Informe de Fermentacion

INFORME #2 DE MICROBIOLOGÍA
PREPARACIÓN PARA LA FERMENTACIÓN

ALCOHÓLICA A PARTIR DEL JUGO DE LA
NARANJA VALENCIA (Citrus sinensis)
Diana C. Forero
Michael S. García
Edwin A. Salinas
Yesicka F. Sanabria
INFORME DE MICROBIOLOGÍA
PREPARACIÓN PARA LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA A PARTIR DEL

JUGO DE LA NARANJA VALENCIA (CITRUS SINENSIS)
INTEGRANTES:
DIANA C. FORERO
MICHAEL S. GARCÍA
EDWIN A. SALINAS
YESICKA F. SANABRIA
GRUPO: 48TGQID
INSTRUCTORA:
MAGALY SÁNCHEZ BENAVIDEZ
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA

QUÍMICA APLICADA A LA INDUSTRIA
CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C.
2015
INFORME DE FERMENTACIÓN
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 4
1. OBJETIVOS ..................................................................................................... 5
Objetivo General ..................................................................................................... 5
Objetivos Específicos ............................................................................................. 5
2. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 6
2.1 Fermentación alcohólica ................................................................................... 6
2.2 Fermentación acética ....................................................................................... 6
2.3 Medios de Cultivo ............................................................................................. 7
2.4 Aislamiento de Microorganismos de Interés ...................................................... 8
2.5 Aislamiento por Estrías ..................................................................................... 8
2.6 Tinción de Gram o Coloración de Gram ............................................................ 9
2.7 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 10
3. PROCEDIMIENTOS ...................................................................................... 12
3.1 Preparación de Medios de Cultivo .............................................................. 12
3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés ................................................ 14
3.3 Aislamiento por Estrías ................................................................................... 16
3.4. Tinción de Gram o Coloración de Gram ......................................................... 17
3.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 20
3.5.1 Fermentación de azúcares........................................................................... 20
3.5.2 Tolerancia de Etanol .................................................................................... 22
3.6 Fermentación alcohólica ................................................................................. 23
............................................................................................................................. 23
4. RESULTADOS ................................................................................................. 24
4.1 Cálculos para Elaboración de Medios de Cultivo ........................................ 24
4.2 Cálculos para Aislamiento de Microorganismos de Interés ......................... 24
4.3 Caracterización de los medios de cultivo obtenidos ........................................ 25
2
4.4 Conteo de colonias ........................................................................................ 26

4.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas .............. 26
4.5.1 Cálculos de Fermentación de azúcares ...................................................... 26
4.5.2 Cálculos de Tolerancia al Etanol ................................................................. 27
4.5.3 Resultados de Fermentación de Azúcares ................................................... 29
4.5.4 Resultados de Tolerancia al Etanol.............................................................. 30
4.6 Tabla de registro para control de variables de fermentación alcohólica .......... 31
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS.......................................................................... 33
6. CONCLUSIONES .......................................................................................... 34
7. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 35
3
INTRODUCCIÓN
En este informe se abordará el proceso de fermentación para la obtención de

ácido acético a partir del mosto generado del jugo de naranja valencia (Citrus
sinensis), al cual se le modificaron ciertas variables para determinar el rendimiento
de ácido acético generado.
Con este fin se modificaron variables como grados Brix, temperatura, pH, pureza,
con el fin de favorecer la producción del ácido acético. Se cultivaron
microrganismos (levaduras y bacteria acéticas) en medios Agar-Agar GYC y YGC
para así determinar la UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de cada uno de
los cultivos obtenidos, posteriormente se identificaron los microrganismos de
algunas de las colonias a partir de tinción o coloración de Gram, a cada una de
las disoluciones trabajadas. Para esto último se examinaron las colonias por
medio de microscopio electrónico y se tomaron fotografías como evidencia del
trabajo realizado obteniendo así Gram positivas y Gram negativas.
Todo este trabajo con las colonias de microorganismos cultivadas se realiza con el
fin de aislar los microrganismos de utilidad para el proyecto de formación y bajo
qué condiciones se deben mantener para una mayor eficiencia y calidad en
nuestro producto final.
4
1. OBJETIVOS
Objetivo General
Preparar fermentación alcohólica y acética a partir del zumo de naranja valencia

(Citrus sinensis) para la obtención de vinagre.
Objetivos Específicos
 Elaborar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de

microorganismos de interés (levaduras y bacterias acéticas).
 Realizar aislamiento a partir de la caracterización macroscópica de los

microrganismos recuperados del fermento analizado.
 Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de

cultivo y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades
halladas en la caja de Petri.
 Efectuar coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram

negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
 Aislar los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento

por estrías.
5
2. MARCO TEÓRICO
La fermentación es un proceso catabólico (rompimiento de compuestos complejos

a compuesto sencillos) oxidativo (intercambio de electrones) de cuyo resultado
obtenemos un compuesto orgánico. El producto final varía según el sustrato.
En los seres vivos, la fermentación es un proceso anaeróbico donde no interviene

el proceso de respiración celular. Son propias de los microorganismos, como las
bacterias y las levaduras.
2.1 Fermentación alcohólica
Es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de oxigeno

(anaerobio), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan
los hidratos de carbono por lo general azúcares. Se obtienen como productos
finales: un alcohol en forma de etanol cuya fórmula química es: CH3-CH2-OH,
dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que
consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular.
En este proyecto para la obtención de vinagre nuestro microorganismo de interés

es la Saccharomyces cerevisiae como se observa en la imagen 1.
Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces

cerevisiae. Tomada de google imágenes
2.2 Fermentación acética
Es la fermentación bacteriana por Acetobacter, un género de bacterias aeróbicas,

que transforma el alcohol en ácido acético. La fermentación acética del vino
proporciona el vinagre debido a un exceso de oxígeno y es considerado uno de los
fallos del vino.
6
Acetobacter es un género de bacterias del ácido acético caracterizado por su

habilidad de convertir el alcohol (etanol) en ácido acético en presencia de aire.
Hay muchas especies en este género y también otras bacterias son capaces de
formar ácido acético bajo varias condiciones; pero todas las Acetobacter son
reconocidas por esta habilidad característica.
El microorganismo de interés para la obtención de vinagre es la Acebacter Acetic

como se muestra en la figura 2.
Imagen 2. Imagen de levadura Acetobacter

AceticTomada de google imágenes
2.3 Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son soluciones compuestas por nutrientes específicos para
que así los microorganismos puedan desarrollarse en un laboratorio. La
composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, ya que las
necesidades nutricionales varían considerablemente. Se pueden clasificar de
acuerdo a su estado, complejidad, y aplicaciones.
En cuanto al estado se encuentran medios sólidos, semisólidos y líquidos, los

sólidos contienen una sustancia gelificante conocida como agar-agar, los
semisólidos contienen una menor concentración de agar-agar (0.5 a 0.7%) y los
líquidos no contienen agar-agar, debido a su naturaleza los medios sólidos o
agares se sirven en cajas de Petri mientras que los medios líquidos o caldos de
cultivo y los semisólidos se sirven en tubos de ensayo. Según las aplicaciones de
los medios de se clasifican en enriquecidos, selectivos, diferenciales.1
1Instructivopara la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés

biotecnológico práctica 1. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
7
Imagen 1. Medios de cultivo sólido

(Agar), tomada de google imágenes
Para la preparación de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales

tales como la disponibilidad de nutrientes adecuados, la consistencia adecuada
del medio, presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases, condiciones
adecuadas de humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio.
2.4 Aislamiento de Microorganismos de Interés
Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa

una gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podrían ser útiles al
hombre, mientras que otros podrían ser patógenos. La separación de cada una
de estas variedades es lo que se conoce como aislamiento de microorganismos.
Los microorganismos son ubicuos (pueden estar en cualquier lugar), gracias a

esta característica pueden colonizar cualquier ambiente, desde un rio hasta una
escultura de hierro, esa habilidad es debido a sus procesos metabólicos y
sistemas enzimáticos. Para aprovechar esas características de los
microorganismos, en beneficio de la industria y el medio ambiente, es de vital
importancia poder aislarlos de su medio natural y llevarlos a medios sintéticos
para poder manipularlos en el laboratorio. 2
2.5 Aislamiento por Estrías
Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de interés, es

necesario realizar aislamientos que permitan obtener cultivos puros de los
microorganismos objeto de estudio. La técnica de aislamiento por estría o técnica
de siembra por agotamiento de colonias y la obtención de cultivos axénicos (una
sola especie microbiana proveniente de una sola célula) a partir de cultivos
mixtos; esta técnica diluye la muestra de microorganismos a partir del trazo de
2Instructivo para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés

práctica 2. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
8
estrías sucesivas sobre una placa de agar permitiendo el posterior crecimiento de

colonias totalmente aisladas.3
Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta

parte de la superficie de la placa; se quema el asa, se enfría, se gira la placa a
90°c y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y
cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de
la superficie sin sembrar (Ver imagen 3).
Imagen 3. Imagen de procedimiento de

aislamiento de microorganismos por estrías.
Tomada de google imágenes
2.6 Tinción de Gram o Coloración de Gram
La coloración de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología que

permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: las Gram positivas aquellas
que se visualizan en morado y las Gram negativas aquellas que se visualizan de
color rosa, rojo o grosella según se comporten ante su tinción. El fundamento
radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: la Gram
positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano mientras que las bacterias
Gram negativas poseen una capa peptidoglicano más fina y una capa de
lipopolisacarídica externa.
Imagen 2. Imagen de bacterias Gram

positivas (color morado) y bacterias Gram
negativas (color rosa). Tomada de google
imágenes
3
Instructivo para realizar la técnica de aislamiento por estrías práctica de laboratorio práctica 4.
Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
9
Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor
facilidad que las Gram positiva debido al grosor de la pared celular.
Para realizar la coloración de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y

colorantes tales como: el cristal violeta, lugol, etanol y fucsina.
 Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloración de Gram que se

adhiere a la pared de todas las células bacterianas, las Gram positivas absorben
este colorante debido al grosor de su pared celular y al porcentaje mayor de
ácido teicoico.
 Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

potasio) y SI (siulterio), Cumple la función de fijar el colorante primario (cristal
violeta) en la preparación.
 Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloración en este paso los

microrganismos Gram positivos no se decoloran mientras los Gram negativos si lo
hacen.
 Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el último compuesto que

se le adiciona a la coloración en Gram y en el cual se puede determinar las Gram
positivas y las Gram negativas de acuerdo al color y al contraste.
2.7 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas
La identificación microscópica y macroscópica de los microorganismos

proporciona una idea general acerca de la identificación de microorganismo, de
hecho estas son técnicas preliminares que permiten seleccionar pruebas de mayor
especificad como la realización de pruebas bioquímicas que dejan ver las
características metabólicas de los microorganismos frente a un compuesto
específico; así como por ejemplo el caso del género Saccharomyces, es
necesario determinar las características de asimilación y fermentación de diversos
azúcares, así como la capacidad de tolerancia al etanol y su reacción frente a la
urea. 4
4
Instructivo para la identificación de microorganismos mediante pruebas bioquímicas práctica 5.
Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
10
Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones que determinan la

actividad de una vía metabólica de la bacteria a partir de un sustrato de que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Para
ello, hay que partir de un cultivo obtenido en el aislamiento, subcultivando de una
colonia bien aislada. La identificación de una especie requiere de estas pruebas.
Es aconsejable tener en cuenta:
 Cambios que se producen

 Reacciones químicas que se producen
 Enzimas que intervienen
 Productos intermedios
 Secuencia de las reacciones bioquímicas
 Prueba de Fermentación de azúcares: En esta prueba se determina si la

bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular (producción de ácidos
acompañados o no de gases). Se aplica a bacterias con metabolismo fermentador,
ensayándose por separado con diferentes carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa, entre otras).
 Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los

microorganismos obtenidos son resistentes al etanol y si son capaces de
presentar mayor rendimiento de este, ya que es una característica de las
levaduras.
11
3. PROCEDIMIENTOS
3.1 Preparación de Medios de Cultivo
Observar la etiqueta de cultivo

deshidratado.
Realizar los cálculos de acuerdo

a las indicaciones de la etiqueta.
Para medio sólido (agar) se necesitan Para caldos de cultivo son necesarios
20mL del medio de cultivo. 10mL por tubo.
Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de

medio requerida de acuerdo a los cálculos
realizados.
Medir con una probeta agua

desionizada para disolver el medio.
Disolver con agua el medio de cultivo

previamente pesado para lograr una
disolución eficaz.
Verter la mitad de agua desionizada en el

frasco de disolución y adicionar el cultivo, Rotular frascos
agitar y terminar de adicionar el agua.
Consultar en la etiqueta del medio

deshidratado si es necesario calentar
12
Si el medio que se prepara es un caldo de

cultivo antes de llevarlo al autoclave de servir
en tapas-rosca
Con ayuda del Beaker transferir 10mL

aprox. para cada tubo de ensayo.
Llevar el medio disuelto al autoclave y

esterilizar durante 15min a 15psi y 120°c
Una vez esterilizado el agar, sacar el

frasco y cerrar la tapa
Rotular cajas de Petri: nombre del medio,

fecha y grupo responsable
Servir en cajas de Petri estériles

acercando al mechero
Dejar solidificar el agar llevar a una

incubadora (37°- 48 horas)
Almacenar en refrigeración, las cajas de

Petri se deben agrupar y envolver en
papel vinipel
13
3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés
Pesar en un reloj de vidrio 10g de la muestra a

partir de la cual se aislaran los
microorganismos de interés
Adicionar los 10g de la muestra al frasco con

los 90mL de agua peptonada al 0.1% p/v
Homogenizar durante 5min, obteniendo la

dilución de 10-1
Realizar disoluciones seriadas a partir de la

disolución de 10-1 (ver imagen 4)
Tomar 1mL de la disolución de 10-1 y

suspender en 1 de los tubos con 9mL de agua
Agitar hasta homogenizar obteniendo la

disolución 10-2
A partir de la disolución 10-2 realizar la

disolución 10-3 y así sucesivamente hasta
llegar a la disolución 10-7
Sembrar 0.1mL de las disoluciones 10-4 a 10-7

sobre la superficie del agar específico
Homogenizar los 0.1mL sobre la superficie del

agar, empleando el asa de vidrio estéril
14
Homogenizar empezando por la caja donde se

sembró la mayor disolución
Dejar secar las cajas de Petri y llevar a la

incubadora
Seleccionar las cajas que tengan entre 30 y

300 colonias y realizar el recuento de todas las
colonias
Identificar las características morfológicas de

las colonias
Seleccionar aquellas colonias que

correspondan a las reportadas para el
microrganismo de interés
A las colonias seleccionadas realizar

identificación microscópica o enzimática
Imagen 4. Procedimiento de disoluciones. Imagen obtenida de google

imágenes
15
3.3 Aislamiento por Estrías
Tomar los cultivos mixtos donde se

encuentran los microorganismos de interés
Ubicar las colonias previamente

identificadas de acuerdos a identificación
microscópica y macroscópica realizada
Rotular base de la caja de Petri donde se

encuentra el medio de cultivo apto para el
crecimiento de microorganismo a aislar
Señalar el número de la colonia, la muestra

de donde proviene y la fecha
Esterilizar el asa recta hasta que tome un

color rojo incandescente y dejarla enfriar
Tomar una muestra de la colonia con el

asa estéril y fría al lado del mechero
Colocar la muestra en un extremo de la

superficie del agar estéril
Esterilizar el asa y dejarla enfriar
Realizar de 5 a 6 con el asa redonda estéril

estrías paralelas, consecutivas y juntas no
superpuestas
16
Realizar un primer grupo de estrías en el

cuadrante 1 de la caja (ver imagen 2)
Cerrar la caja Petri y girarla 90°, destapar y

empezar un segundo grupo de estrías
aprox. 4 a partir de la última realizada

empezar un tercer grupo de estrías aprox.
4 a partir de la última realizada

empezar un cuarto grupo de estrías aprox.
4 estrías realizando una especie de espiral
Llevar caja de Petri a incubar, después de

ello realizar identificación macro y
microscópica de las colonias aisladas
Imagen 5. Caja de Petri, aislamiento por estrías tomada de guía

de práctica de laboratorio, aislamiento por estrías
17
3.4. Tinción de Gram o Coloración de Gram
Tomar una lámina limpia, seca y estéril,

adicionar una gota de agua sobre esta
Con un asa esterilizada tomar un poco

del cultivo, colocarla sobre la lámina y
hacer un extendido sobre esta
Esperar a que seque a temperatura

ambiente y fijar pasando 5 veces la
llama del mechero
Adicionar 3-4 gotas de cristal violeta

sobre la lámina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 gotas de lugol sobre la

lámina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lámina y

esperar 30 segundos
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lámina y

esperar 30 segundos
18
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de fucsina sobre la lámina

y esperar 1 minuto
Enjugar con agua
Esperar a que seque a temperatura

ambiente
Llevar al microscopio óptico y enfocar

primero en 4X
Adicionar una gota de aceite de

inmersión
Enfocar en 100X e identificar si son

Gram+ (moradas) o Gram-(rosa)
19
3.5.1 Fermentación de azúcares
Tubo1: Caldo Glucosa Elaborar una batería compuesta para cada

Tubo2: Caldo Sacarosa microorganismo a probar por 6 tubos de 5 mL
Tubo3: Caldo Maltosa
Tubo4: Caldo Ribosa Rotular los tubos de ensayo con la
Tubo5: Caldo Xilosa identificación de la colonia a probar, azúcar,
Tubo6: Caldo Lactosa número de grupo y fecha
Para preparación de medios
ver Tabla 1.
Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del
mechero
Tomar una muestra de la colonia del

microorganismo seleccionado y sembrar en el
caldo de glucosa
Suspender la colonia agitando el asa dentro

del medio, tapar el tubo y agitar
Esterilizar el asa, volver a tomar de la

muestra de la misma colonia y sembrar en el
caldo de sacarosa
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar

de sembrar en cada uno de los azúcares a
probar
Llevar a incubar los tubos a 30°C,

revisándolos a las 24, 48 y 72 horas y
reportando como fermentación o asimilación
Reportar las reacciones bioquímicas como

asimilación: si hay presencia de CO2, turbidez
y cambio de pH. Comparar resultados con
Tabla 2.
20
Tabla 1. Preparación de Medio para fermentación de azúcares (Tomada de guía

de laboratorio práctica N° 4)
COMPONENTE g/L
NaCl 8.5
Peptona 5
Carbohidrato a probar 10
Rojo de fenol 1 mL
Agua destilada 1000 mL
Tabla 2. Fermentación de azúcares para Saccharomyces cerevisiae (Tomada de

guía de laboratorio práctica N° 4)
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa +
Galactosa +
Ribosa -
Arabinosa -
Sacarosa +
Maltosa +
Celobiosa -
Trehalosa +
Lactosa -
Xilosa -
Rafinosa +
Ramnosa +
21
3.5.2 Tolerancia de Etanol
Para cada microorganismo a identificar

elaborar 4 tubos en calo OGY
Tubo1: 2% de etanol
Tubo2: 4% de etanol Después de esterilizado el medio OGY
Tubo3: 6% de etanol adicionar etanol en cada uno de los 4 tubos
Tubo4: 8% de etanol
Rotular los tubos de ensayo con la
identificación de la colonia a probar,
concentración de etanol, número de grupo y
fecha
Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del

mechero
Tomar una muestra de la colonia del

microorganismo seleccionado y sembrar en
tubo de ensayo con concentración de etanol
mayor
Suspender la colonia agitando el asa dentro

del medio, tape el tubo y homogenizar
Esterilizar el asa, volver a tomar una muestra

de la misma colonia y sembrar en tubo de 8%
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar

de sembrar en cada una de las
concentraciones de etanol a probar
Llevar tubos de ensayo a la incubadora a 30°C

durante 5 días
Terminar el tiempo de incubación, realizar

lectura del crecimiento en el medio de cultivo
(verificar por turbidez)
22
3.6 Fermentación alcohólica
Prepara 900 mL de zumo de jugo de naranja
Esterilizar el jugo de naranja

En autoclave
Ajustar pH de 3.17 a 4.48 de acuerdo al

requerimiento con NaOH
Ajustar °Brix de 16 a 18 adicionando

sacarasora
Adicionar 100mL de inoculo
Realizar para liberación de CO2 y toma de

muestra
Ajustar temperatura y agitar en el equipo

Cheicker
Llevar registro en la tabla de control de

variables de acuerdo a las especificaciones
23
4. RESULTADOS
4.1 Cálculos para Elaboración de Medios de Cultivo
 Agar YGC Hongos y levaduras
10 cajas de Petri
Preparar 200mL
38,1𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 7,62𝑔
1000𝑚𝐿
4.2 Cálculos para Aislamiento de Microorganismos de Interés
Extracto:
10𝑔
200𝑚𝐿 ∗ ( ) = 2𝑔
1000𝑚𝐿
Adicionar en agua destilada y seguir procedimiento imagen 6:
Imagen 6. Disoluciones para aislamiento de microorganismos de

interés, agua peptonada con jugo de fermento de naranja valencia
En la preparación para el aislamiento de los microorganismos de interés se

disuelven 10mL del jugo fermentado de naranja valencia en 90mL de agua
peptonada, luego se toma 1mL de esta disolución y se agregan en los 9mL de gua
24
peptonada en cada tubo de ensayo, se realiza procedimiento consecutivamente

hasta llegar a la disolución de 10-6 como se observa en la imagen 6. Se emplean
las diluciones de 10-4 ,10-5 y 10-6 para la obtención de los microorganismos de
interés debido a que las demás poseen gran cantidad de carga microbiana.
4.3 Caracterización de los medios de cultivo obtenidos
COLONIA SELECCIONADA COLORACIÓN DE GRAM OBSERVACIONES
Según los resultados de

coloración de Gram que
se realiza al medio A,
se observa que los
microorganismos
obtenidos son levaduras
y por tanto se puede
realizar pruebas
biomequimicas esta. Se
verifica que no están
contaminadas.
A
Según los resultados de

coloración de Gram que
se realiza al medio B,
se observa que los
microorganismos
obtenidos son levaduras
y por tanto se puede
realizar pruebas
biomequimicas esta. Se
verifica que no están
contaminadas.
B
25
4.4 Conteo de colonias
 Aislamiento colonia seleccionada A
10-3= 616000 = 61,6 x104 UFC/mL

10-1= 5650000 = 56,5x105 UFC/mL
 Aislamiento colonia seleccionada B
10-3= 5000 = 5x103 UFC/mL

10-1= 408000 = 40,8x104 UFC/mL
A continuación se realizan las pruebas bioquímicas de fermentación de azúcares y

tolerancia de etanol para el microorganismo de interés en este caso las levaduras
obtenidas según la coloración de Gram y los medios empleados que se utilizaron
para elaborar estas pruebas.
4.5.1 Cálculos de Fermentación de azúcares
Se preparan 30mL para cada uno de los medios en 6 tubos de ensayo para cada
carbohidrato a probar:
NaCl  8.5 g/L
8,5𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,25𝑔
1000𝑚𝐿
Peptona 5 g/L
5𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,15𝑔
1000𝑚𝐿
Carbohidrato a probar:
(Glucosa, sacarosa, maltosa, ribosa, xilosa y latosa) 10 g/L
26
10𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,3𝑔
1000𝑚𝐿
El rojo de fenol es aplicado después de haber diluido cada uno de los

componentes en la preparación del medio.
Rojo de fenol 1mL
10𝑔
30𝑚𝐿 ∗ ( ) = 0,3𝑔
1000𝑚𝐿
Se toma muestra de A y B y se homogeniza en cada uno de los medios como se

ve en la figura 8.
Imagen 8. Procedimiento de fermentación de azúcares
4.5.2 Cálculos de Tolerancia al Etanol
Etanol al 2%
2𝑚𝐿 100𝑚𝐿
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,104𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
27
Etanol al 4%
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,208𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Etanol al 6%
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,313𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Etanol al 8%
5𝑚𝐿 ∗ ( )( ) = 0,417𝑚𝐿
1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Se homogeniza la muestra en cada una de las concentraciones del etanol como

se visualiza en la figura 9.
Imagen 9. Procedimiento de tolerancia al etanol
28
4.5.3 Resultados de Fermentación de Azúcares
Maltosa Sacarosa Glucosa
Lactosa Xilosa Ribosa
Imagen 10. Fotos de resultados de prueba de azúcares, realizada en

laboratorio de Microbiología
Positiva +
Negativa  -
29
Tipo de azúcar Muestra A Muestra B

YGC 10-5 YGC 10-4
Maltosa + +
Sacarosa + +
Glucosa + +
Lactosa - -
Xilosa - -
Ribosa - -
Se observa que en esta prueba solo dan positivas la maltosa, la sacarosa y la
glucosa y las demás son negativas, estos resultado indican la posible presencia
del microorganismo de interés que en este caso es la Saccharomyces cerevisiae
según el marco teórico.
4.5.4 Resultados de Tolerancia al Etanol
La siguiente prueba de tolerancia de etanol se le realiza solo a la muestra que ha

sido seleccionada para reafirmar que tiene el microorganismo de interes la cual
muestra los siguientes resultados:
Imagen 11. Imagen de resultados de prueba de etanol
Los resultados que obtuvimos de la prueba de etanol es que el microorganismo de

interes (Saccharomyces cerevisiae) nos demuestran que el microorganismo es
resistente hasta 8 % de alcohol, ya que todos los tubos dieron positivo, dando así
a presencia de microorganismos.
30
4.6 Tabla de registro para control de variables de fermentación alcohólica
Después de llevar a cabo el procedimiento de fermentación alcohólica que se

describe en el punto 3.6 de este documento procedemos a tomar los grados Brix,
pH y tomar fecha y hora de la muestra. Con el fin de seguir el proceso de
fermentación tomamos muestras los días 1, 2, 3, 8 y 15 y tomamos los datos
anteriormente mencionados, los datos obtenidos de esta toma de muestras se
puede ver en la siguiente tabla.
DIA FECHA HORA TEMPERATURA pH r.p.m. PUREZA [ ] DE [ ] DE

AZUCAR ALCOHOL
1 22/02/2015 10:22 4.48 N.A. N.A. 18.50 N.A.
a.m.
2 23/02/2015 01:28 4.84 N.A. N.A. 7.50 N.A.
p.m.
3 24/02/2015 03:23 4.60 N.A. N.A. 7.00 N.A.
p.m.
8 01/03/2015 10:35 4.54 N.A. N.A. 6.00 N.A.
a.m.
15 08/03/2015 11:00 4.54 N.A. N.A. 2.50 9.5%
a.m.
[ ] DE AZUCAR
20
18
Concentración de azucar
16 18.5
14
12
10
8
6
7.5 7
4 6
2
0 2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Día
Gráfica 1. Concentración de azúcar
31
A partir de la gráfica 1 podemos determinar que si se da una fermentación, debido

a que la cantidad de sacarosa presente va disminuyendo y lo atribuimos al
crecimiento de levaduras del genero Saccharomyces cerevisiae, que se alimentan
de los azucares presentes en el zumo y producen etanol en este intercambio de
energía.
32
5. ANÁLISIS DE RESULTADOS
Al desarrollar la práctica de laboratorio se prepararon varios medios de cultivo

para el crecimiento de los microorganismos de interés en este caso levaduras con
el fin de llevar a cabo una fermentación alcohólica a partir del jugo obtenido de
naranjas de la variedad “valencia” o citrus sinensis.
Después de haber aislado el microorganismo de interés (Saccharomyces

cerevisiae) y así obtener diferentes colonias observadas, y que fueron
debidamente identificadas por medio de método de tinción de Gram, todas dieron
gram positivas. Posteriormente se hizo un nuevo aislamiento a partir de las
colonias seleccionas.
El conteo de la carga microbiana para cada una de las muestras trabajadas es el

siguiente, varía de acuerdo a la disolución y el medio.
Aislamiento colonia seleccionada A

Disolución 10-3 con carga microbiana 61,6 x104 UFC/mL
Disolución 10-1 con carga microbiana 56,5x105 UFC/mL
Aislamiento colonia seleccionada B

Disolución 10-3 con carga microbiana 5x103 UFC/mL
Disolución 10-3 con carga microbiana 40,8x104 UFC/mL
El resultado de aislamiento por estrías es un método que fue realizado a las

disoluciones 10-4 y 10-5 y como se observa, solo las muestras A y B cumplen con
los requerimientos adecuados, por tal razón se realizan a partir de ellos otro
aislamiento por estría a partir del cual de los cuales se realizan pruebas
bioquímicas para corroborar que fueron correctamente aislados los
microorganismos de interés.
Después de corroborar que se aisló el microorganismo de interés procedemos a

hacer la fermentación alcohólica, teniendo como materia prima el jugo de la
naranja valencia o citrus sinensis, al que le agregamos el inoculo de la levadura,
posteriormente ajustamos pH, grados Brix, y temperatura. De acuerdo a los días
estipulados se toman muestras con el fin de llevar un control de la fermentación. Al
final de este ciclo fermentativo tomamos 100mL de dicho fermento el cual filtramos
vacío, seguidamente llevamos a rota evaporar, para así poder saber el porcentaje
de etanol producido, con lo cual se obtuvo 9,5% de alcohol.
33
6. CONCLUSIONES
Se prepararon los medios de cultivo agar-agar YGC para el crecimiento y

desarrollo del microorganismo de interés (levadura Saccharomyces cerevisiae) ,
realizando los respectivos cálculos y adecuándolos de acuerdos a lo requerido.
Para lo anterior se tuvieron en cuenta diferentes tipos de disoluciones preparadas
partiendo del agua peptonada y las colonias seleccionadas anteriormente.
Se realizó aislamiento microbiano a partir de las colonias seleccionadas

anteriormente caracterización macroscópica de los cada uno de los
microorganismos recuperados del fermento de Naranja valencia (Citrus sinensis).
Se efectuó coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram

negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
Se aislaron los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento por

estrías.
Se hicieron pruebas Bioquímicas a los microorganismos de interés como prueba

de fermentación de azúcares y tolerancia de etanol, las cuales dieron positivas de
acuerdo a lo esperado para evidenciar la presencia del microorganismo de interés.
Se preparó un fermento alcohólico a partir del jugo de Naranja valencia (Citrus

sinensis) y el inoculo del microorganismo de interés anteriormente aislado.
Se tomaron muestras en días especificados de nuestro fermento para así poder

controlar las variables y registrar el proceso.
Se rota evaporo 100mL del fermento para conocer cuál fue el producto del ciclo
fermentativo alcohólico, obteniendo así 9,5% de alcohol.
34
7. BIBLIOGRAFÍA
Instructivo para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de

microorganismos de interés biotecnológico práctica 1. Servicio Nacional de
Aprendizaje. SENA, 2014.
Instructivo para realizar la técnica de aislamiento por estrías práctica de laboratorio

práctica 2 y 3. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
Instructivo para la identificación de microorganismos mediante pruebas

bioquímicas práctica 5. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014
HERNANDEZ, Alicia. Microbiología Industrial. [En línea].

http://books.google.com.co/books?id=KFq4oEQQjdEC&printsec=frontcover&sourc
e=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false> [Citado el 23 de julio de
2014]
35

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INFORME #2 DE MICROBIOLOGÍA

PREPARACIÓN PARA LA FERMENTACIÓN

PREPARACIÓN PARA LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA A PARTIR DEL

MAGALY SÁNCHEZ BENAVIDEZ

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA

4.4 Conteo de colonias ........................................................................................ 26

En este informe se abordará el proceso de fermentación para la obtención de

Preparar fermentación alcohólica y acética a partir del zumo de naranja valencia

 Elaborar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de

 Realizar aislamiento a partir de la caracterización macroscópica de los

 Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de

 Efectuar coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram

 Aislar los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento

La fermentación es un proceso catabólico (rompimiento de compuestos complejos

En los seres vivos, la fermentación es un proceso anaeróbico donde no interviene

2.1 Fermentación alcohólica

Es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de oxigeno

En este proyecto para la obtención de vinagre nuestro microorganismo de interés

Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces

2.2 Fermentación acética

Es la fermentación bacteriana por Acetobacter, un género de bacterias aeróbicas,

Acetobacter es un género de bacterias del ácido acético caracterizado por su

El microorganismo de interés para la obtención de vinagre es la Acebacter Acetic

Imagen 2. Imagen de levadura Acetobacter

2.3 Medios de Cultivo

En cuanto al estado se encuentran medios sólidos, semisólidos y líquidos, los

1Instructivopara la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés

Imagen 1. Medios de cultivo sólido

Para la preparación de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales

2.4 Aislamiento de Microorganismos de Interés

Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa

Los microorganismos son ubicuos (pueden estar en cualquier lugar), gracias a

2.5 Aislamiento por Estrías

Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de interés, es

2Instructivo para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés

estrías sucesivas sobre una placa de agar permitiendo el posterior crecimiento de

Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta

Imagen 3. Imagen de procedimiento de

2.6 Tinción de Gram o Coloración de Gram

La coloración de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología que

Imagen 2. Imagen de bacterias Gram

Para realizar la coloración de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y

 Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloración de Gram que se

 Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

 Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloración en este paso los

 Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el último compuesto que

2.7 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas

La identificación microscópica y macroscópica de los microorganismos

Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones que determinan la

 Cambios que se producen

 Prueba de Fermentación de azúcares: En esta prueba se determina si la

 Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los

3.1 Preparación de Medios de Cultivo

Observar la etiqueta de cultivo

Realizar los cálculos de acuerdo

Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de

Medir con una probeta agua

Disolver con agua el medio de cultivo

Verter la mitad de agua desionizada en el

Consultar en la etiqueta del medio

Si el medio que se prepara es un caldo de

Con ayuda del Beaker transferir 10mL

Llevar el medio disuelto al autoclave y

Una vez esterilizado el agar, sacar el