Invertase: preparação do extrato não purificado da enzima e estudo cinético da

catálise da invertase
Mariana Silva, nº84210, Rita Nunes, nº84560 – Turma P2
Curso de Bioquímica, Universidade de Aveiro, 3810-193 Aveiro, Portugal

Data de realização experimental do trabalho: 15.05.18 e 22.05.18

Palavras Chave: Enzima, Invertase, Catálise.

Resumo da velocidade inicial da reação, v0, é dada pela equação

cinética de Michaelis-Menten:
A partir de um extrato não purificado da invertase de
Saccharomyces cerevisae, preparou-se soluções de
extrato com diferentes diluições, escolhendo-se depois a
mais adequada, para posterior cálculo da atividade em que KM é a constante de Michaelis-Menten,
enzimática, a partir de uma curva de calibração de
padrões equimolares de glucose/frutose. Posteriormente,
o método de Biureto permitiu obter a concentração de
proteína em mg/mL de extrato, a partir da qual se calcula e Vmáx é a sua velocidade máxima que depende da
a atividade enzimática específica. Seguidamente, constante de velocidade k2:
determinou-se a variação da atividade enzimática da
invertase pela concentração de sacarose, através da
leitura da absorvência a 540 nm de tubos com igual
concentração de extrato mas concentrações variáveis de
sacarose. Por fim através da atividade enzimática Esta velocidade máxima é atingida quando a proporção
determinada foi possível calcular as constantes de Km e [S]/[E] atinge valores suficientemente grandes para
Vmáx, sendo que os valores obtidos foram 0,225 mmol/L saturar a enzima, ou seja, para fazer com que todas as
e 1,32 UI, respetivamente. moléculas de enzima se encontrem ligadas ao substrato
([ES] = [E]total). Os parâmetros KM e k2 são característicos
de cada reação enzimática e de cada enzima. Km, a
Introdução constante de Michaelis-Menten, corresponde à
concentração de S em que se atinge metade da velocidade
máxima e que traduz a afinidade do substrato em relação
à enzima.
As enzimas são biomoléculas responsáveis pela catálise
Para se conhecer o valor de KM seria necessário conhecer
de diferentes reações em sistemas biológicos. Através da
o valor da velocidade máxima, o que nem sempre é fácil.
diminuição da energia de ativação reacional, elas
Lineweaver e Burk propuseram que se utilizasse nos
possibilitam que a vida possa ocorrer em condições
gráficos os valores inversos daqueles que aparecem na
amenas de temperatura e pressão.
equação de Michaelis-Menten, ou seja:
A invertase, ou β-D-fruto-furanosidio-fruto-hidrólase,
ou sacarase, é a enzima responsável pela libertação do
resíduo β-D-frutofuranosidio não-redutor, a partir da
molécula de dissacarídeo. O seu substrato é a sacarose,
Se se representar graficamente 1/v em função de 1/[S],
resultando da sua hidrólise uma molécula de glicose (α-D-
e a cinética da enzima for de Michaelis-Menten, então
glucopiranose) e outra de frutose (β-D-frutofuranose).
obtém-se uma reta cujo declive é KM/Vmáx e cuja
A velocidade de uma reação catalisada enzimaticamente
ordenada na origem é 1/Vmáx, sendo 1/KM a abcissa do
depende de muitos fatores e o conhecimento da cinética
ponto da reta cuja ordenada é nula. Esta representação da
de uma reação é importante para a caracterização da
equação de Michaelis-Menten é de utilização prática
respetiva enzima pois permite saber mais sobre o seu
porque permite fazer um ajuste da função teórica aos
comportamento, como também, prever o seu mecanismo
dados experimentais através de uma simples regressão
de ação.
linear.1
A reação enzimática mais simples pode ser representada
da seguinte forma:
Para cumprir o objetivo do trabalho, mediu-se a variação
da concentração de produtos a partir de um extrato
enzimático de Sccharamyces cerevisae de fermento de
em que E é a enzima livre, S é o substrato da reação, P é o
padeiro, de modo a estudar-se a atividade enzimática da
produto e ES é o complexo enzima-substrato. Pode
invertase, isto é, a velocidade da reação de consumo de
demonstrar-se que, quando [S]>>[P] (início da reação) e
substrato, a sacarose. Para isto, mediu-se a quantidade de
quando [ES] é constante (estado estacionário), a equação
açúcares redutores formada. Esta determinação é
conseguida com a utilização do ácido 3,5-dinitrossalicílico
(DNS) que reage com açúcares redutores, originando
produtos corados, cuja intensidade é medida por
espetrofotometria a 540 nm. Assim a sua absorvência será
diretamente proporcional à concentração de açúcares
redutores presentes. O DNS oxida os grupos carbonilo dos
açúcares a grupos carboxilo e o DNS passa a ácido 3-
amino-5-nitrossalicílico. A sua adição causa a
desnaturação da enzima devido ao seu pH ácido, cessando
a reação enzimática.
Na fase inicial do trabalho determinou-se a diluição mais
adequada do extrato de invertase para a determinação da
atividade enzimática, a qual foi usada para se calcular a
sua atividade enzimática especifica e total do extrato não
purificado da enzima. A atividade enzimática específica é
calculada pois permite-nos saber a afinidade da invertase
para a proteína que estamos a usar.
A partir do método do Biureto foi possível calcular a
concentração de proteína em miligrama por mililitro de
extrato e posteriormente, a atividade enzimática
específica em UI/mg de proteína. Tanto o cálculo da
atividade enzimática da invertase como da atividade
específica devem ter em conta a zona linear da lei de Beer-
Lambert e, consequentemente, a diluição do extrato
enzimático efetuada. 2
Metodologia
Este trabalho prático foi realizado em duas aulas, sendo
que o extrato não purificado já se encontrava preparado
em ambas as aulas (3.1). O nosso grupo realizou primeiro
os últimos dois pontos, correspondentes à determinação
da concentração de proteína total através do método do
Biureto (3.4) e à variação da atividade da enzima com a
concentração de substrato (sacarose) (3.5). Esta parte foi
feita com a indicação de usar a diluição 1:100, assim
sendo, todo o trabalho e resultados neste trabalho
prático vão ter essa informação como base. Na aula
seguinte, realizou-se os outros dois pontos, o estudo da
diluição do extrato da enzima (invertase) (3.2) e a
preparação da curva de calibração de uma solução
equimolar de glucose e frutose para determinação de
açúcares redutores (3.3). No entanto, nesta segunda aula
o extrato utilizado encontrava-se mais diluído do que
esperado, o que resultou em valores de absorvência
menores. Contudo esta parte do trabalho prático não
influenciou o passo 3.3 também realizado na segunda
aula.
Reagente de DNS (já preparado)
Dissolveu-se 5 g de ácido 3,5-dinitrossalicílico em 100 mL
de solução morna de NaOH 2 mol/L. Paralelamente,
dissolveu-se por aquecimento 150 g de tartarato de sódio
2
e potássio em cerca de 250 mL de água. Após
arrefecimento, as duas soluções foram combinadas e
adicionada água destilada até 500 mL.
Reagente de Biureto (já preparado)
Dissolveu-se 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6,0 g de tartarato
de sódio e potássio em 500 mL de água destilada.
Transferiu-se quantitativamente com água destilada para
um balão volumétrico de 1 L. Adicionou-se 300 mL de
NaOH 10% (w/v) e perfez-se o volume com água destilada
e adicionou-se 1 g de KI.
3.1 – Preparação do extrato não purificado da enzima
Homogeneizou-se 50 g de fermento de padeiro em 100
mL de solução de NaHCO3 0,1 mol/L durante 1 ou 2
minutos. Transferiu-se a mistura para um Erlenmeyer de
250 mL, vedou-se com um pouco de algodão e incubou-se
num banho termostatizado a 40 ºC durante 24 horas, para
que a invertase fosse secretada para o meio extracelular.
Centrifugou-se a mistura durante 15 minutos e transferiu-
se o líquido sobrenadante, límpido, para uma proveta,
registou-se o volume e guardou-se o extrato da enzima no
frigorífico.
3.2 - Estudo da diluição do extrato da enzima (invertase)
Primeiramente, preparou-se soluções diluídas de
extrato enzimático a partir do extrato inicial na proporção
de 1:100 (1,0 mL de extrato), 1:500 (0,2 mL de extrato) e
1:1000 (0,1 mL de extrato), em balões de diluição de 100
mL e diluiu-se em tampão acetato. Pipetou-se 1,0 mL de
cada diluição para o respetivo tubo de ensaio, assim como
também se adicionou 1,0 mL de extrato não diluído a um
tubo e 1,0 mL de água destilada a outro, em duplicado. De
seguida, termostatizou-se os tubos de ensaio num banho
a 25 ºC durante 5.0 minutos. Após o banho adicionou-se a
cada tubo 1,0 mL de solução de sacarose 250 mmol/L,
agitou-se bem e termostatizou-se novamente a 25 ºC
durante 15.0 minutos, tendo sempre o cuidado para que
os tubos não permanecessem muito tempo fora do
banho. Depois, parou-se a reação devido à adição de 2,0
mL de ácido 3,5-dinitrossalicílico a cada um dos tubos e
agitou-se no Vórtex (VELP SCIENTIFICA, F20220176).
Aqueceu-se os tubos de ensaio num banho de água em
ebulição durante 5.0 minutos, observando-se o
aparecimento de cor vermelho-acastanhado nas soluções.
Arrefeceu-se em gelo e diluiu-se as soluções até 10,0 mL
com água destilada, agitando bem no Vórtex. Por fim, leu-
se e registou-se os valores da absorvência para cada tubo
a 540 nm, tomando o branco como zero, no
espetrofotómetro (SHIMADZU, UVmini – 1240, incerteza
de 0,001). Selecionou-se o extrato de invertase com a
diluição adequada, 1:100 e calculou-se a velocidade em
unidades de A540 nm por minuto.
3.3 - Preparação da curva de calibração de uma solução
equimolar de glucose e frutose para determinação de
açúcares redutores
Pipetou-se para uma série de tubos de ensaio 0,10, 0,25,
0,50, 0,70, 0,90 e 1,0 mL de solução equimolar de
glucose/frutose 40,0 mmol/L, e perfez-se o volume total
de cada tubo até 1,0 mL com água destilada, preparando-
se duplicados de cada concentração. No tubo do branco
utilizou-se 1,0 mL de água destilada. De seguida,
adicionou-se a cada tubo 1,0 mL de solução de sacarose
250 mmol/L e seguidamente 2,0 mL de reagente de DNS,
agitando-se no Vórtex. Aqueceu-se os tubos num banho
de água em ebulição durante 5.0 minutos, observando-se
aparecimento de cor laranja/avermelhado nas soluções.
Seguidamente, arrefeceu-se os tubos em gelo e dilui-se
até 10,0 mL com água, agitando-se no Vórtex. Leu-se e
registou-se as absorvências a 540 nm e construiu-se a
curva de calibração, usando-a para calcular a atividade
enzimática em unidades internacionais (UI), ou seja, em
µmol de produto formado por minuto para o extrato
selecionado no ensaio 3.2.
3.4 - Determinação da concentração de proteína total
através do método do Biureto
A partir da solução mãe de albumina (25 mg/ml)
preparou-se os padrões de gama de linearidade 1,0-6,0
mg/mL, transferiu-se várias alíquotas, respetivamente de
0.8, 1.6, 2.4, 3.2, 4.0 e 4.8 mL, para 6 balões de 20,00 ±
0.04 mL e perfez-se o volume com água destilada.
Pipetou-se, com uma micropipeta, 1,0 mL de solução de
cada balão, assim como também 1,0 mL extrato de enzima
diluído 1:100 e 1,0 mL de extrato não diluído, para o
respetivo tubo de ensaio, preparando-se duplicados para
cada valor de concentração. Pipetou-se ainda, 1,0 mL de
água destilada, que seria o nosso branco. Seguidamente,
adicionou-se 5,0 mL de reagente de Biureto a cada tubo
de ensaio, agitando-se no Vórtex. Após 30 minutos em
repouso, mediu-se as absorvências a 540 nm no
espetrofotómetro e traçou-se a reta de calibração. A
partir desta, calculou-se a concentração de proteína em
mg por mL de extrato (mg/mL) e seguidamente, a
atividade enzimática específica (UI/mg de proteína).
3.5 - Variação da atividade da enzima com a
concentração de substrato (sacarose)
Começou-se por pipetar 0,2; 0,6; 1,0; 1,6; 2,0; 3,6 e 4,0
mL de solução de sacarose 500 mmol/L para uma série de
tubos de ensaio, perfazendo o volume total de 4,0 mL com
tampão acetato, preparando-se duplicados de cada
concentração. No tubo do branco utilizou-se 1,0 mL de
água destilada. Pipetou-se 1,0 mL de cada uma das
soluções anteriores para tubos de ensaios e
termostatizou-se a 25ºC durante 5 minutos. Adicionou-se
a cada tubo, 1,0 mL do extrato de enzima correspondente
3
à diluição previamente selecionada no ensaio 3.2 (1:100).
Agitou-se bem no Vórtex e incubou-se a temperatura
ambiente durante 15.0 minutos. Parou-se a reação por
adição de 2,0 mL de DNS a cada tubo e agitou-se
novamente no Vórtex. Aqueceu-se os tubos num banho
de água em ebulição durante 5.0 minutos, observando-se
o aparecimento de cor laranja/avermelhado nas soluções.
Arrefeceu-se em gelo e diluiu-se até 10,0 mL com água
destilada e agitou-se no Vórtex. Registou-se a absorvência
a 540nm e determinou-se a atividade enzimática expressa
em UI em cada um dos tubos, correspondentes às
diferentes concentrações de substrato (sacarose),
recorrendo à curva de calibração obtida no ensaio 3.3.
Resultados e Discussão
Após a preparação da diluição dos três extratos foi
necessário analisar as suas absorvênvias a 540 nm para se
saber qual era a diluição mais adequada. Esta parte prática
foi realizada apenas na segunda aula, sendo que a
primeira foi realizada com a informação de usar a diluição
1:100 pois seria a mais adequada. Tendo em conta os
valores de absorvência a 540 nm obtidos para as diluições
(Tabela 1), o valor ideal seria aquele compreendido entre
0,2 e 0,8. Analisando os dados veríamos que o adequado
a usar seria o extrato não diluído, isto porque ele próprio
já se encontrava bastante diluído. Assim, todo o trabalho
foi realizado com base na diluição 1:100, e este passo não
influenciou os restantes resultados.
Tabela 1. Valores de absorvência a 540 nm das diluições de extrato
Sabendo a diluição apropriada para a realização das
seguintes etapas, passou-se à determinação da
quantidade de açúcares redutores formados. Após o
aquecimento dos tubos depois de adicionado o reagente
de DNS, foi possível a verificação da intensidade da cor dos
padrões (aparecimento da cor laranja/vermelho), à
medida que a concentração na solução aumentava. Com
os padrões da solução equimolar de glucose/frutose 40,0
mmol/L preparados analisou-se a sua absorvência a 540
nm, e com os dados obtidos (Tabela 2), construiu-se a
curva de calibração da absorvência a 540 nm em função
da concentração da solução de glucose/frutose nos
padrões (Figura 1).
Tabela 2. Valores de absorvência a 540 nm de soluções
equimolares de glucose e frutose a 40,0 mmol/L

Figura 1. Curva de calibração da absorvência a 540 nm em
função da concentração da solução de glucose/frutose nos
padrões.
A equação da reta obtida para o melhor ajuste dos pontos
(y=-0,012x-0,0037) permite o cálculo da concentração das
amostras, desde que os valores de absorvência de cada
uma se encontrem dentro do intervalo de valores da curva
de calibração, aplicando a lei de Beer-Lambert (𝐴 = 𝑐𝑙𝜀),
onde 𝐴 corresponde ao y, 𝑐 ao x e 𝑙𝜀 ao declive. Esta
equação será usada também mais à frente. Ainda neste
passo foi possível calcular através da reta a atividade
enzimática em unidades internacionais (UI), µmol de
produto formado por minuto, para o extrato (Tabela 3),
sabendo que o tempo de reação foi de 15 minutos.
Tabela 3. Atividade enzimática em UI do extrato não diluido 1:1
De seguida foi usado o método do biureto para
determinar a concentração de proteína. Após a adição do
reagente de Biureto nos tubos de ensaio, foi possível
verificar uma intensificação da cor (de azul para violeta) à
medida que a concentração de albumina aumentava,
porque havendo uma concentração maior haveria mais
interações entre o reagente de Biureto e a proteína. Os
resultados de absorvência lidos a 540 nm no
espetrofotómetro estão apresentados na Tabela 4.
4
Tabela 4. Valores de absorvência a 540 nm de soluções padrão
de albumina e de amostra de extrato não diluído (A1) e diluído
de 1:100 (A2).
Com os dados da Tabela 4 fez-se a representação gráfica
da curva padrão onde a absorvência a 540 nm se encontra
em função das concentrações dos padrões de forma
linear, como se verifica na Figura 2. A equação da reta
obtida para o melhor ajuste dos pontos (y=0,0359x-
0,0625) permite o cálculo da concentração das amostras,
desde que os valores de absorvência de cada uma se
encontrem dentro do intervalo de valores da curva de
calibração, aplicando a lei de Beer-Lambert (𝐴 = 𝑐𝑙𝜀), onde
𝐴 corresponde ao y, 𝑐 ao x e 𝑙𝜀 ao declive. Verifica-se que
só se pode calcular a concentração de A1, ou seja, da
amostra com extrato não diluído, pois o valor de
absorvência de A2 (diluição 1:4) encontra-se mesmo no
extremo da reta de calibração, e a linearidade não é tão
certa como quando os valores estão no centro, como é o
caso de A1.
Figura 2. Reta de calibração com padrões de albumina
Os valores obtidos para a concentração de A1 (em 1 mL
de extrato não diluído) estão registados na Tabela 5.
Tabela 5. Valores de concentração de A1 e A2 a partir da reta de
calibração de padrões de albumina
A1 - 1:1 A2 - 1:4
Média da Abs. 540 nm 0,052 0,0105
Em 1 mL extrato 1:1
Concentração de A1 (mg) 2,124
 Tendo os valores de atividade enzimática da proteína em Tabela 9. Valores de concentração de sacarose (cs) em mmol/L
1 mL de extrato não diluído (calculado anteriormente, em cada um dos tubos.
Tabela 3) e a concentração de proteína total também em
1 mL de extrato não diluído (Tabela 5), foi possível calcular
a atividade enzimática específica em UI/mg de proteína
(Tabela 6).

Tabela 6. Atividade enzimática especifica de A1 (UI/mg de

proteína)

Fez-se também a representação gráfica de Lineweaver-

Seguidamente foi analisada a variação da atividade da
Burk (Figura 4), mas usaram-se os valores registados na
enzima com a concentração de substrato. Depois de
Tabela 10.
preparados os tubos de ensaio com a solução de sacarose
de 500 mmol/L e a verificação do aumento da intensidade Tabela 10. Valores de concentração de sacarose (cs) em mmol/L
da cor dos padrões (aparecimento da cor em cada um dos tubos.
laranja/vermelho), à medida que a concentração na
solução aumentava devido ao aquecimento depois de
adicionado o reagente de DNS, mediu-se a absorvência a
540 nm, estando os valores registados na Tabela 7.

Tabela 7. Valores de absorvência a 540 nm de soluções com

sacarose 500 mmol/L

Branco PA PB PC PD PE PF PG
ensaio 1 0,0750 0,0550 0,117 0,181 0,155 0,192 0,188 0,175
Figura 4. Representação gráfica de Lineweaver-Burk
ensaio 2 0,0750 0,0530 0,115 0,180 0,161 0,196 0,177 0,174
média 0,0750 0,0540 0,116 0,181 0,158 0,194 0,183 0,175

Com estes valores de absorvência e com a equação da

reta já obtida anteriormente (y=-0,012x-0,0037), foi
possível calcular a concentração de sacarose em cada
padrão (mmol/L) e seguidamente a atividade enzimática
(UI) do mesmo modo que foi calculado anteriormente, e
foram registados os valores na Tabela 8.

Tabela 8. Valores de concentração de sacarose (cs) em mmol/L

e μmol/L e sua atividade enzimática (v) em UI (μmol/min) no
extrato de diluição 1:100 (a atividade enzimática decorreu
durante 15 min)

A partir dos dados desta representação gráfica

(ordenada na origem e declive) foi possível alcançar o
nosso objetivo, o de calcular os valores de Km e Vmáx,
sendo que os valores obtidos foram de 1,32 UI para Vmáx
e 0, 225 mmol/L para o Km.
De seguida calculou-se a concentração de substrato
(sacarose) presente em cada tudo, registando-se os Conclusões
resultados na Tabela 9, com o objetivo de fazer a
Com este trabalho foi possível fazer o estudo cinético da
representação gráfica de Michaelis-Menten (Figura 3, dos
catálise da invertase. Cdeterminou-se os valores de Km e
anexos).
Vmáx, como se desejava. O valor de Vmáx está adequado,
no entanto o km está relativamente baixo em comparação

5
com outros valores que constam na literatura. Estes
resultados também foram afetados devido a alguns erros
durante a realização do trabalho prático, sobretudo na
preparação de padrões, pois nalguns casos houve falta de
precisão a perfazer os balões volumétricos, sendo que
depois afetou todos os resultados, o que explica o facto da
falta de lineridade nos gráficos (Figura 2 e 4).
Por fim, podemos constatar que dos dois métodos
usados para fazer o estudo cinético da invertase,
Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk, o método de
Lineweaver-Burk é o mais eficiente, pois existe uma
representação gráfica linear, que permite uma melhor
análise dos resultados, conseguindo-se calculá-los através
da ordenada na origem e do declive. Já a representação
gráfica de Michaelis-Menten é polinomial, não permitindo
a determinação exata dos valores de Km e Vmáx.

____________________
1 Nelson, D.L. and Cox, M.M., Lehninger Principles of
Biochemistry, 6th edition, cap 6, pp 191-193, pp 200-209
2 Laboratório B1-MIA, Módulo B1-Bioquímica, Guia de

trabalhos práticos, Ano letivo de 2017-18

http://www2.fcfar.unesp.br/Home/Pos-
graduacao/AlimentoseNutricao/AndreaFranciscoME.pdf
Acessado em 27 de Maio de 2018
https://www.researchgate.net/figure/Lineweaver-Burk-plot-
for-Saccharomyces-cerevisiae-MK_fig6_261030665
Acessado em 27 de Maio de 2018
https://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima#Atividade_enzim%C3%A1
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Acessado em 27 de Maio de 2018
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002364381
6307046
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