Taller “El papel de laboratorio en la prevención y control del cólera”

INCIENSA, 8 de noviembre de 2013

Vibrio cholerae: factores de virulencia y

subtipificación molecular

Dr. Francisco Duarte Martínez

Centro Nacional de Referencia de Bacteriología, INCIENSA
Centro de Excelencia Regional WHO-Global Foodborne Infections Network para
Centroamérica, México y Caribe de Habla Hispana
Generalidades acerca del V.cholerae O1:
marcadores genéticos importantes
Ruby et al., 2004
Regiones por resaltar – El Tor
 Factores de virulencia
Toxina Colérica: Toxina tipo AB
Une al GM1 del epitelio intestinal
Una vez internalizada SubA de CT se escinde proteolíticamente
CT-A1 ADP ribosila Prot Gs
producción constitutiva de AMPc
Perdida masiva de electrolitos hacia el lumen intestinal
Maston et al., 2007
CT está codificada en el operón ctxAB, el cual reside en el genoma del fago ctxφ

ctxφ se encuentra en todos los aislamientos epidémicos pero raramente en

aislamientos no–O1, no-O139

ctxφ puede integrarse al cromosoma para formar un profago estable o puede

replicarse como plásmido en ausencia de secuencias de integración específicas

En cepas de V. cholerae O1 biotipo Clásico existe un profago en ambos cromosomas

En cepas de V. cholerae O1 biotipo EL Tor ctxφ se encuentra como una sola copia o
en múltiples copias en “tandem” en el CI

Fidelma et al., 2000; Safa et al. 2009

Mecanismo de acción de la toxina colérica

http://techno.msu.ac.th/fn/ecenter/pathogens/images/anim-cholera.gif
 Factores de virulencia
EI TCP (Toxin Coregulated Pilus) es un pili tipo IV, requerido para
colonización intestinal
Produce la agregación de células de V. cholerae
Induce la formación de microcolonias en el intestino
Receptor para el fago ctxφ

La pilina del TCP está codificada en el gen tcpA, el cual presenta

hipervariabilidad. Lo que le permite a la bacteria escapar del
reconocimiento por el sistema inmune del hospedador

Posee además otros factores de virulencia como hemolisinas,

citotoxinas (RTX), toxina termoestable (ST)

Maston et al., 2007

Modelo acerca de
la aparición de una
cepa patógena

Dale et al., 2004

Aparición de cepas toxigénicas de V. cholerae

Faruque et al., 1998

VPI: Isla de patogenicidad de Vibrio

Karaolis et al., 1998

VPI: Isla de patogenicidad de Vibrio

tcpA: pilina
acf A-D: factores de colonización
vpiT e int: recombinasa

VPI puede circularizarse y podría transferirse

horizontalmente entre cepas V. cholerae O1.
Rajanna et al., 2003

VPI y otros fragmentos cromosomales pueden

transferirse entre cepas de V. cholerae O1
utilizando el fago CP-T1
O’Shea et al. 2002
Serogrupos O1 y O139

Bik et al, 1995

 Serogrupos O1 y O139

El serogrupo O139 resulta de una deleción de 22-kb en la región wbe (rfb) de O1, la cual es
reemplazada por una región de 35-kb wbf (wbfA -wbfX) la cual codifica para el antígeno O139

Faruque et al, 2003

Fenotipos y genotipos de V.cholerae 01

Safa et al., 2009

Estructura del locus del CTXφ

Safa et al., 2009

CTXφ y RS1 en las cepas de Haití

Hasan et al., 2011

V.cholerae O1: características genotípicas de los
biotipos y de sus variantes

Son et al., 2011

Diversidad genética de las cepas de
V.cholerae O1 en Haití
Hasan et al., 2012
Hasan et al., 2012
Hasan et al., 2012
Transmisión global de V.cholerae O1
en la 7ª pandemia
Mutreja et al., 2011
Mutreja et al., 2011
Marcadores genéticos a monitorear
 Caracterización de Vibrio cholerae

Identificación de genero y especie:

Detección específica para Vibrio cholerae de una región del operón rRNA. Corresponde a
regiones espaciadoras intergénicas (IRSs) localizadas entre 16S y 23S del rDNA (Chun et al, 1999).

INEI-ANLIS., 2007
 Determinación de factores de virulencia:

Se amplifica un fragmento del gen ctxA que codifica para la subunidad A de la toxina.

INEI-ANLIS., 2007

Ruby et al., 2004

 Determinación de factores de virulencia:
Genes codificantes para Toxina termoestable ST y toxina formadora de poros RTX.

Gen tcpA que codifica para la pilina del TCP específica del Biotipo El Tor.
Sin embargo esta proteína es polimórfica.

El gen regulador tcpI está sometido a menor presión de selección que el gen estructural
tcpA, por lo que tiene una variabilidad mucho menor. La detección de este gen es de especial
utilidad como indicador de la presencia de TCP en cepas que tienen variantes del gen tcpA
diferentes al alelo “EL Tor”.

INEI-ANLIS., 2007
 ctxA, tcpA, RS16S-23S

564 bp
451 bp
300 bp

Fuente: Centro Nacional de Referencia de Bacteriología, INCIENSA

Subtipificación molecular de V.cholerae
 Subtipificación por PFGE

Agarosa
Cultivo
microbiano
Lisis Bloques de agarosa

Lavados
Restricción

Electroforesis
de campo pulsado
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-SfiI PFGE-SfiI
100
90

95

VETA361 Upala Water Environment 1996-07-19 O1 El Tor Ogawa ctx +

VETA385 Los Chiles Cheese Food 1996-07-25 O1 El Tor Ogawa ctx +
SOS18 Alajuela Stool Human Ecuador 1992-01-05 O1 El Tor Ogawa ctx +

CNRB-INCIENSA, 2011.

PulseNet CDC - INDRE, sept 2013

Gonzalez et al, 2009

Muchas gracias