Preparación y propagación de

Inóculos
 Temario

 Inocular
 Inóculo
 Preparación y propagación de inóculos
 Preservación del inóculo.
 Multiplicación del inóculo.
 Cultivos de pre fermentación
 Fermentación de producción
 Producción de bioetanol
 Definiciones de la RAE

 Inocular: Introducir en un organismo una sustancia

que contiene los gérmenes de una enfermedad.
 Inóculo: Pequeña cantidad de la sustancia que se
inocula.
 Propagación: Acción y efecto de propagar.
 Propagar: Multiplicar por generación u otra vía de
reproducción. Extender, dilatar o aumentar algo.
Hacer que algo se extienda o llegue a sitios distintos
de aquel en que se produce. Extender el conocimiento
de algo o la afición a ello.
 Definiciones microbiológicas

 Inóculo es una suspensión de microorganismos que

se transfieren a un ser vivo o a un medio de cultivo a
través de la inoculación

 Un inóculo microbiano es una preparación sólida o

líquida, que contiene gran número de
microorganismos
 INÓCULO

 Un inóculo microbiano es una preparación sólida o líquida la

cual contiene una gran cantidad de microorganismos, como
bacterias u hongos. Estos microorganismos se encuentran
activados, es decir son viables y están listos para ser, como su
nombre lo dice, inoculados en un medio de cultivo o en un
biorreactor.
 Los inóculos pueden ser de un solo microorganismo específico
para un tipo de sustrato o ambiente, o puede ser una mezcla
de microorganismos que trabajan en conjunto, en aguas
residuales o en lodos.
 Otra definición: Cantidad de organismos o células, capaz de
garantizar las condiciones económicas y de fermentación en
un volumen dado de mosto
Inóculo en la industria
 Ejemplos de inóculos

 Siembra para el control de calidad de agua,

alimentos y bebidas
 Siembra de muestras patológicas
 Fermentación de bebidas alcohólicas
 Producción de antibióticos
 Fabricación de vacunas
Productos que pueden obtenerse
 Importancia del desarrollo de inóculos

 Para la elaboración de procesos

fermentativos
 En la industria de los alimentos, panadería,
lácteos y otros.
 Para la optimización de los resultados en los
procesos biotecnológicos
 En la comercialización como cultivos
liofilizados
 Criterios para la obtención de un buen inóculo

 Condiciones ambientales
 El medio ambiente en el que crece el
microorganismo va a determinar su adecuado
desarrollo.
 El pH, la temperatura y la presencia de
oxígeno, son los parámetros ambientales más
importantes, cuando se pretende utilizar un
microorganismo industrialmente
 Características del inóculo

 La cepa o cultivo a utilizar, debe ser genéticamente

estable.
 La cepa o cultivo, debe estar libre de
contaminantes.
 El microorganismo a usar debe ser de fácil
conservación, sin pérdida de sus características.
 El inóculo puede ser un consorcio de diversas
especies microbianas como las que se encuentran
en lodos aerobios (aguas residuales).
 Características del inóculo

 El inóculo debe tener la capacidad de crecer e invadir

rápidamente el sustrato (velocidad de crecimiento alta)

 El inóculo implica obtener una suspensión de

microorganismos viables y aptos para reproducirse y
producir metabolitos a escala industrial.

 Si el objetivo es obtener un producto, éste debe ser

obtenido en escala industrial
 Factores a considerar

 Concentración de células alcanzado (inóculo)

 Concentración inicial celular (fermentación)
 Concentración inicial del sustrato requerido
 Volumen y número de fermentadores disponibles
 Fase de crecimiento apropiado
 Influencia de la cantidad de transferencias sobre el
crecimiento y producción del producto
 Tipos de inóculo a nivel de:
 Laboratorio
 Producción industrial
Fases de producción del inóculo
Inicio de la obtención de inóculos
Etapas para preparar el inóculo
 Preparación de inóculos

 Elegir el tipo de microorganismo a inocular

 Cultivarlo en medios adecuados
 Medir la cantidad de sustancia a inocular conteniendo
el número de microorganismos necesarios
 Verificar la viabilidad del cultivo, microorganismos.
 Modificación y/o mejoramiento de los métodos para el
logro de mayor rendimiento con menor cantidad de
microorganismos, a escala industrial.
 Investigación de nuevos métodos
 Desarrollo del inóculo

 El cultivo preservado se reactiva en medio líquido o

medio sólido.
 Según el método de preservación se requerirá el
tiempo para la recuperación del cultivo.
 Sucesivamente se irá incrementando el volumen del
recipiente de cultivo, para conseguir la velocidad de
crecimiento adecuada, esto es vital para que a escala
industrial alcance resultados óptimos.
 Si crece en condiciones diferentes a como crecerá
después (industrialmente) habrá un período de
latencia en el fermentador, disminuyendo la
rentabilidad en la producción.
Etapas del desarrollo del inóculo
Etapas del desarrollo del inóculo
 Tiempos normales de incubación

 Cultivos Liofilizados: 4-10 días

 Cultivos Congelados:
 Bacterias: 4-48 horas
 Actinomicetos: 1-5 días
 Hongos: 1-7 días

 Cultivos Refrigerados:
 Bacterias: 4-24 horas
 Actinomicetos: 1-3 días
 Hongos: 1-57 días
 Etapa I: Preservación del inóculo

 Conservación de los microorganismos y sus

características a través de largos periodos de tiempo
sin división celular, reduciendo su actividad
metabólica.
 Factores que intervienen en la selección del método de
conservación:
 Susceptibilidad del microorganismo al proceso de conservación
 Facilidad de ocurrir cambios genéticos en la cepa
 Número de muestras por conservar
 Costo del proceso de conservación
 Periodo durante el cual se conservará al microorganismo
 Tipo de equipo disponible
 Probabilidad de contaminación que exista en el medio
Conservación del cultivo
 Etapa I: Preservación del inóculo

A. Resiembra o Subcultivo
 Consiste en sembrar el microorganismo en
determinado medio de cultivo y luego conservarlo en
refrigeración. El proceso se repite cada cierto tiempo.
 Etapa I: Preservación del inóculo

B. Desecación
 Remover el agua celular e impedir la rehidratación de las
células de los microorganismos.
 Se inocula en tierra húmeda estéril, se espera hasta que
haya crecimiento y luego se seca con aire o al vacío.
 Recomendado para organismos formadores de esporas
 Etapa I: Preservación del inóculo

C. Congelación
 Control de la velocidad de disminución de
temperatura

 Uso de crioprotectores
 Congelación Ordinaria (-5º C -20ºC)
 Congelación Ultrafría (-50ºC -80ºC)

 Congelación por Nitrógeno líquido (-150ºC -

196ºC)
Congelación
 Etapa I: Preservación del inóculo

C. Congelación
 Etapa I: Preservación del inóculo

D. Liofilización
 Remoción de agua de las células congeladas (sólidas)
a presión reducida (sublimación).
 Etapa II: Crecimiento del inóculo

 Implica el desarrollo de una población de

microorganismos, desde su estado de conservación
hasta obtener una suspensión de microorganismos
viables y aptos para reproducirse y producir
metabolitos a escala industrial.
 Incluye 3 etapas
 Recuperación de la cepa
 Crecimiento en un medio de cultivo sólido
 Crecimiento en un medio de cultivo líquido
 Etapa II: Crecimiento del inóculo

Recuperación de la cepa
 Depende del método de conservación usado
 Liofilizado: Adicionar agua destilada estéril para
rehidratación
 Congelado: Baño de agua a 37ºC
 Tubos de agar inclinado: Adicionar agua destilada
estéril y raspar la superficie con un asa de Kolle.
 Botellas de Roux: Agregar agua destilada y perlas de
vidrio estériles, y agitar para resuspender.
 Desecado: Agregar agua destilada estéril
 Etapa II: Crecimiento del inóculo

Crecimiento en Medio de Cultivo Sólido

 Se toma una asada y se estría en un medio de cultivo
sólido en tubos de agar inclinado
 Incubar a temperatura y tiempo adecuados.
 Etapa II: Crecimiento del inóculo

Crecimiento en Medio de Cultivo Líquido

 Tomar una asada del medio de cultivo sólido y se
introduce en matraces Erlenmeyer de 100 o 250 ml
de capacidad que contengan un medio de cultivo
líquido (10 – 20% de su capacidad)
Etapa III: Precultivo en fermentador pequeño

A fin de obtener suficiente inóculo para el

fermentador de producción, deben realizarse
precultivos en fermentadores más pequeños.
 En general se requieren las siguientes
concentraciones de inóculo:

Actinomicetos...........5 - 10 %
Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %
Hongos..................5 - 10 %
 Etapa III: Precultivo en fermentador

 Concentración de microorganismos
 Determinación de número de células por unidad de
área
 Determinación de masa celular
 Determinación de densidad celular
 Biorreactor

 Un biorreactor es un recipiente, en muchos casos de

forma cilíndrica y de acero inoxidable, que está
diseñado para mantener un ambiente
biológicamente activo. En muchas ocasiones es
utilizado para llevar a cabo reacciones químicas que
involucran microorganismos, organismos o
sustancias bioquímicamente activas que son capaces
de llevar a cabo dichas reacciones. Los biorreactores
tienen como objetivo generar una gran cantidad del
producto deseado reduciendo los costos y los
tiempos, así como utilizando lo menos de recursos
posibles. (Moreno, S. 1996)
Biorreactor
Cantidad de inóculo requerida para el proceso de
fermentación

 La cantidad de inóculo que se prepara y se agrega en

la mayoría de casos, es el 10% del volumen total del
trabajo

 Concentraciones de inóculo
 Actinomicetos...........5 - 10 %
 Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %
 Hongos......................5 - 10 %

 Tamaños del biorreactor

Fermentador m3 Producto
1 -20 Enzimas de diagnosis, biología molecular, organismos transgénicos
40 - 80 Algunas enzimas, Antibióticos
100 – 150 Penicilina, aminoglicósidos. Proteasas. Amilasas. Aminoácidos,
450 Ác. glutámico, Proteína de origen unicelular
 Etapa IV: Fermentación de producción

 Biorreactores.
 Recipiente o sistema que mantiene un ambiente
biológicamente activo
Producción de Penicilina