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1. OBJETIVO
Conocer el número de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus (microorganismos
característicos del yogurt) presentes en una muestra de yogurt.
3. FUNDAMENTO
El método consiste en sembrar un volumen dado de una muestra representativa y homogénea del
alimento a analizar y/o diluciones de la misma en placas Petri, utilizando medios de cultivo
selectivo y en condiciones de tiempo, temperatura y exigencias de oxígeno apropiados para
cada microorganismo:
a) Medio MRS acidificado, seguido de una incubación anaeróbica a 37ºC ± 1º C por 72
horas para el conteo de Lactobacillus delbrueeckii subsp bulgaricus.
b) Medio M17 completo seguido por un incubación a 37º C ± 1ºC por 48 horas para el
conteo de Streptococcus thermophilus.
Después del período de incubación, se cuentan las colonias características y se confirma
mediante pruebas apropiadas y examen microscópico. El número de microorganismos
característicos por gramo de muestra es calculado a partir del número de colonias obtenidas en
placas cuyos niveles de dilución muestren un resultado significativo.
El Reglamento Sanitario vigente en el artículo 220 estipula que los microorganismos lácticos
presentes en el producto final deberán ser viables y en cantidad superior a 106 ufc/g.
4. REFERENCIAS
4.1 “Standard Methods for the Examination of Dairy Products”, APHA 17 Edición, capítulo
9.080.
4.2 ISO/DIS 7889 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-Colony count
technique a 37 ºC . International Organization for Standardization. 1985.
4.3 Norma cubana: NC ISO7889:2009 “Yogurt _ Enumeración de los microorganismos
característicos- técnica del conteo de colonias a 37ºC” (ISO 7889:2003, IDT)
Fecha emisión:
PROCEDIMIENTO Marzo 1999
RECUENTO DE LACTOBACILLUS
BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS Revisión: 2
THERMOPHILUS EN YOGURT.
APHA 17 Edición, modificado Fecha revisión:
02-07-2010
Sección Microbiología PRT-712.02-047 Página 2 de 8
de Alimentos
5. TERMINOLOGÍA
5.1 Atmósfera anaeróbica: al emplear el sobre de Anaerogen se reduce el nivel de oxígeno de
la jarra por debajo de 1% en 30 minutos. El nivel resultante de dióxido de carbono oscilará
entre 9 y 13 %.
5.2 AnaeroGen: Sistema generador de atmósfera anaeróbica que contiene como componente
activo ácido ascórbico. La reacción del ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica y
alcanza una temperatura de 65 º C.
5.3 Indicador anaeróbico: Es una tira de algodón impregnada en una solución indicadora redox
y que permite controlar visualmente que las condiciones anaeróbicas han sido alcanzadas y
mantenidas. La condición anaeróbica se visualiza por el cambio de color del rojo al blanco.
5.4 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: Microorganismo termófilo, que forma
colonias lenticulares y frecuentemente aguzadas de diámetro desde 1 mm a 3 mm en el
medio MRS acidificado. Al microscopio estos microorganismos aparecen como bacilos,
generalmente cortos, en ocasiones alargados. No forman esporas, son Gram positivos, no
móviles y catalasa negativos.
5.5 Streptococcus thermophilus: Microorganismos termófilos que forman colonias lenticulares
de diámetro desde 1 mm a 2 mm en medio M-17, bajo las condiciones especificadas en
este procedimiento. Al microscopio, estos microorganismos aparecen como células ovoides
o esféricas (de diámetro 0,7 µm a 0,9 µm), en pares o en cadenas largas. Son Gram
positivos y catalasa negativos.
6.2 MATERIALES
6.2.1 Placas de Petri de 100 mm de diámetro.
6.2.2 Pipetas graduadas de 1 ml y 10 ml estériles.
6.2.3 Frascos Schott de 250 mL con tapa rosca para envasar los medios de cultivo.
6.2.4 Láminas portaobjetos.
6.2.5 Sobre generador de atmósfera anaeróbica (AnaeroGen):
para jarra 3,5 L utilizar Oxoid AN35 (envase c/ 10 bolsitas)
para jarra 2,5 L utilizar Oxoid AN25 (envase c/ 10 bolsitas)
6.2.6 Indicador de anaerobiosis (Oxoid BR55)
6.2.7 Espátulas estériles
7. DESARROLLO
Para requerimientos generales, ver ISO 8261/ IDF 122.
7.5 Controles
7.5.1 Realizar control de ambiente con placas con agar Plate Count.
7.5.2 Realizar control de esterilidad al agar MRS, al agar M 17 con B-glicerofosfato de
sodio y al agua peptonada 0,1 %.
7.8 Confirmación
7.8.1 Seleccionar las colonias de las placas usadas para el conteo tal que el número tomado
de las mismas sea igual a la raíz cuadrada del conteo total de colonias.
7.8.2 Confirmar por coloración de Gram (IT-712.00-066) si es necesario las características
morfológicas de los microorganismos investigados.
7.8.3 Las colonias provenientes del agar MRS son bacilos Gram positivos, no formadores
de esporas, generalmente largos y delgados, en cadenas o filamentos algunos
presentan granulaciones internas y catalasa negativos.
7.8.4 Las colonias provenientes del agar M17 son cocos Gram positivos en cadenas o en
pares, catalasa negativos.
7.8.5 La identificación de cepas dudosas puede ser realizada acorde a la ISO 9232/IDF 146
7.8.6 Anotar los resultados en el registro RG-712.00-042.
N= ΣC
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
donde:
N = número de colonias por ml o g de producto
Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento
7.9.2 Cuando no se pueda aplicar la fórmula y se obtenga promedio, el número de unidades
formadoras de colonias, obtenido en las placas correspondientes a la dilución
seleccionada, se multiplica por el factor de dilución correspondiente, se promedian los
resultados y el valor final se expresa en ufc por gramo o por ml según corresponda.
Fecha emisión:
PROCEDIMIENTO Marzo 1999
RECUENTO DE LACTOBACILLUS
BULGARICUS Y STREPTOCOCCUS Revisión: 2
THERMOPHILUS EN YOGURT.
APHA 17 Edición, modificado Fecha revisión:
02-07-2010
Sección Microbiología PRT-712.02-047 Página 8 de 8
de Alimentos
8. REGISTROS
8.1 Registro de resultados análisis recuento de lactobacillus bulgaricus y Streptococcus
thermophilus en muestras de yogurt.
9. ANEXOS
No Aplica