 eprubete curate şi se introduc în fiecare câte 10cm3 apă distilată (sau deionizată) şi
6 picături de indicator universal.
În prima eprubetă de introduc 2-3 picături de HCl 0,1n şi în cea de-a doua eprubetă 2-3
picături de NaOH 0,1n. Se compară culoarea eprubetelor cu cea de a treia eprubetă în care nu s-a
introdus acid sau bază.
Se constată în prima eprubetă virarea culorii indicatorului spre roşu iar în cea de-a doua
culoarea virează spre albastru, ceea ce înseamnă că pH-ul apei distilate a fost influenţat prin
adăugarea de H+ sau de HO-, ca urmare a absenţei sistemelor de tamponare.
Experienţa 3
Se iau 3 eprubete curate şi uscate şi se introduc în fiecare câte 10 cm3 de apă de robinet şi 6
picături de indicator universal.
Se introduc în prima eprubetă 2-3 picături de HCl 0,1n şi în cea de a doua eprubetă 2-3
picături de NaOH 0,1n. Se compară culorile primelor două eprubete cu cea de a treia eprubetă,
constatându-se că pH-ul primelor două eprubete se modifică foarte puţin datorită prezenţei în apa
de robinet a sistemelor tampon datorate acizilor carbonic şi fosforic precum şi a sărurilor acestora.

4.2.3. Măsurarea puterii de tamponare a sângelui şi a urinii

Puterea de tamponare reprezintă cantitatea de acid sau bază necesară pentru a schimba
valoarea pH-ului cu o unitate.
Principiul metodei
Pentru determinarea puterii de tamponare a serului sanguin sau a urinii este necesar să se
determine în prealabil pH-ul acestora. Se adaugă apoi o cantitate mică de soluţie de HCl 0,1 n şi
se determină din nou pH-ul. Raportul dintre numărul de cm3 de acid adăugat şi variaţia pH-ului ce
s-a produs reprezintă puterea de tamponare a lichidului biologic de determinat.
Modul de lucru
Se determină pH-ul serului sanguin sau al urinii cu pH-metrul.
Se introduc într-o eprubetă 2 cm3 ser sanguin sau urină şi se adaugă cu ajutorul unei pipete
0,2 cm3 de HCl 0,1n. Se determină din nou pH-ul soluţiei astfel obţinute.
Calculul
Se calculează diferenţa dintre cele două valori ale pH-ului şi se face apoi raportul dintre
numărul de cm3 de HCl 0,1n adăugaţi şi această diferenţă.
Exemplu de calcul: considerăm că pH-ul iniţial al urinii alcaline este egal cu 8, iar după
adăugare de HCl 0,1n pH-ul este egal cu 7,8. Diferenţa dintre cele două determinări este de 0,2.
Puterea de tamponare va fi de 0,2/0,2 =1.

Sistemele tampon din organismele animale

Sistemele tampon din sânge sunt următoarele:
1) Acidul carbonic - carbonat acid de sodiu în raport 1/20.
-în plasmă H2CO3 : NaHCO3 (bicarbonat de sodiu)
2) Fosfat primar de sodiu - fosfat secundar de sodiu în raport 1/5
-NaH2PO4 : Na2HPO4
3)Proteine plasmatice - Proteinaţi de sodiu
4)Oxihemoglobină - Oxihemoglobinat de potasiu
-în eritrocite (HbO2)H : (HbO2)K
5) Hemoglobină - Hemoglobinat de potasiu
-în eritrocite (Hb)H : (Hb)K

39
 Aproximativ 50% din capacitatea totală de tamponare a sângelui revine sistemului acid
carbonic - bicarbonat, care se formează în cea mai mare parte din CO2 rezultat din metabolism.
Acidul carbonic rezultă din CO2 sub influenţa enzimei anhidraza carbonică conform reacţiei:
CO2 + H2O ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3-
Logaritmul negativ al primei constante de ionizare a acidului carbonic este pKa = 6,1 şi
conform ecuaţiei lui Henderson - Hasselbach, pH-ul sângelui va fi dat de relaţia:
HCO3-
pH = pK + lg  = 6,1 + log 20 = 7,4
H2CO3
Sistemele tampon asigură, deci, reglarea echilibrului acido-bazic al mediilor biologice.
În urină reglarea echilibrului acido-bazic este determinată în special de proporţia dintre
fosfatul primar NaH2PO4 şi fosfatul secundar Na2HPO4 al cărui raport este de 9/1, mult inversat
faţă de cel al sângelui care este de 1/5.
În celule, sistemul tampon al fosfaţilor are un rol predominant în menţinerea pH-ului.
Aminoacizii şi proteinele prin caracterul lor amfoter contribuie, de asemenea, în măsură însemnată
la acţiunea de tamponare.
Reactivi.
 Soluţie de acid citric 0,1M ( 21,014g C6H8O7 x H2O se dizolvă în apă deionizată fiartă şi se
completează la 1 dm3).
 Soluţie de acid boric 0,1M ( 6,184 g H3BO3 se dizolvă în apă deionizată fiartă şi se
completează la 1 dm3).
 Indicatorul universal. Se dizolvă în 100 cm3 amestec format din 60 cm3 alcool etilic şi 40 cm3
apă deionizată, următoarele cantităţi de indicator 0,02 g roşu de metil, 0,04g albastru de
bromtimol, 0,04 g albastru de timol şi 0,02 g fenolftaleină.

40
41