Sunteți pe pagina 1din 21

08

Linii celulare
• Cresterea celulelor în cultura primară duce la epuizarea substratului de
creştere şi oprirea diviziunilor prin “inhibiţie de contact”
• Prin subcultivarea culturii primare, aceasta poate da naştere diferitor linii
celulare
• O linie celulara contine mai multe tipuri de descendente celulare, cu fenotip
asemanator sau diferit
• Prin selecţia unui singur tip de descendenţă celulară, prin clonare se obtine o
tulpină celulară
• Linie celulara continuă – o linie celulara transformată, imortalizată in vitro
• Linii celulare limitate (finite) – cu durată de viaţă limitată la un număr
finit de generaţii (20-80, in funcţie de tipul celulelor)
• Tulpină celulară continuă – un anumit tip (fenotip) celular, celule selectate
prin clonare şi caracterizate, necontaminate cu alte tipuri de celule
• Foarte multe linii celulare sunt linii contaminate
Nomenclatura
• Cod (nume) – ex. Normal Human Brain (NHB)

• Numarul liniei daca din aceeasi sursa au fost selectate mai multe linii – Ex.
NHB1, NHB2 etc

• Numarul clonei, daca exista mai multe (NHB1-1, NHB2-1 etc)

• Numarul pasajelor dupa ultima dezghetare NHB1-1/p3

• Laboratorul din care provine (Ex. WI – Wistar Institute, NCI – national


cancer institute etc)
Exemple de linii celulare
comerciale si principalele lor caracteristici
Linii celulare
contaminate
(amestec de celule)
09
CLONAREA SI SELECŢIA CLONELOR CELULARE
Aplicaţii

• Obţinerea unor culturi celulare omogene


• Propagarea in vitro al unui anumit fenotip sau genotip celular
• Eliminarea contaminării celulelor diferenţiate cu celule
nespecializate
• Utilizarea în testele de viabilitate la optimizarea condiţiilor de
cultură
• Utilizarea în testele de chimiosensibilitate şi radiosensibilitate
METODE DE CLONARE CELULARA

• În monostrat (în flacoane de cultură, Petri sau placi multicelulare)

• În suspensie, prin imobilizarea celulelor în geluri sau soluţii


vâscoase
Particularităţi de clonare

• Eficienţa de clonare este diferită la diferite tipuri de celule


• Eficienţa de clonare cea mai mare este caracteristică liniilor celulare transformate
• Eficienţa de clonare a liniilor cu durată de viaţă limitată este mai mică. Pentru
obţinerea unor clone din astfel de linii celulare este nevoie de timp şi multe generaţii
celulare. Riscuri – senescenţa celulară
• Eficienţa de clonare în culturile primare este foarte mica, de cele mai multe ori = 0
Clonarea celulelor în monostrat

• Clonarea prin diluţie - principala metodă de clonare celulară

• În recipiente de cultură cu suprafaţă mare (Petri, flacoane)


• În placi de microtitrare (placi multicelulare - multiwell)
Tehnica de clonare prin diluţie celulară şi suprafeţe
de cultură mari
Eficienţa de clonare în funcţie de densitatea celulară

Eficienta de Per ml Per cm2 Petri de 6 cm Petri de 9 cm


clonare
estimata

0,1 % 1x104 2x103 40,000 100,000


1,0 % 1x103 200 4000 10,000
10 % 100 20 400 1000
50 20 4 80 200
100 10 2 40 100
Tehnica de clonare prin diluţie celulară în
microplăci de titrare
Creşterea eficienţei de clonare

• Optimizarea condiţiilor de cultură


• Medii potrivite (bogate în substanţe organice şi energetice)
• Adăugarea de hormoni (insulină, dexametazonă)
• Adaugarea de metaboliţi intermediari (keto-acizi)
• Ajustarea concentraţiei de CO2
• Tratarea substratului de creştere (polilizină, fibronectină)
• Folosirea stratului de celule feeder (doică)
Clonarea pe strat feeder
Clonarea în suspensie

• Metodă aplicată pentru celulele hematopoietice şi fibroblaste


transformate

• Creşterea iî mediu agarizat (semisolid) permite menţinerea


celulelor coloniei împreună şi împiedică trans-contaminarea cu
celule din coloniile învecinate
Principiul clonării
celulare în suspensie
Izolarea clonelor celulare

• In placutile de microtitrare, izolarea coloniilor se face prin


simpla tripsinizare a camerelor individuale

• Separarea coloniilor de pe suprafete de cultura mai mari se


face de cele mai multe ori cu ajutorul inelelor de ceramica sau
inox

Inele de clonare
Izolarea clonelor cu ajutorul inelelor de
clonare
Izolarea clonelor în suspensie