Métodos de purificación de

enzimas
Enzimas de productos marinos
Dr. José Luis Cárdenas López
 Purificación de Proteínas
• Es un arte (las proteínas tienen
personalidad irritable)
• Requiere conocimiento de la proteína
– De qué célula proviene
– Qué parte de la célula
– Qué hace
• Muy importante
– Tamaño
– Composición
 Estrategia
• Mover de un organismo a proteína pura en
los menos pasos posibles con la mínima
pérdida de actividad (medible en un
ensayo)
– Tiempo y temperatura son factores
Protocolos para Purificación de
Proteinas
• Altamente específicos para cada caso
• Usar un enfoque común
– Fraccionar el extracto crudo de tal manera
que la proteína de interés se vaya al
precipitado o al sobrenadante
– Seguir el progreso con un ensayo funcional
 Lactato Deshidrogenasa
• NADH + H+ + Piruvato
=NAD+ + Lactato
• La fuente obvia para la enzima es el tejido
muscular (corazón o esquelético, son isómeros)
• Se ensayaría la habilidad de convertir piruvato a
lactato
 Comenzar con tejido intacto
• Romper el tejido
– Licuadora, homogenizador
• Remover contaminantes
– Centrifugación
• Precipitar/concentrar
– Sulfato de Amonio
• Remover sales
– diálisis
• Purificar
– Cromatografía
• Analizar
– Actividad, peso molecular, cantidad de proteína
 Pp Sulfato de Amonio

• Amplio rango de aplicaciones

• Se basa en que las proteínas pierden
solubilidad al incrementarse la concentración de
sal
– Es característico para cada proteína particular
– Resulta en una purificación partial de las proteínas
con características similares de solubilidad
– Se debe determinar empíricamente la [sulf amonio]
que precipita la proteína de interés
• Produce “cortes de sal”
 Salting in / Salting out
• Salting IN • Salting OUT
• A bajas concentraciones, • A altas concentraciones
la sal añadida, la sal añadida baja la
normalmente incrementa solubilidad de las
la solubilidad de macromoléculas poreque
macromoléculas compite por el solvente
cargadas porque la sal (H2O) necesario para
incrementa las solvatar las
interacciones carga- macromoléculas
carga • Por lo que las altas [sal]
• Por lo que las bajas [sal] remueven la esfera de
previenen agregación y solvatación de las
por lo tanto la proteínas y “salen” de
precipitación y “salida” solución
 Cosmótropo vs. Caótropo

• Sulfato de Amonio • Urea

• Incrementar conc • Incrementar conc
causa a las proteinas desnaturaliza las
precipitar de manera proteinas; cuando
estable finalmente precipitan,
• Ion cosmotrópico = es de manera
ion estabilizante aleatoria y agregadas
• Ion Caotrópico = ion
desnaturalizante
 Diálisis
• Paso de solutos a través de una membrana
semi-permeable
• Los poros en la membrana de diálisis son de
cierto tamaño (controlable)
• La proteina se queda; el agua, las sales, los
fragmentos de proteína y otras moléculas que
sean menores que el poro salen
Cromatografía de Columna
Disponibles en cualquier
volumen
Filtración en Gel
 Principios de la filtración en gel (malla molecular)
1. Aplicar una 2. Colectar fracciones, 5. Estimar peso molecular aproximado
mezcla de tipicamente 120 en de las proteínas desconocidas o de
proteínas a la una columna de los complejos proteicos con estándares
columna de 1.5x100 cm de calibración de peso molecular
filtración en No cambiar conocido y la formula:
gel composición del buffer
(Sepharose,
Sephacryl, 3. Macromoléculas mas
etc) grandes eluyen primero
(mayor radio de Stoke)
Ve -Vo Ve – volumen de elución
106 Da Kav = Vt - Vo Vo – volumen vacío
Vt – volumen total
3x105 Da
105 Da 4. Determinar proteina en
104 Da la fracción eluída con
un ensayo adecuado

Kav

Log Peso Mol.

Intercambio Iónico
Chromatografía de afinidad

Usar Adenosina
-5’-monofosfato
Esto es parte del NAD+. La
LDH se unirá. Liberar la
LDH añadiendo NADH
NAD+

AMP
 Afinidad
• Recordar: NADH es un co-sustrato para lactato
dehidrogenasa.
• Usar AMP-Sepharose: AMP está unido
covalentemente al gel de afinidad, no pasará a
través del filtro
• LDH se unirá al AMP porque parece la mitad del
NADH.
• Por lo que la LDH se queda inmovilizada en la
columna hasta que se le añada NADH que se
une más fuertemente que la LDH.
 gráfica
Actividad

A280

NADH
 Concentración de Proteína
• Lowry
• A280
• Bradford
• BCA
• Starcher

Muy importante: proteína en solución, no absoluta

 Lowry
• Paper más citado en biología
• Ensayo colorimétrico
• Proteínas se acomplejan con Cu2+ en solución
alcalina (rx de Biuret) y son inestables en el
reactivo Folin Ciocalteu
• Muchos interferentes (detergentes, HEPES,
BME, agentes reductores)
• Más tardado que otros, pero es ensayo barato
 A280
• Usa absorbancia intrínseca
• Detecta residuos aromáticos
– Enlaces de resonancia
• Depende de la estructura de la proteina,
estado nativo y composición de AA
• Regla muy general: 1 mg/mL de BSA= valor de
DO 1
 Bradford
– Cuando la proteína se une a azul de commassie G
250 la Amax del colorante cambia de 465nm a 595nm
– Muy rápido (2 min), poca variación entre proteínas,
tiene algunos interferentes como detergentes (triton
X, SDS)
– Hay micrométodos (hasta .01 µg )
 BCA (Ácido bicinchonínico)
– Modificación de Lowry: ensayo breve (10 min),mayor
sensibilidad (0.5 µg) y consistencia, resiste presencia
de detergentes
– Proteínas se acomplejan con Cu2+ en solución
alcalina, los iones del complejo se reducen a Cu+,
que forman el color violeta con el BCA
 Starcher
• Es mas reciente (2001)
• Proteína soluble e insoluble
• Muy sensible, aunque muchos pasos
• Poco afectada por diferencias entre
proteína (gelatina…..)
• 2 pasos (rx ya muy antiguas y conocidas):
– hidrólisis (24 horas en HCl)
– Rx con ninhidrina
 Típico diagrama de flujo
Ground sirloin
(or alternative LDH source)

Place in blender, add buffer,

homogenize Llevar contabilidad de todo
Initial meat suspension
(volumenes, gramos, etc)
Centrifuge
para cálculos de rendimientos, etc.

Discard
precipitate
(save 1 ml)
Cleared meat Step 1
extract

Ammonium sulfate
precipitation, Centrifuge

Supernate
Precipitate

(save 1 ml)
Resuspend in
Step 2a buffer
(save 1 ml)
Step 2b
Discard
remainder Add PMSF,
Dialyze

Remove dialysate,
Store at -20oC
 Ejemplo de cromatograma

contaminant protein

LDH

A280 V0

NADH
added

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
fraction (tube) number
(approximate only)
Cómo saber qué tan pura es la
proteína
Tabla de Purificación (1ra parte)
Volumen total V0 unidades por V0 unidades Unidades Concentración Proteína neta Actividad
(ml) ml Totales remanentes o de Proteina (mg) específica
Rendimiento (mg/ml) (V0/mg
proteina)
(% del total)

Step A B C D E F G

1. EC 100 mL 20 U 16 mg/mL 100 x 16 =

1600 mg

2. 10 mL 180 U 8 mg/mL 10 x 8 = 80
(NH4)2SO4 mg

3. diálisis/ 12 mL 140 U 7 mg/ mL 12x7= 84

solución mg
inyectada a
la columna

4. tubos 3 mL 200 U 1.3 mg/mL 1.3 x 3=

colectados 3.9 mg
de la
columna
afinidad

Columna C = (Columna A)(Columna B)

Columna F = (Columna A)(Columna E)
Columna G = Columna C/Columna F = Columna B / Columna E
Columna D = Columna C/primer valor en Columna C
Cómo saber qué tan pura es la
proteína
Tabla de Purificación (1ra parte)
Volumen total V0 unidades por V0 unidades Unidades Concentración Proteína neta Actividad
(ml) ml Totales remanentes o de Proteina (mg) específica
Rendimiento (mg/ml) (V0/mg
proteina)
(% del total)

Step A B C D E F G

1. EC 100 mL 20 U 100 x 20= 2000 100 % 16 mg/mL 100 x 16 = 2000 U/

U (2000/2000) 1600 mg 1600 =
x100 1.25 U/mg

2. 10 mL 180 U 10 x 180 = (1800/2000)x 8 mg/mL 10 x 8 = 80 1800/80=

(NH4)2SO4 1800 U 100 = 90 % mg 22.5 U/mg

3. diálisis/ 12 mL 140 U 12 x 140= 1680 7 mg/ mL 12x7= 84 1680/84=

solución U (1680/2000)x mg 20 U/mg
inyectada a 100= 84%
la columna

4. tubos 3 mL 200 U 3 x 200= 600 U (200/2000) x 1.3 mg/mL 1.3 x 3= 600/3.9 =

colectados 100 =10% 3.9 mg 154 U/mL
de la
columna
afinidad

Columna C = (Columna A)(Columna B)

Columna F = (Columna A)(Columna E)
Columna G = Columna C/Columna F = Columna B / Columna E
Columna D = Columna C/primer valor en Columna C
Tabla de Purificación (2da parte)
Total de Rendimiento Actividad Purificación
actividad (%) especifica (X)
(unidades) (V0/mg proteina)

Paso A B C D

1. EC 100 x 20= 2000 2000 U/ 1600 =

U 1.25 U/mg
2. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800 1800/80= 22.5
U U/mg

3. diálisis/ 12 x 140= 1680 1680/84= 20 U/mg

solución U
inyectada a la
columna
4. tubos 3 x 200= 600 U 600/3.9 = 154
colectados de la U/mL
columna afinidad
Tabla de Purificación (2da parte)
Total de Rendimiento Actividad Purificación
actividad (%) especifica (X)
(unidades) (V0/mg proteina)

Paso A B C D

1. EC 100 x 20= 2000 100 % 2000 U/ 1600 =

U
(2000/2000)
1.25 U/mg 1
x100
2. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800 (1800/2000)x 1800/80= 22.5
U
100 = 90 % U/mg 18
3. diálisis/ 12 x 140= 1680 1680/84= 20 U/mg
solución
inyectada a la
U
(1680/2000)x 16
columna 100= 84%
4. tubos 3 x 200= 600 U (200/2000) x 600/3.9 = 154
colectados de la
columna afinidad
100 =10% U/mL 123
• En el directorio compartido de la
computadora JOSELUISC pueden
encontrar los manuales de GE (antes
Pharmacia) de purificación de proteínas
¿Cómo verifico que efectivamente
mi proteína está pura?
Separación de proteína usando SDS-PAGE
(Laemmli systema)
1. Aplicar muestra de proteina/colorante 2. Correr la electroforesis hasta que el
a los pozos del gel colorante llegue al final del gel

Stacking
gel

Resolving
gel

3. Remover el gel del

aparato y teñir las
proteinas
 SDS PAGE del proceso de
purificación

1. Extracto crudo
2. Precipitado con SA
3. Intercambio Iónico
4. Filtración en gel
5. Afinidad

10 microgramos en cada carril

Por enfoque isoeléctrico

La proteína tiene una carga neta,

al colocarla en un gradiente de pH,
la proteína viaja hasta donde se descarga (pI)
Luego se tiñe y da un patrón característico
 Ejemplo

SDS PAGE (electroforesis)

¿Suficiente?

IEF (enfoque isoeléctrico)

3 10
electroforesis de dos dimensiones
Peso molecular

Enfoque isoelectrico
Peso molecular

Enfoque isoelectrico
 ÉXITO
Peso molecular

EXIEXITO

Enfoque isoelectrico
 Ese es el enfoque
tradicional…proteína por
proteína…
Estudiar una a la
vez…funciona…aunque
tardado…tesis doctoral…
 Que tal si las estudiamos
desde el punto de vista de la
PROTEÓMICA (o la
metabolómica…)

ES decir, en conjunto…
• Tomar esa proteína del gel
• Hidrolizarla (tripsina, una opción)
• Secuenciar los péptidos (Sanger)
• Buscar en las bases de datos péptidos
similares que coincidan
• % similitudes
• Identificar
• Ver diferencias (secuencia, pesos
moleculares, etc)
Herramientas de bioinformática
• http://www.expasy.org/tools/

• http://prowl.rockefeller.edu/
Secuencia: AFSTTGAMEG QQFRKTGKLV
SLSEQNLVDC SRPEGNEGCN GGLMDQAFQY
IQDNAGLDTE ESYPYVGTDE DPCHYKPEFS
AANETGFVDI PSGKEHAMMK AVAAVGPVSV
AIDAGHESFQ FYESGIYYEK ECSSEELDHG
VLVVGYGFEG EDVDGKKYWI VKNSWSEKWG
DKGYIYMAKD RKNHCGIATA SSYPLV
• Probar peptide cutter
• Probar peptide mass
• Otros
• Gran cantidad de información en muy
poco tiempo
Ventajas? Desventajas?