DIAGNOSTICUL ÎN SALMONELOZE

Material patologic: cadavre întregi de animale mici sau păsări, în cazul

formelor septicemice, un os lung nedeschis, organe cu leziuni (ficat, vezică biliară,
splină, ganglioni limfatici, în cazul păsărilor: ficat, cord, ovar, testicul), lichid
articular, avortoni, învelitori sau lichide fetale, probe de sânge recoltate la 8-10
zile după avort. În cazul diagnosticului în tifo-puloroză sau paratifoze, pot fi
utilizate ca probe patologice şi probe de aşternut contaminat cu fecale din hală sau
cuibare. În cazul toxiinfecţiilor alimentare, produsele folosite pentru însămânţări
sunt reprezentate de carne şi produse din carne, ouă, apă, etc.
Diagnosticul de laborator în cazul infecţiilor cu germeni din familia
Enterobacteriaceae include examene bacterioscopice şi bacteriologice, urmărindu-
se iniţial izolarea apoi identificarea bacteriilor izolate. Tipizarea se efectuează prin
mijloace serologice, cu ajutorul bacteriofagilor (lizotipia), prin testarea
sensibilităţii faţă de un set de bacteriocine cunoscute (bacteriocinotipia), prin teste
biochimice (biotipia) şi pe baza sensibilităţii faţă de anumite antibiotice
(antibiotipia).

EXAMEN MICROBIOLOGIC

Examen bacterioscopic
Amprentele efectuate din materialele patologice se colorează, după fixare,
prin metoda Gram. Salmonelele se prezintă sub formă bacilară sau cocobacilară,
colorată în roşu (G-), având dimensiuni de 2-5/0,7-1,5 microni. Nu este capsulată şi
nu formează spor. Marea majoritate a salmonelelor sunt mobile datorită prezenţei
unui număr variabil de cili, dispuşi peritrich. S. pullorum şi S. gallinarum sunt
imobile.

Examen bacteriologic
Salmonelele cresc bine pe medii de cultură uzuale. În bulion produc
turbiditate uniformă, moderată până la intensă, în general mai slabă decât în cazul
E. coli. Pe agar, formează colonii mijlocii, de 1,5-3 mm diametru, de tip S,
nepigmentate. Unele tulpini formează colonii pitice iar altele de tip R. Identificarea
cu certitudine nu se poate face prin însămânţările pe medii uzuale, de aceea se
recurge la utilizarea unor medii de îmbogăţire (Kauffmann-Müller, bulion selenit),
de pe care se fac transplantări după 10-12-18 ore pe medii selective (Wilson-Blair,
Leifson, Istrati-Meitert). Pe aceste medii se realizează o primă departajare a
bacteriilor lactozo pozitive de cele lactozo negative.
Mediul Istrati-Meitert. Conţine lactoză, bilă uscată de bou, citrat şi
hiposulfit de sodiu ca şi citrat de fier.
Are culoare verde închis şi este solid. Coloniile din genul Shigella,
Salmonella apar verzi-albăstrui, relativ transparente iar cele de E.coli sunt galbene,
opace. Mobilitatea pentru Proteus este inhibată iar coloniile au centrul de culoare
neagră.
Coloniile lactozo-negative vor fi transferate pe medii de diferenţiere
(Drigalski, Endo, Gassner, medii multitest: TSI, MILF, etc.).
Examenul caracterelor biochimice constă în evidenţierea echipamentului
enzimatic al bacteriilor, diferit de la o specie la alta. Astfel, unele medii pot
evidenţia fermentarea zaharurilor, altele utilizarea ca substrat a diferite substanţe,
producţia de indol sau hidrogen sulfurat, etc. Mediile politrope pun în evidenţă
activitatea enzimatică bacteriană indirect, prin identificarea metaboliţilor rezultaţi.
Mediul Simmons citrat. Mediul conţine citrat de amoniu sau sodiu
cristaliza. Mediul este solid, are culoare verde închis, se toarnă înclinat şi se
însămânţează prin haşurare cu ansa. Bacteriile care utilizează citratul drept sursă
de carbon vor duce la virarea culorii mediului în verde. Salmonelele sunt citrat
pozitive.

Mediul TSI (triple sugar iron). Mediul conţineglucoză, lactoză, sucroză şi sulfat feros. Mediul se
solidifică în poziţie înclinată, astfel încât să aibă o porţiune inferioară, verticală
şi una superioară, înclinată. Porţiunea verticală se însămânţează prin înţepare
iar cea înclinată prin haşurare. Mediul neînsămânţat are culoarea roşu închis.
Fermentarea glucozei: se consideră pozitivă dacă în porţiunea dreaptă
culoarea mediului virează în galben; dacă fermentarea s-a realizat cu producţie de
gaz, se observă în masa mediului bule de gaz sau chiar detaşarea mediului de la
fundul tubului. Reacţia este negativă în absenţa acestor modificări. Salmonelele
sunt glucoză pozitive.
Fermentarea lactozei: este pozitivă dacă culoarea suprafaţei înclinate a
mediului virează în galben şi negativă, dacă aceasta rămâne roşie. Salmonelele sunt
lactozo-negative.
 Producţia de hidrogen sulfurat: este pozitivă dacă mediul se înnegreşte la
limita de separare între cele două porţiuni. Producţia de hidrogen sulfurat mai
poate fi estimată cu ajutorul benzilor de hârtie îmbibate cu acetat de plumb.
Benzile se fixează imediat după însămânţare, cu ajutorul dopului de vată, astfel
încât să fie la un centimetru distanţă de porţiunea verticală. În prezenţa
hidrogenului sulfurat, acesta trece în sulfură de plumb, de culoare neagră.
Salmonelele sunt hidrogen sulfurat pozitive.
Mediul MILF (mobilitate, indol, lizindecarboxilază, fenilalanin-
dezaminază). Mediul conţine glucoză, L-lizină, DL-triptofan, DL-fenilalanină,
bromcrezolpurpur ca indicator de pH. Este un mediu solid, se toarnă sub formă de
coloană şi are culoare mov-cenuşie. Se însămânţează prin înţepare.
Mobilitatea: Se apreciază prin apariţia turbidităţii în toată masa mediului.
Bacteriile imobile cresc doar pe traiectul înţepăturii. Salmonelele, cu excepţia S.
pullorum-gallinarum sunt mobile.
Producţia de indol: Reacţia indolului se apreciază cu ajutorul benzii pentru
indol, impregnată cu para-dimetil-amino-benzaldehidă, de culoare galbenă. În
prezenţa indolului, banda se înroşeşte. Salmonelele sunt indol negative.
Producerea de fenilalanindezaminază: la suprafaţa mediului se adaugă
câteva picături de soluţie de clorură ferică 10%. Dacă testul este pozitiv, culoarea
galbenă a reactivului virează în verde. Salmonelele sunt fenialanin-dezaminază
negative.
Testul lizindecarboxilazei: în prezenţa lizindecarboxilazei, lizina din
compoziţia mediului trece în cadaverină, care duce la colorarea mediului în violet,
prin pierderea grupării carboxilice (alcalinizare). Dacă reacţia este negativă
(absenţa lizindecarboxilazei), culoarea mediului virează în galben, acidul carbonic
rezultat din metabolizarea glucozei din mediu produce o acidifiere care nu este
tamponată de cadaverină. Salmonelele sunt pozitive.
Mediul MIU (mobilitate, indol, urează). Permite aprecierea mobilităţii,
producţia de indol şi pe aceea de urează.

Schema de izolare şi identificare a germenilor Enterobacteriaceaelor

(după Bîlbîie şi Pozsgi, 1985, modificată)

Urină Materii fecale

Sânge Bilă
 Măduvă osoasă Probe necroptice
Punctate aseptice Alimente suspecte
Prelevat Colecţii închise Urocultură Lichide de
vomă
Tampoane plăgi cant.
Hc Medii de îmbogăţire
Kauffmann-Muller
Agar simplu 2% Selenit
Agar sânge
Medii selective
Izolare B.Gram - Geloză sânge
Leifson
Wilson-Blair
Istrati-Meitert

COLONII SUSPECTE

SUSPENSIE

SISTEME MULTITEST SISTEME MICROTEST

I B Medii multitest Enterotube

D I TSI API
E O MILF Minitek
N C MIU Enterotek
T H Simmons Discuri impregnate
I I
F M Încadrare gen/specie
I I
C C
A Ă Colonii suspecte direct Medii simple

R
SEROLOGICĂ Lamă

Tub

Bacteriofagică
TIPIZARE Bacteriocinică Încadrare de tip
Biochimică (biotip)
Conţine uree, glucoză şi roşu fenol ca indicator de pH. Mediul este galben maroniu
transparent, se toarnă sub formă de coloană şi se însămânţează prin înţepare.
Mobilitatea: ca şi pe mediul MILF.
Producţia de indol: se poate aprecia cu bandă de indol sau picurând la
suprafaţa mediului câteva picături de reactiv Ehrlich-Kovacs. Acest reactiv are
culoare maronie, care în prezenţa indolului virează în roşu-vişiniu.
Producţia de urează: în caz de reacţie pozitivă, datorită descompunerii ureei
cu eliberare de amoniac, culoarea mediului virează în roşu. Dacă bacteria nu
produce urează, culoarea mediului virează în galben. Salmonelele nu hidrolizează
ureea.

EXAMENE SEROLOGICE

Testele serologie se folosesc în diagnosticul salmonelozei fie pentru identificarea

salmonelelor izolate din materialele patologice (tipizarea serologică) fie în scopul depistării şi

cuantificării anticorpilor antisalmonelici la animalele bolnave sau trecute prin boală (RSAR,

RAL).

Tipizarea serologică. Structura antigenică a salmonelelor.

Antigenele somatice “O” constituie baza clasificării salmonelelor conform schemei

Kauffmann-Müller. Aceste antigene sunt termostabile, alcoolorezistente, reprezentate de

complexul lipopoliglucidic din membrana externă a peretelui celular. Aglutinarea acestor

antigene are aspect granular. Ele pot fi majore, de serogrup şi minore, comune mai multor grupe

serologice.

Antigenele de suprafaţă “Vi”sunt termolabile, dar insensibile la alcool şi formol, este

prezent doar la trei serotipuri S.typhi, S. paratyphi şi S. dublin. Fiind situat la exteriorul

antigenului somatic, îl maschează şi împiedică aglutinarea cu seruri anti “O”.

 Antigenele flagelare “H” sunt termolabile, de natură proteică, alcoolo-sensibile.

Aglutinarea H are aspect floconos şi nu este inhibată de formol. Marea majoritate a salmonelelor

pot produce alternativ două categorii de antigene “H” (variaţie de fază).

Materiale necesare: cultura bacteriană de identificat, seruri antisalmonelice polivalent,

de grup (B, C, D, E), anti Vi, de fază (anti H), lame de sticlă, ser fiziologic, ansă bacteriologică.

Tehnica de lucru: pe lama bine degresată se face o suspensie bogată (dar fără grunju)

din cultura bacteriană pe agar. Se adaugă o picătură de ser antisalmonelic polivalent, se amestecă

cele două picături şi se urmăreşte apariţia reacţiei de aglutinare în decurs de 1-3 minute. Dacă

bacteria respectivă este o salmonelă, vor apare treptat grunji de culoare albicioasă, cu limpezirea

consecutivă a amestecului. Pentru a evita erorile provocate de eventuala aglutinare spontană a

culturii în ser fiziologic, se efectuează în paralel o suspensie în ser fiziologic fără a adăuga ser

aglutinant. Dacă reacţia este negativă şi totuşi datele epidemiologice, clinice anatomo-patologice

indică o salmoneloză, se efectuează şi aglutinarea cu serul anti Vi.

Prin aceeaşi tehnică se determină apartenenţa la serogrup, folosind serurile anti B, C, D,

etc. iar apoi specia, cu utilizarea serurilor anti H.

Tehnica de aglutinare rapidă pe lamă pentru identificarea anticorpilor antisalmonelici.

Se efectuează îndeosebi în supravegherea şi diagnosticul salmonelozelor aviare, la găini în vârstă

de 16-24 săptămâni cu repetare la 36-44 şi 56-64 săptămâni. Poate fi realizată în două variante de

lucru: cu sânge integral sau cu ser sanguin.

Aglutinarea rapidă pe lamă folosind sânge integral. Este tehnica cu cea mai largă

aplicabilitate în practica veterinară de teren.

Materiale necesare:
 Testul se efectuează într-o încăpere închisă, fără curenţi de aer sau praf, în care

temperatura trebuie să fie de 18-20°C. Se folosesc: lame de sticlă bine degresate, anse

bacteriologice cu diametrul ochiului ansei de 3 mm, o susră de foc (bec de gaz, lampă de spirt)

pentru flambarea ansei, un pahar cu apă pentru spălarea ansei înainte de flambare, pipete Pasteur

sau o seringă cu ac fin pentru dozarea antigenului, vată şi alcool pentru dezinfecţie, foarfecă,

spatulă pentru cauterizarea crestei după recoltarea sângelui, antigen pullorum (suspensie de corpi

bacterieni, inactivată prin formol), cuşti pentru izolarea păsărilor seropozitive.

Tehnica de lucru: Pe o lamă de sticlă se pun trei picături de antigen la distanţă

aproximativ 2 cm una de alta. Se dezinfectează creasta păsării, apoi se secţionează vârful unui

caruncul, se lasă să se scurgă primele 2-3 picături de sânge şi cu ansa, se recoltează o picătură,

care va fi omogenizată cu una din picăturile de antigen de pe lamă. Creasta se cauterizează cu

spatula încălzită pentru a evita hemoragia şi canibalismul. Operaţiunea se repetă pentru fiecare

pasăre. Ansa se spală şi se flambează după fiecare utilizare. Se urmăreşte apariţia reacţiei de

aglutinare. Reacţia se consideră pozitivă atunci când apar grunji de culoare albicioasă (a nu se

confunda cu evntuali grunji de culoare roşie rezultaţi prin hemaglutinare)şi amestecul se

limpezeşte într-o oarecare măsură, după trei minute sau mai repede. Grunjii cresc prin confluare

la înclinări repetate ale lamei. Dacă primii grunji încep să apară la finele celor trei minute, reacţia

se repetă, dublând cantitatea de sânge.

Seroaglutinarea rapidă pe lamă. Tehnica de lucru este similară celei anterioare, cu

deosebirea că se foloseşte ser în loc de sânge integral. Interpretarea rezultatelor este mai facilă,

grunjii, chiar de dimensiuni mai mici fiind uşor de oservat. Inconvenientul constă în obţinerea
mai dificilă a reacţiei şi manopere separate pentru recoltarea sângelui, obţinerea serului şi

efectuarea reacţiei.

Toate probele pozitive la aglutinarea rapidă vor fi testate prin aglutinarea lentă în tuburi,

care permite şi stabilirea titrului de anticorpi.

Reacţia de aglutinare lentă în tuburi (RAL). Această metodă se aplică atât pentru

depistarea anticorpilor antisalmonelici la mamifere (în caz de avorturi) cât şi la păsări (tifo-

puloroză sau paratifoze).

Materiale necesare: tuburi de sticlă pentru RAL, stative, pipete gradate sau automate

pentru repartizarea reagenţilor, ser fiziologic fenolat 5%o, pentru diluarea antigenului (în

diagnosticul salmonelozelor aviare, diluţia antigenului pullorum se face 1/20-1/50 după titrul

înscris pe flacon), termostat.

Tehnica de lucru în salmonelozele aviare. Diluarea serului suspect se face direct în

antigen, conform schemei de mai jos:

Tubul Antigen (ml) Serul de cercetat (ml) Diluţia realizată

1 1,8 0,2 1/10
2 1 1 ml din dil. 1/10 1/20
3 1 1 ml din dil. 1/20 1/40
4 1 1 ml din dil. 1/40 1/80
5 1 1 ml din dil. 1/80 1/160
 (Exemplu de calcul al diluţiei pentru tubul 2: la 1 ml antigen se adaugă un ml de amestec

antigen 0,9 ml + ser 0,1 ml, presupunând că în primul tub, serul s-a omogenizat; se obţin astfel

0,1 ml ser la 2 ml amestec, deci diluţia 0,1/2 total amestec, adică 1/20).

Pentru fiecare serie de determinări se execută un martor pozitiv (folosind un ser sigur

pozitiv) şi un martor negativ (cu un ser sigur negativ). Seria de tuburi se incubează la termostat

timp de 18-24 ore după care se face citirea. Interpretarea se bazează pe mărimea şi

caracteristicile depozitului şi limpezimea supernatantului. Aglutinarea totală (depozit mare,

supernatant perfect limpede) se notează ++++ (aglutinare 100%), depozit mai mic, supernatant

foarte puţin tulbure cu +++ (aglutinare 75%), etc. Rezultatul pozitiv se notează pentru prezenţa

anticorpilor antisalmonela se notează cu cel puţin ++++ sau +++.

În salmonelozele abortigene titrul aglutinant care indică boala la cabaline este de 1/100

(după unii autori, cel puţin 1/600), 1/100 la ovine şi de 1/50 la taurine.

În salmonelozele aviare, se consideră pozitive pentru prezenţa anticorpilor antisalmonela

probele care dau aglutinare ++++ sau +++ la diluţia 1/40, restul se elimină. Probele care dau

rezultate pozitive pentru diluţile de 1/160-1/320 indică infecţii cu latente cu S. pullorum, infecţii

cronice cu S. gallinarum sau salmonele mobile de grup D. Titre de 1/40-1/80 se întâlnesc în

infecţii latente cu alte serotipuri de salmonele mobile sau aglutinări încrucişate. Lotul este

considerat indemn doar dacă examene bacteriologice din secreţiile urogenitale şi examenele

serologice dau rezultate negative. Pentru depistarea păsărilor purtătoare de salmonele se pot

utiliza şi vitelusul din ouă provenite de la aceste păsări.