1
Metode
VEDERE GENERALĂ ASUPRA METODELOR
FOLOSITE ÎN HISTOLOGIE / 1
PREPARAREA ȚESUTURILOR / 2
Colorația hemalaun-eozină cu fixare prin
formol / 2
Alți fixatori / 2
Alte procedee de colorare / 3
HISTOCHIMIE ȘI CITOCHIMIE / 3
Compoziția chimică a probelor
histologice / 3
Baza chimică a colorațiilor / 5
Digestia enzimatică / 6
Histochimia enzimelor / 7
Imunocitochimie / 7
Tehnici de hibridizare / 10
Autoradiografie / 10
VEDERE GENERALĂ ASUPRA
METODELOR FOLOSITE ÎN HISTOLOGIE
Obiectivul unui curs de histologie este acela de a ghida stu-
denții în înțelegerea micro-anatomiei celulelor, țesuturilor și
organelor, ca și de a corela structura acestora cu funcțiile.
Histologia [din greacă, ιστος, histos = țesut; λογια, loghia =
cuvânt sau vorbire despre, prin extensie știință], numită și ana-
tomie microscopică, reprezintă studiul științific al structuri-
lor microscopice din țesuturi și organe. Histologia modernă nu
este doar o știință descriptivă, ci include și multe aspecte de bi-
ologie celulară și moleculară, care ajută descrierea organizării și
funcționării la nivel celular. Metodele folosite de histologi sunt
de o diversitate extremă. Multe aspecte de conținut din cur-
surile de histologie pot fi construite în contextul microscopiei
optice. În zilele noastre, studenții din laboratoarele de histolo-
gie folosesc fie microscopul optic, fie, cu frecvență crescută,
microscopia virtuală, care reprezintă o metodă de a vizua-
liza, pe un monitor al unui computer sau pe dispozitive mobile,
probe microscopice digitalizate. În trecut, interpretări mult mai
detaliate de micro-anatomie au fost făcute cu microscopul
electronic (electron microscope, EM) – atât microscop
electronic de transmisie (transmission electron mi-
MICROSCOPIE / 11
Microscopie optică / 11
Examinarea unui preparat histologic pe lamă cu
microscopul optic / 12
Alte sisteme optice / 13
Microscopie electronică / 18
Microscopie de forță atomică / 19
Microscopie virtuală / 20
Planșa 1.1 Corelații clinice: criosecțiuni / 4
Planșa 1.2 Considerații funcționale:
microspectrofotometrie Feulgen / 7
Planșa 1.3 Corelații clinice: anticorpii monoclonali în
medicină / 9
Planșa 1.4 Corelații funcționale: utilizarea
corespunzătoare a microscopului optic / 15
HISTOLOGIE 101 / 22
croscope, TEM), cât și microscop electronic de baleiaj
(scanning electron microscope, SEM). Astăzi, și mi-
croscopul de forță atomică (atomic force microscope,
AFM) poate să furnizeze imagini care sunt comparabile sau
chiar de rezoluție mai ridicată cu acelea obținute prin TEM.
Atât EM cât și AFM, datorită rezoluțiilor lor mai ridicate și
măririlor utile, reprezintă adesea etape finale în achiziția de date
rezultate din multe tehnici alternative ale biologiei celulare și
moleculare. Aceste tehnici alternative includ:
• histochimia și citochimia,
• imunocitochimia și tehnicile de hibridizare,
• autoradiografia,
• cultura de țesuturi și organe,
• separarea de celule și organite prin centrifugare diferențială și
• tehnicile microscopice și microscoapele specializate.
Studentul se poate simți pe lângă asemenea tehnici și proce-
duri experimentale deoarece lucrul direct cu ele nu este abordabil
prin programele de studiu actuale. Oricum, este important să se
cunoască câte ceva despre procedurile specializate și despre datele
pe care acestea le pun la dispoziție. Acest capitol își propune o ve-
dere generală asupra metodelor și oferă explicații despre cum datele
obținute prin ele pot ajuta studentul să dobândească o înțelegere mai
bună a funcționării celulelor, țesuturilor și organelor.
1
 O problemă cu care se întâlnesc studenții la histologie este
aceea a înțelegerii naturii bidimensionale a unei imagini his-
2 tologice de pe o lamă sau a unei imagini de EM și cum imagi-
nea se corelează cu structura tridimensională din care provine.
Pentru a face legătura peste această prăpastie conceptuală, tre-
PREPAR ARE A Ț E SU TURILOR
buie mai întâi să prezentăm o scurtă descriere a metodelor
prin care se obțin lamele pentru microscopie optică și probele
pentru EM.
PR EPAR AR E A Ț E SU TUR I LOR
Colorația hemalaun-eozină cu fixare prin formol
Cel mai adesea sunt studiate secțiunile preparate în mod
obișnuit prin colorația hemalaun-eozină.
Setul de lame date fiecărui student pentru a le examina cu
microscopul optic constă cel mai adesea în probe fixate în for-
maldehidă, incluse în parafină, colorate cu hemalaun-eozină
Metode
(H&E). Aproape toate imaginile de microscopie optică din
secțiunea Atlas a acestei cărți sunt de pe lame din seturile pen-
tru studenți. De asemenea, cele mai multe dintre imaginile
folosite, pentru a ilustra țesuturile și organele, în prezentările
de histologie, sunt preluate din asemenea lame. Uneori, sunt
folosite alte tehnici de colorare pentru a prezenta componente
CAPITOLUL 1
celulare și tisulare specifice; câteva dintre aceste metode sunt
discutate mai jos.
Primul pas în prepararea unei probe de țesut sau organ
este fixarea pentru conservarea structurii.
Fixarea, de regulă printr-un amestec de compuși chimici, per-
mite conservarea permanentă a structurii țesutului în vederea
tratamentelor care urmează. Probele trebuie imersate în fixator
imediat ce au fost extrase din organism. Fixarea folosește la:
• oprirea metabolismului celular,
• prevenirea degradării enzimatice a celulelor și țesuturilor
prin autoliză (auto-digerare),
• omorârea microorganismelor patogene cum ar fi bacteri-
ile, fungii sau virusurile și
• rigidizarea țesutului fie ca rezultat al legăturilor chimice în-
crucișate în proteine, fie denaturării moleculelor acestora.
Formolul, o soluție de 37% formaldehidă în apă, la diluții
variate și în combinație cu alte substanțe chimice și soluții
tampon, este fixatorul folosit cel mai adesea. Formaldehida
conservă structura generală a celulelor și componentelor ex-
tracelulare prin reacția cu grupările amino ale proteinelor
(cel mai adesea legarea încrucișată a reziduurilor de lizină).
Deoarece formaldehida nu le afectează semnificativ structura
tridimensională, proteinele își mențin capacitatea de a inter-
acționa cu anticorpii specifici. Această proprietate este impor-
tantă în metodele de marcare imunocitochimică (vezi pagina
7). Soluția comercială standard de formaldehidă tamponată
cu fosfați (pH 7) acționează relativ lent, dar penetrează bine
țesutul. Totuși, din cauza faptului că ea nu reacționează cu
lipidele, este un slab fixator al membranelor celulare.
În pasul al doilea, proba este pregătită pentru includere în
parafină ca să permită secționarea.
Pregătirea probei pentru examinare necesită impregnarea ei cu
un mediu de includere care îi permite să fie tăiată în secțiuni
subțiri, de regulă în domeniul de la 5 la 15 µm (1 micrometru
T A B E LU L 1.1 Unități de lungime folosite frecvent
1 picometru 5 0,01 ångströmi (Å)
1 ångström 0,1 nanometri (nm)
5
10 ångströmi 5 1,0 nanometru
1 nanometru 5 1.000 picometri (pm)
1.000 nanometri 5 1,0 micrometru (mm)
1.000 micrometri 5 1,0 milimetru (mm)
[µm] este egal cu 1/1.000 dintr-un milimetru [mm]; vezi Ta-
belul 1.1). Proba este spălată după fixare și deshidratată -o
serie de soluții de alcool cu concentrații crescătoare de până la
100%, pentru eliminarea apei. În pasul următor, clarificarea,
sunt folosiți solvenți organici, de tipul xilenului sau toluenului,
miscibili atât cu alcoolul, cât și cu parafina, pentru a se eli-
mina alcoolul înainte de impregnarea cu parafină topită.
Când parafina se răcește și se întărește, ansamblul cu piesa
inclusă este prelucrat pentru obținerea unui bloc cu dimensi-
uni corespunzătoare. Blocul este apoi montat într-un aparat
special construit pentru secționare – un microtom – și tăiat
cu un cuțit de oțel. Secțiunile rezultate sunt apoi montate pe
lame de sticlă, folosindu-se ca adeziv un mediu de montare
(balsam de Canada, rășini pinenice sau acrilice).
În pasul al treilea, proba este colorată pentru a se permite
examinarea.
Deoarece secțiunile de parafină sunt incolore, proba nu este
încă adecvată pentru examinare la microscopul optic. Pentru a
colora secțiunile de țesut, parafina trebuie să fie eliminată prin
dizolvare, din nou cu xilen sau toluen, iar proba de pe lamă
trebuie apoi rehidratată prin trecere succesivă printr-o serie de
soluții cu concentrații descendente de alcool. Țesutul de pe
lamă este apoi colorat cu hemalaun dizolvat în apă. Deoarece
contra-colorantul, eozina, este mai solubil în alcool decât în
apă, proba este iarăși deshidratată printr-o serie de soluții de
alcool cu concentrații crescătoare și colorată cu eozină dizol-
vată în alcool. Figura 1.1 prezintă rezultatele colorării doar cu
hemalaun, doar cu eozină, respectiv cu hemalaun și contra-co-
lorare cu eozină. După colorare, proba este trecută prin xilen
sau toluen, apoi montată prin folosirea unui mediu ne-apos și
acoperire cu o lamelă, pentru a obține un preparat permanent.
Alți fixatori
Formolul nu conservă toate componentele celulare și tisulare.
Deși probele colorate cu H&E și fixate în formol sunt uzual
folosite, deoarece dezvăluie corespunzător caracteristicile
structurale generale, ele nu pot elucida compoziția chimică
specifică a componentelor celulare. De asemenea, multe com-
ponente sunt pierdute în timpul preparării probelor. Pentru
a menține astfel de componente și structuri, trebuie folosite
alte metode de fixare. Aceste metode sunt, în general, bazate
pe o înțelegere clară a aspectelor chimice implicate. De exem-
plu, folosirea alcoolilor și solvenților organici în preparatele
standard elimină lipidele neutre.
Pentru a reține lipidele neutre, cum ar fi cele din celulele
adipoase, trebuie să se folosească criosecțiuni ale probelor de
 3

CAPITOLUL 1
Metode
a b c
FIGURA 1.1 ▲ Colorația hemalaun-eozină (H&E). Această serie de eșantioane din pancreas sunt secţiuni seriale (adiacente) care demonstrează
efectul folosirii doar a hemalaunului, respectiv eozinei, sau a hemalaunului și eozinei folosite combinat. a. Imaginea evidenţiază colorarea doar cu
hemalaun. Deși există o colorare generală, peste tot a probei, acele componente și structuri care au afinitate mare pentru colorant sunt mai puternic

H IS TO CHIMIE ȘI CITO CHIMIE

colorate – de exemplu, ADN-ul nuclear și zonele din celulă care conţin ARN citoplasmatic. b. În această imagine, eozina, contra-colorantul, în mod
asemănător are un efect de colorare peste tot când este utilizată singură. A se nota, totuși, că nucleii sunt mai puţin evidenţiaţi decât în probele color-
ate numai cu hemalaun. După ce proba este colorată cu hemalaun și apoi pregătită pentru colorare cu eozină în soluţie alcoolică, hemalaunul care nu
est strâns legat este eliminat, iar eozina colorează astfel acele componente pentru care are afinitate ridicată. c. Imaginea evidenţiază efectul colorării
combinate H&E. 3480.

țesut fixate în formol și coloranți care se dizolvă în grăsimi;
pentru a prezerva structurile membranare, sunt folosiți fixa-
tori speciali, cum ar fi permanganatul și osmiul, conținând
metale grele care se leagă de fosfolipide (Planșa 1.1). Folosirea
de obicei a tetraoxidului de osmiu ca fixator pentru micro-
scopia electronică este motivul principal al conservării exce-
lente a membranelor în imaginile de microscopie electronică.
Alte procedee de colorare
Hemalaunul și eozina sunt utilizate în histologie în princi-
pal pentru a evidenția aspecte structurale.
În ciuda avantajelor colorației H&E, procedeul nu este adecvat
revelării unor anumite componente ale secțiunilor histologice
cum ar fi componenta elastică, fibrele reticulare, membranele
bazale și lipidele. Când se dorește să se evidențieze aceste com-
ponente, se pot folosi alte proceduri de colorare, cele mai multe
dintre acestea fiind selective. Aceste proceduri includ folosirea
orceinei ori rezorcin-fucsinei pentru componenta elastică, sau
impregnarea argentică pentru fibrele reticulare sau materialul
membranelor bazale. Deși fundamentele chimice ale multora
dintre metodele de colorare nu sunt întotdeauna cunoscute, ele
operează. Cunoașterea componentelor pe care le evidențiază o
procedură este mai importantă decât cunoașterea exactă a mo-
dului în care procedeul operează.
H ISTO CHI M I E ȘI CI TO CHI M I E
Proceduri chimice specifice pot furniza informații despre
cum funcționează celulele și componentele extracelulare
ale țesuturilor.
Procedurile de histochimie și citochimie se pot baza pe lega-
rea specifică a unui colorant, prin folosirea unui anticorp
marcat cu un colorant fluorescent, ridicat împotriva unui
anume component celular, sau a unei activități enzimatice
intrinseci a unui component celular. În plus, multe molecule
mari din celule pot fi localizate prin autoradiografie, atunci când
precursori marcați radioactiv sunt încorporați în asemenea mole-
cule din celule sau țesuturi, înainte de fixare. Multe dintre aceste
proceduri se pot folosi atât în preparate pentru microscopie op-
tică, cât și în cele pentru microscopie electronică.
Înainte de a discuta chimia colorării standard și metode de
histochimie și citochimie, este util să ne referim pe scurt la na-
tura unei secțiuni dintr-o probă fixată și incluzionată standard.
Compoziția chimică a probelor histologice
Compoziția chimică a unui țesut pregătit pentru colorare
standard diferă de cea a țesutului viu.
Componentele care rămân după fixare constau în principal din
molecule mari, care nu se dizolvă ușor, mai ales după trata-
mentul cu fixatori. Aceste molecule mari, în special acelea care
interacționează cu alte molecule mari pentru a forma complexe
macromoleculare, sunt de regulă păstrate în secțiunea de țesut.
Exemple de asemenea complexe macromoleculare mari includ:
• nucleoproteine formate din acizi nucleici complexați cu
proteine,
• proteine intracelulare ale citoscheletului comple-
xate cu proteine asociate,
• proteine extracelulare din agregate mari, insolubile, le-
gate încrucișat la molecule asemănătoare învecinate, ca în
formarea fibrelor de colagen și
• complexe membranare fosfolipide-proteine (sau car-
bohidrați din glicolipide și glicoproteine).
Aceste molecule formează structurile celulare și tisulare –
adică ele construiesc elementele ce organizează țesuturile. Ele
sunt baza organizării a ceea ce se vede cu microscopul într-un
țesut.
 4 PLANŞA 1.1 Corelații clinice: criosecțiuni
Uneori, anatomopatologilor li se poate cere să evalueze
H ISTO CH IM IE ȘI CITO CH IM IE
instantaneu țesuturi obținute în timpul intervențiilor chirur-
gicale, mai ales atunci când diagnosticul anatomopatologic
imediat poate influența cum să se desfășoare procedeul
chirurgical. Există o serie de indicații de a se realiza ase-
menea evaluări, cunoscute în mod obișnuit drept secțiuni
înghețate (criosecțiuni). Cel mai adesea, un chirurg din sala
de operație solicită o criosecțiune atunci când nu există un
diagnostic pre-operatoriu sau când se pot identifica aspecte
intra-operatorii neașteptate. În plus, chirurgul poate dori să
știe dacă a fost eliminată toată porțiunea patologică, până la
limita țesutului sănătos și dacă marginea rezecției chirurgi-
cale este lipsită de țesut bolnav. Criosecțiunile sunt efectuate
și în combinație cu alte proceduri cum ar fi endoscopii sau
biopsii, pentru a confirma dacă materialul biopsic va fi folosit
în examinări anatomopatologice ulterioare.
Metode
Prepararea criosecțiunilor presupune trei pași principali:
• Înghețarea eșantionului de țesut. Probe mici de
țesut sunt înghețate fie prin folosirea dioxidului de carbon
comprimat, fie prin imersarea într-un lichid rece (izo-
pentan) la o temperatură de –50°C. Înghețarea se poate
CAPITOLUL 1
a b
În multe cazuri, un element structural este și o unitate
funcțională. De exemplu, în cazul proteinelor care formează
elementele contractile din celulele musculare, filamentele
sunt componentele structurale vizibile și participanții efectivi
din procesul contractil. ARN-ul din citoplasmă se observă ca
parte a unei componente structurale (ex. ergastoplasma celu-
lelor secretoare, corpii Nissl din neuroni) și reprezintă partici-
pantul efectiv în sinteza proteică.
Multe componente tisulare se pierd în timpul preparării
standard a secțiunilor pentru colorația H&E.
În ciuda faptului că acizii nucleici, proteinele și fosfolipidele
sunt în cea mai mare parte reținute în secțiunile tisulare, se
realiza într-un congelator special de mare eficacitate.
Înghețarea solidifică țesutul și permite secționarea cu un
microtom.
• Secționarea țesutului înghețat. Secționarea se rea-
lizează de obicei în interiorul unui criostat, un comparti-
ment răcit prevăzut cu un microtom (criotom). Deoarece
țesutul este un material solid înghețat, el poate fi tăiat în
secțiuni extrem de fine (5-10 µm). Secțiunile sunt apoi
montate pe o lamă de sticlă.
• Colorarea secțiunilor obținute. Colorarea este rea-
lizată pentru a diferenția nucleii de restul țesutului Cele
mai utilizate colorații pentru secțiunile la gheață sunt
H&E, albastru de metilen (Fig. P1.1.1) și PAS.
Întregul proces de pregătire și examinare a criosecțiunilor
poate necesita doar 10 minute până la finalizare. Timpul total
de obținere a rezultatelor depinde mult de durata necesară
transportului țesutului din sala de operație în laboratorul de
anatomie patologică, de tehnica de anatomopatologie folo-
sită și de experiența patologului. Rezultatele sunt apoi comu-
nicate direct chirurgului care le așteaptă în sala de operație.
FIGURA F1.1.1 ▲ Evaluarea prin
tehnica de criosecționare a unei
probe obținute în timpul unei
proceduri chirurgicale. a. Imaginea
prezintă o probă de intestin gros care a
fost pregătită prin tehnica criosecţiunilor
și colorată cu albastru de metilen. 3160.
b. O parte din probă a fost fixată cu formol
și pregătită prin coloraţie H&E standard.
Examinarea secţiunii îngheţate dovedește
că este normală. Acest diagnostic a fost
mai târziu confirmat prin examinarea pro-
bei standard pregătite pentru H&E. 3180.
(Prin amabilitatea Dr. Daniel W. Visscher.)
și pierd multe. Proteinele și acizii nucleici mici, cum ar fi
ARN-ul de transfer, se pierd, în general, în timpul pregătirii
țesutului. Așa cum a fost descris anterior, lipidele neutre se
dizolvă în mod obișnuit în solvenții organici folosiți în pregă-
tire probelor. Alte molecule mari pot fi de asemenea pierdute,
fiind, de exemplu, hidrolizate din cauza unui pH nefavorabil
al soluțiilor de fixare. Exemple de molecule mari pierdute în
timpul fixării standard cu fixatori apoși sunt:
• glicogenul (un polizaharid de depozitare a carbohidrați-
lor, obișnuit în ficat și mușchi) și
• proteoglicanii și glicozaminoglicanii (complexe gluci-
dice întâlnite în țesutul conjunctiv).
 Aceste molecule se pot păstra, totuși, prin folosirea unor
fixatori ne-apoși pentru glicogen sau prin adăugarea în solu-
țiile de fixare a unor agenți specifici de legare care să rețină
moleculele extracelulare ce conțin carbohidrați.
Componentele solubile, ionii și moleculele mici sunt, de ase-
menea, pierdute în timpul pregătirii secțiunilor la parafină.
Metaboliții intermediari, glucoza, ionii de sodiu sau clor și
alte substanțe asemănătoare se pierd în timpul pregătirii stan-
dard a secțiunilor la parafină, colorate cu H&E. Multe dintre
aceste substanțe pot fi studiate în preparate aparte, uneori cu
pierderi semnificative ale integrității structurale. Astfel de ioni
și molecule mici, cu solubilitate mare nu alcătuiesc elementele
organizate ale țesuturilor; participă în procese de sinteză sau la
procese celulare. Atunci când se pot prezerva și evidenția prin
metode specifice, pot furniza informații neprețuite asupra
metabolismului celular, transportului activ sau asupra altor
procese celulare, vitale. Apa, o moleculă deosebit de versatilă,
ia parte la aceste reacții și procese, contribuind la stabilizarea
organizărilor moleculare prin legături de hidrogen.
Fundamentele chimice ale colorării
Coloranți acizi și coloranți bazici
Hemalaunul și eozina (H&E) sunt coloranții cei mai utilizați
în histologie.
Un colorant acid, cum ar fi eozina, poartă o sarcină nega-
tivă netă în partea sa colorată și se descrie prin formula gene-
rală [Na1colorant2].
Un colorant bazic poartă o sarcină pozitivă netă în porțiu-
nea colorată și se descrie prin formula generală [colorant1Cl2].
Hematoxilina nu corespunde definiției unui real colorant
bazic, dar capătă proprietăți care seamănă celor ale unui colo-
rant bazic după maturare (oxidare la hemateină) și complexare cu
alaun de aluminiu și potasiu, conducând la hemalaun, compus
albastru-închis spre violet. Culoarea unui colorant nu este legată
de faptul că este bazic sau acid, cum se poate observa din exem-
plele de coloranți bazici sau acizi prezentate în Tabelul 1.2.
Coloranții bazici interacționează cu componentele anionice
din celule și țesuturi (componente care poartă o sarcină netă
negativă).
T A BELUL 1.2 Unii coloranți acizi și bazici
Colorant Culoare
Coloranți bazici
Verde metil Verde
Albastru de metilen Albastru
Pironină G Roșu
Albastru de toluidină Albastru
Coloranți acizi
Fucsină acidă Roșu
Albastru de anilină Albastru
Eozină Roșu
Oranj G Portocaliu
Componentele anionice includ grupările fosfat ale acizilor
nucleici, grupările sulfat ale glicozaminoglicanilor și grupă-
rile carboxil din proteine. Capacitatea unor asemenea grupări 5
anionice de a interacționa cu coloranții bazici este denumită
bazofilie [Gr., dragoste pentru baze].
CAPITOLUL 1
Interacțiunea cu grupările anionice variază în funcție de
pH. Astfel:
• La pH ridicat (în jur de 10), toate grupările sunt ionizate
și disponibile pentru interacțiune electrostatică cu colo-
rantul bazic.
• La pH ușor acid spre neutru (5‒7), grupările sulfat și fosfat
sunt ionizate și disponibile de interacțiune electrostatică
Metode
cu colorantul bazic.
• La pH coborât (sub 4), doar grupările sulfat rămân ionizate
și interacționează cu colorantul bazic.
Astfel, colorarea cu coloranți bazici la un anumit pH se poate
folosi pentru a evidenția grupările anionice; deoarece anumite
grupări anionice se află predominant pe anumite macromole-
H IS TO CHIMIE ȘI CITO CHIMIE
cule, colorarea folosește ca o ghidare pentru aceste macromo-
lecule.
Așa cum s-a specificat, hematoxilina nu este, la drept vor-
bind, un colorant bazic. Ea este folosită cu un mordant (un
intermediar de legare între componenta tisulară și colorant).
Mordantul determină colorantul să semene cu un compus
bazic. Legătura în complexul țesut-mordant-hematoxilină
nu este una electrostatică simplă; când secțiunea este în mediu
apos, hematoxilina nu se disociază de țesut. Hematoxilina însăși
adoptă acele secvențe de colorare care o fac să fie urmărită de
coloranți acizi în soluții apoase. Adevărații coloranți bazici, spre
deosebire de hematoxilină, nu sunt, de regulă, folosiți în secvențe
de colorare în care colorantul bazic este urmat de un colorant
acid. În asemenea situații, colorantul bazic ar tinde să se disoci-
eze de componenta tisulară în timpul spălărilor în medii apoase,
dintre cele două soluții de coloranți.
Coloranții acizi interacționează cu grupările cationice din
celule și țesuturi, în special cu grupările amino ionizate ale
proteinelor.
Interacțiunea grupărilor cationice cu coloranții acizi se
numește acidofilie [Gr., dragoste pentru acizi]. Interacțiunile
componentelor celulare și tisulare cu coloranți acizi nu sunt
nici foarte specifice, nici foarte exacte așa cum sunt interacți-
unile coloranților bazici.
Deși legăturile electrostatice sunt factorul principal al legă-
turii primare a unui colorant acid cu țesutul, nu sunt singu-
rele; din această cauză, coloranții acizi sunt uneori folosiți în
combinații pentru a se colora selectiv constituenți tisulari. De
exemplu, sunt folosiți trei coloranți acizi în tehnica de co-
lorare Mallory: albastru de anilină, fucsină acidă și oraj G.
Acești coloranți colorează selectiv colagenul, în mod obișnuit
citoplasma și, respectiv, celulele roșii din sânge. Fucsina acidă
colorează și nucleii.
În alte tehnici de colorare multiplă, hematoxilina este fo-
losită pentru evidențierea în principal a nucleilor, iar apoi
coloranții acizi sunt utilizați pentru colorarea citoplasmei și,
selectiv, a fibrelor extracelulare. Colorarea selectivă a compo-
nentelor tisulare prin coloranți acizi este atribuită unor factori
variați cum ar fi dimensiunea și gradul de agregare a molecu-
 lelor de colorant sau permeabilitatea și „compactitatea” țesu-
tului.
6 Coloranții bazici pot, la rândul lor, să fie utilizați în com-
binații sau secvențial (ex. verdele metil și pironina pentru
studiul sintezei proteice și secreției), dar aceste combinări nu
H ISTO CH IM IE ȘI CITO CH IM IE
sunt larg utilizate ca cele ale coloranților acizi.
Un număr limitat de substanțe din celule și din matricea ex-
tracelulară prezintă bazofilie.
Aceste substanțe includ:
• heterocromatina și nucleolii din nucleu (în principal
datorită grupărilor fosfat ionizate din acizii nucleici ai am-
belor componente),
• componente citoplasmatice ca ergastoplasma (tot da-
torită grupărilor fosfat ionizate din ARN-ul ribozomal) și
• materiale extracelulare cum ar fi carbohidrați com-
plecși ai matricei cartilaginoase (datorită grupărilor sulfat
ionizate).
Metode
Colorarea cu coloranți acizi este mai puțin specifică, dar mai
multe substanțe din celule și matricea extracelulară prezintă
acidofilie.
Aceste substanțe includ:
• cele mai multe filamente citoplasmatice, în special cele
CAPITOLUL 1
din celulele musculare,
• cele mai multe componente intracelulare membra-
nare și mare parte din citoplasma altfel nespecializată și
• cele mai multe fibre extracelulare (în principal datorită
grupărilor amino ionizate).
Metacromazia
Anumiți coloranți bazici interacționează cu componente ti-
sulare care le schimbă culoarea normală de la albastru către
roșu sau violet; această schimbare a absorbanței este nu-
mită metacromazie.
Mecanismul care stă la baza metacromaziei este indus de
prezența de poli-anioni în țesut. Când aceste țesuturi sunt
colorate cu o soluție concentrată de colorant bazic, cum ar fi
albastru de toluidină, moleculele de colorant sunt suficient
de apropiate pentru a forma agregate dimerice sau polimerice.
Proprietățile de absorbție ale acestor agregate diferă de cele ale
moleculelor de colorant individuale, neagregate.
Structurile celulare și tisulare care conțin concentrații mari
de grupări sulfat sau fosfat ionizate – cum ar fi substanța funda-
mentală din cartilaj, granulele ce conțin heparină din mastocite
sau reticulul endoplasmatic din plasmocite – prezintă metacro-
mazie. Astfel, albastrul de toluidină va apărea violet către roșu
când este folosit la colorarea unor asemenea componente.
Grupele aldehidice și reactivul Schiff
Capacitatea fucsinei bazice decolorate (reactiv Schiff ) de a
interacționa cu grupări aldehidice conduce la o culoare roșie
distinctă și stă la baza reacțiilor acid periodic-Schiff sau celor
Feulgen.
Reacția acid periodic-Schiff (PAS) colorează carbohidrații
și macromoleculele bogate în carbohidrați. Este folosită pentru
a dovedi prezența glicogenului în celule, a mucusului în diverse
celule și țesuturi, a membranei bazale localizată la baza epiteli-
ilor și a fibrelor reticulare din țesuturile conjunctive. Reactivul
T
C T
T BC
T
T
BC
T
C T
FIGURA 1.2 ▲ Fotografie de microscopie optică reprezentând
țesut renal colorat cu metoda PAS. Această metodă histochimică
evidenţiază și localizează carbohidraţi și molecule bogate în carbohidraţi.
Membranele bazale sunt PAS-pozitive, așa cum se vede prin culoarea ma-
genta a locurilor unde se află. Tubulii renali (T) sunt clar delimitaţi de culoarea
membranei bazale care îi înconjoară. Capilarele glomerulare (C) și epiteliul
capsulei Bowman (CB) prezintă și ele membrane bazale PAS-pozitive. Proba
a fost contra-colorată cu hemalaun pentru evidenţierea nucleilor. 3320.
Schiff este folosit și în colorația Feulgen, care se bazează pe
o hidroliză blândă cu acid clorhidric pentru a colora ADN-ul.
Reacția PAS se bazează pe următoarele aspecte:
• Ciclurile hexozice ale glucidelor conțin atomi laterali de
carbon, care poartă fiecare o grupare hidroxil (2OH).
• Hexozaminele glicozaminoglicanilor conțin atomi de car-
bon laterali, dintre care unul poartă o grupare 2OH, în
timp ce un altul poartă o grupare amino (2NH2).
• Acidul periodic taie între acești doi atomi de carbon adia-
cenți formând grupări aldehidice.
• Aceste grupări aldehidice reacționează cu reactivul Schiff
pentru a da o culoare magenta aparte.
Colorația PAS pentru membrana bazală (Fig. 1.2) și pentru
fibre reticulare se bazează pe conținutul sau asocierea cu pro-
teoglicani (polizaharide complexe asociate unui miez proteic).
Colorația PAS este o alternativă a metodelor de impregnare
argentică, acestea fiind, la rândul lor, bazate pe interacțiunea
cu moleculele de glucide din proteoglicani.
Reacția Feulgen se bazează pe clivarea bazelor purinice de
deoxiriboză în ADN, ca urmare a unei hidrolize blânde; apoi,
ciclul zaharic se deschide cu formarea unei grupări aldehidice.
Din nou, gruparea aldehidică nou formată reacționează cu
reactivul Schiff pentru a da o culoare magenta distinctă. Reac-
ția reactivului Schiff cu ADN-ul este una stoichiometrică,
ceea ce înseamnă că produsul acestei reacții se poate măsura și
este proporțional cu cantitatea de ADN. De aceea, ea poate fi
folosită în metode spectrofotometrice de cuantificare a canti-
tății de ADN din nucleul unei celule. ARN-ul nu se colorează
cu reactivul Schiff deoarece îi lipsește deoxiriboza.
Digestia enzimatică
Digestia enzimatică a unei secțiuni comparată cu una co-
lorată specific pentru o anumită componentă – cum ar fi
glicogen, ADN sau ARN – poate fi folosită ca o confirmare a
identității materialului colorat.
Materialul intracelular care se colorează cu reacția PAS poate
fi identificat ca fiind glicogen prin pre-tratarea secțiunilor cu
 PLANŞA 1.2 Considerații funcționale: microspectrofotometrie Feulgen
Microspectrofotometria Feulgen este o tehnică conce-
pută pentru studiul creșterilor de ADN în celulele în dezvoltare
și pentru analiza poliploidiei – adică, de câte ori se multiplică
conținutul normal de ADN într-o celulă (o celulă normală care
nu se divide se spune că este diploidă; un spermatozoid sau
un ovocit sunt haploide). Pentru cuantificarea cantității de
ADN nuclear, se folosesc două tehnici: citometrie statică,
pentru secțiunile tisulare și citometria în flux, pentru celule
izolate. Tehnica citometriei statice pentru secțiunile din tumori,
colorate cu Feulgen, folosește microspectrofotometria cuplată
cu sisteme de digitalizare a imaginilor pentru a măsura, la
lungimea de undă de 560-nm, absorbanța luminii emise de
celule sau de aglomerări de celule. Prin comparație, tehnica
citometriei în flux folosește echipamente capabile să baleieze
celule singulare care trec prin fața unui senzor, într-un mediu
lichid. Această tehnică furnizează o analiză cantitativă, rapidă
a unei singure celule pe baza măsurării emisiei de lumină fluo-
diastază sau amilază. Eliminarea colorării după aceste trata-
mente reprezintă o confirmare a faptului că materialul colorat
a fost glicogen.
În mod asemănător, pre-tratarea secțiunilor tisulare cu
deoxiribonuclează (ADN-ază) va elimina colorarea prin Feul-
gen, iar tratamentul secțiunilor de epitelii secretorii cu ribo-
nuclează (ARN-ază) va înlătura colorarea ergastoplasmei cu
coloranți bazici.
Enzimohistochimie
Metodele histochimice sunt folosite și pentru identificarea,
respectiv localizarea enzimelor din celule și țesuturi.
Pentru a localiza enzimele în secțiuni tisulare, trebuie să acor-
dăm o atenție deosebită păstrării activităților enzimatice. În
mod obișnuit, fixarea blândă cu aldehide este modalitatea
preferată. Prin aceste proceduri, se vizualizează mai degrabă
produsul de reacție al activității enzimatice, decât activitatea en-
zimatică însăși. În general, se folosește un agent de captură,
fie un colorant, fie un metal greu, pentru a fixa sau lega prin
precipitare produsul reacției enzimatice în locul unde reacția se
desfășoară. Obișnuit, pentru a se evidenția reacția unei enzime
hidrolitice, secțiunea tisulară este cufundată într-o soluție care
conține un substrat (AB) și un agent de captare (C) care pre-
cipită unul din produșii reacției enzimatice, conform reacției:
enzima
AB 1 T AT 1 B
unde AC este produsul final de captură, iar B este parte a
substratului hidrolizat.
Prin folosirea unor asemenea metode, lizozomul, identi-
ficat mai întâi prin studii de centrifugare diferențială a unor
omogenate celulare, a fost echivalat cu un compartiment va-
cuolar observat în imaginile de microscopie electronică. În
țesuturile fixate blând, hidrolazele acide și esterazele din lizo-
zom reacționează cu substrate corespunzătoare. Amestecul de
reacție conține și ioni de plumb, care precipită (ex. ca fosfat
de plumb rezultat din acțiunea fosfatazei acide). Produsul de
reacție precipitat poate fi apoi observat fie prin microscopie
7
rescentă. În momentul de față, microspetrofotometria Feulgen
CAPITOLUL 1
este folosită pentru studiul schimbărilor în conținutul de ADN
din celulele în diviziune care suferă diferențiere. Tehnica este
folosită și pentru a analiza în clinică numărul de cromozomi
anormali (tiparul de poliploidie) în celulele maligne. Unele ce-
lule maligne care au un tipar poliploid amplu se spune că sunt
bine diferențiate; tumorile cu asemenea tipuri celulare au un
prognostic mai bun decât tumorile cu aneuploidie (aneuploi-
die (multiplicare incompletă a cantității haploide de ADN) sau
celulele tetraploide. Microspectrofotometria Feulgen a fost
Metode
folosită în mod deosebit în studii ale unor adenocarcinoame
(cancere epiteliale), cancere de sân, cancere de rinichi, de
colon sau alte cancere gastrointestinale, cancere endometri-
ale (epiteliu uterin) sau cancere ovariene. Ea este una dintre
cele mai valoroase metode pentru patologi, fiind destinată
evaluării potențialului de metastazare a acestor tumori și în
realizarea prognosticului și deciziilor terapeutice.
H IS TO CHIMIE ȘI CITO CHIMIE
optică, fie prin microscopie electronică. Proceduri histochi-
mice asemănătoare au fost concepute pentru a se evidenția fo-
sfataza alcalină, adenozin-trifosfatazele (ATP-azele) de o mare
diversitate (inclusiv Na1/K1 ATP-azele care reprezintă baza
enzimatică a pompelor de sodiu din celule și țesuturi), diverse
esteraze și multe enzime respiratorii (Fig. 1.3a).
Una dintre cele mai uzuale metode histochimice (adesea
folosită în combinație cu imunocitochimia) utilizează peroxi-
daza de hrean pentru detectarea enzimatică a antigenelor. Un
substrat larg utilizat pentru peroxidaza de hrean este 3,39-di-
aminobenzidina (DAB), un compus organic incolor, care dă
naștere unui produs brun, insolubil la locul reacției enzima-
tice (Fig. 1.3b). Produsul acestei reacții enzimatice poate fi
ușor localizat în celule, conducând la imagini cu rezoluție
ridicată atât în microscopia optică, cât și în cea electronică.
Imunocitochimie
Specificitatea unei reacții dintre un antigen și un anticorp
reprezintă fundamentele imunocitochimiei.
Anticorpii, cunoscuți și ca imunoglobuline, sunt glicoprote-
ine care sunt produse de anumite celule ale sistemului imun ca
răspuns la prezența proteinelor străine, adică a antigenelor.
În laborator, anticorpii pot fi purificați din sânge și conjugați
(legați) de coloranți fluorescenți. În general, coloranții fluo-
rescenți (fluorocromii) sunt substanțe chimice care absorb
lumină de o anumită lungime de undă (ex. lumină ultravioletă)
și emit apoi lumină vizibilă de o anumită lungime de undă (ex.
verde, galbenă, roșie). Fluoresceina, cel mai utilizat colorant
fluorescent, absoarbe lumină ultravioletă și emite lumină verde.
Anticorpii conjugați cu fluoresceină pot fi aplicați pe secțiuni
fixate blând sau criosecțiuni de pe lame pentru a localiza un an-
tigen din celule sau țesuturi. Reacția anticorpului cu antigenul
poate fi apoi examinată și fotografiată într-un microscop cu flu-
orescență sau microscop confocal acesta din urmă producând
o reconstrucție tridimensională a țesutului examinat (Fig. 1.4).
În imunocitochimie se folosesc două tipuri de anticorpi: an-
ticorpi policlonali care sunt produși de animale imunizate
 8
H ISTO CH IM IE ȘI CITO CH IM IE

a b
FIGURA 1.3 ▲ Proceduri histochimice pentru microscopie electronică, respectiv optică. a. Imagine de microscopie electronică ce
evidenţiază localizarea ATP-azei membranare în celulele epiteliale din vezică biliară de iepure. Zonele negre vizibile în imaginea de microscopie electronică
arată localizarea enzimei cu activitate ATP-azică. Această enzimă este detectată în plasmalema domeniilor laterale ale celulelor epiteliale, care corespund
localizării pompelor de sodiu. Aceste celule epiteliale sunt implicate în transportul activ de compuși prin membrana celulară. 326,000. b. Această imagine
Metode

evidenţiază macrofage colorate printr-o metodă histochimică ce folosește anticorpi marcaţi cu peroxidază de hrean și reactivul DAB. O secţiune inclusă în
parafină din rinichi de șoarece cu boală hipertensivă vasculară renală a fost colorată pentru evidenţierea doar pe suprafaţa macrofagelor a prezenţei unei
proteine marker specifice, F4/80+. Iniţial, secţiunile au fost expuse anticorpului primar, anti-F4/80+ de șoarece, ridicat în șobolan, urmând incubarea cu
anticorpul secundar IgG anti-șobolan, ridicat în capră, conjugat cu peroxidază de hrean. Proba a fost spălată și tratată cu un tampon care a conţinut DAB.
Un precipitat brun (produsul oxidării DAB prin peroxidaza de hrean) este localizat în zonele în care sunt prezente macrofagele. Proba a fost contra-colorată
cu hemalaun pentru vizualizarea nucleilor. 3400. (Prin amabilitatea Dr. Joseph P. Grande.)
CAPITOLUL 1

și anticorpi monoclonali care sunt produși de linii de celule
imortalizate (care se replică permanent) și produc anticorpi.
Într-o procedură tipică, o anumită proteină, cum ar fi actina,
este izolată din celulele musculare ale unei specii, de pildă
șobolan, și este injectată în circulația unui animal dintr-o altă
FIGURA 1.4 ▲ Imagine de microscopie confocală a unei celule
musculare cardiace de șobolan. Această imagine a fost obţinută cu
un microscop confocal prin folosirea unei metode de imunofluorescenţă
indirectă. Au fost utilizaţi doi anticorpi primari. Primul anticorp primar
recunoaște un transportor de lactat specific (MCT1) și este detectat cu un
anticorp secundar conjugat cu rodamină (roșu). Cel de-al doilea anticorp
primar este direcţionat împotriva unei proteine transmembranare CD147,
care este strâns asociată cu MCT1. Acest anticorp a fost detectat cu un anti-
corp secundar marcat cu fluoresceină (verde). Culoarea galben este vizibilă
în zonele în care cei doi anticorpi secundari se co-localizează în celula
cardiacă musculară. Această imagine tridimensională arată că ambele pro-
teine sunt distribuite pe suprafaţa celulei musculare, în timp ce transpor-
torul de lactat este vizibil și singur, în profunzime faţă de plasmalemă. (Prin
amabilitatea Dr. Andrew P. Halestrap și Dr. Catherine Heddle.)
specie, cum ar fi un iepure. În iepurele imunizat, moleculele
de actină de șobolan sunt recunoscute de sistemul imun al ie-
purelui ca antigene străine. Această recunoaștere determină o
cascadă de reacții imunologice care implică grupuri multiple
(clone) de celule imune numite limfocite B. Clonarea limfo-
citelor B conduce eventual la producerea de anticorpi anti-ac-
tină. Pe ansamblu, acești anticorpi policlonali reprezintă
amestecuri de diferiți anticorpi produși de mai multe clone de
limfocite B care recunosc fiecare diferite regiuni din molecula
de actină. Anticorpii sunt apoi extrași din sânge, purificați și
conjugați cu coloranți fluorescenți. Astfel, ei pot fi folosiți în
localizarea moleculelor de actină în țesuturile și celulele de
șobolan. Dacă actina este prezentă într-o celulă sau în țesut,
cum ar fi într-un fibroblast din țesutul conjunctiv, atunci an-
ticorpul marcat cu fluoresceină se leagă de ea și interacțiunea
poate fi vizualizată prin microscopie de fluorescență.
Anticorpii monoclonali (Planșa 1.3) sunt aceia produși
de o linie celulară producătoare de anticorpi și care
constă dintr-un grup unic de celule (clonă) de limfocite B
identice. O clonă singulară care devine o linie celulară este
obținută dintr-un individ cu mielom multiplu, o tumoră
provenită dintr-un singur plasmocit producător de anticorpi.
Indivizii cu mieloame multiple produc o populație extinsă de
anticorpi identici, omologi cu specificitate identică împotriva
unui antigen. Pentru a produce experimental anticorpi mo-
noclonali împotriva unui antigen specific, se imunizează un
șoarece sau un șobolan cu antigenul. Limfocitele B activate
sunt apoi izolate din țesutul limfatic (splină sau noduli limfa-
tici) al animalului și fuzionate cu linii celulare mielomatoase.
Fuziunea duce la hibridom, o linie celulară individuală,
imortalizată care secretă anticorpi. De exemplu, pentru a ob-
ține anticorpi monoclonali împotriva moleculelor de actină
de șobolan, limfocite B din organele limfatice ale iepurelui
imunizat trebuie să fie fuzionate cu celule mielomatoase.
Pentru localizarea unui antigen țintă în celule și țesuturi se fo-
losesc atât metode imunocitochimice directe, cât și indirecte.
 PLANŞA 1.3 Corelații clinice: anticorpii monoclonali în medicină 9
Anticorpii monoclonali sunt în prezent larg utilizați în diagnosticul bolilor infecțioase pentru identificarea mi-

tehnici imunocitochimice și au, de asemenea, multe apli-
cații clinice. Anticorpii monoclonali conjugați cu compuși
radioactivi sunt folosiți pentru detectarea și diagnosticul
metastazelor tumorale în patologie, pentru a distinge între
subtipurile de tumori și a stadiilor lor de diferențiere și în
CAPITOLUL 1
croorganismelor în sânge și fluide tisulare. În studii clinice
recente, anticorpii monoclonali conjugați cu imunotoxine,
agenți chemoterapeutici sau radioizotopi au fost folosiți
pentru administrarea țintită a agenților terapeutici în celule
tumorale din organism.

Cea mai veche tehnică imunocitochimică folosită la identifica-
rea distribuției unui antigen în celule și țesuturi este cunoscută
a fi imunofluorescenţa directă. Această tehnică folosește un
anticorp primar marcat fluorescent (fie policlonal, fie mono-
clonal) care interacționează cu antigenul din probă (Fig. 1.5a).
Ca procedură într-un singur pas, această metodă implică doar
un singur anticorp, marcat. Vizualizarea structurilor nu este
Metode
amplifică substanțial semnalul fluorescent emis din țesut. Un
avantaj suplimentar al metodei marcării indirecte este acela că
un singur anticorp secundar poate fi utilizat pentru localizarea
legării specifice la țesut a câtorva anticorpi primari diferiți (Fig.
1.6). Pentru studiile microscopice, anticorpul secundar poate
fi conjugat cu diferiți coloranți fluorescenți astfel încât pot fi
evidențiate marcări multiple pe aceeași secțiune de țesut (vezi

H IS TO CHIMIE ȘI CITO CHIMIE

neapărat ideală din cauza slabei intensități a semnalului emis.
Metodele de imunofluorescenţă directă sunt în prezent înlocu-
ite de metodele indirecte din cauza sensibilității slabe.
Imunofluorescenţa indirectă furnizează o sensibilitate
mult mai ridicată decât metodele directe și este adesea denu-
mită tehnică „sendviș” sau „tehnici în dublu strat”. În loc de
conjugarea fluorocromului cu anticorpul primar (specific)
direcționat împotriva antigenului de interes (ex. molecula
actinei de șobolan), fluorocromul este legat de un anticorp
secundar direcționat împotriva anticorpului primar de șo-
bolan (anticorp anti-șobolan, ridicat în capră; Fig. 1.5.b). Ast-
fel, când fluoresceina este direct cuplată cu anticorpul primar,
specific, metoda este directă; când fluoresceina este cuplată cu
un anticorp secundar, metoda este indirectă. Metoda indirectă
Fig. 1.4). Limitele imunofluorescenței indirecte sunt legate de
costuri, fiind mai scumpă, de muncă mai multă și de greutatea
adaptării la procese automatizate.
Este posibilă și conjugarea anticorpilor policlonali sau mo-
noclonali cu alte substanțe, cum ar fi enzime (ex. peroxidaza
de hrean), care transformă substrate incolore (ex. DAB) în
produși cu culoare specifică, insolubili, care precipită la locul
reacției enzimatice. Colorația care rezultă din această metodă
imunoperoxidazică se poate observa prin microscopie optică
(vezi Fig. 1.3b) fie prin metode imunocitochimice directe,
fie indirecte. Într-o metodă modificată, se poate atașa aur co-
loidal sau feritină (o moleculă ce conține fier) la un anticorp.
Acești markeri electronodenși pot fi direct vizualizați în mi-
croscopie electronică.

IMUNOFLUORESCENŢĂ DIRECTĂ

Anticorp

a Antigen

Anticorp secundar
fluorescent
IMUNOFLUORESCENŢĂ INDIRECTĂ
Anticorp
primar

b
FIGURA 1.5 ▲ Imunofluorescenţă directă și indirectă. a. În imunofluorescenţa directă, un anticorp primar marcat fluorescent interacţionează
cu antigenul specific din proba de ţesut. Structurile marcate sunt apoi observate în microscopul cu fluorescenţă în care o lungime de undă de excitare
(de regulă lumină ultravioletă) induce emiterea unei lumini de altă lungime de undă. Lungimea acestei unde depinde de natura fluorocromului utilizat
la marcarea anticorpului. b. Metoda indirectă implică două procese. Mai întâi, anticorpul primar specific interacţionează cu antigenul de interes. Apoi,
anticorpii secundari, care sunt marcaţi cu fluorocrom, interacţionează cu anticorpul primar. Vizualizarea structurilor marcate din ţesut este aceeași în
ambele metode și necesită microscop cu fluorescenţă.

10
H ISTO CH IM IE ȘI CITO CH IM IE
FIGURA 1.6 ▲ Microtubuli vizualizați prin metode imunocito-
chimice. Comportamentul microtubulilor (elemente ale citoscheletului)
obţinuţi din celule tumorale de sân, umane poate fi studiat in vitro prin
măsurarea activităţii de nucleaţie a lor, care este iniţiată de centrozom.
Metode
Această imagine a fost captată într-un microscop cu fluorescenţă. Prin
folosirea tehnicilor de imunofluorescenţă indirectă, microtubulii au fost
marcaţi cu un amestec de anticorpi monoclonali anti-tubulină a și anti-
tubulină b (anticorpi primari) și vizualizaţi cu anticorpi secundari conjugaţi
cu fluoresceină (izotiocianat de fluoresceină-imunoglobulină G anti-
șoarece, ridicată în capră). Reacţia antigen-anticorp, a fost realizată direct
pe o lamelă, conducând la vizualizarea moleculelor de tubulină responsa-
CAPITOLUL 1
bile pentru formarea a mai mult de 120 de microtubuli vizibili în imagine.
Aceștia își au originea în centriol și se extind în afară uniform, într-o manieră
radială, pe aproximativ 20 la 25 mm. 31.400. (Fotografie pusă cu amabilitate
la dispoziţie de Dr. Wilma L. Lingle și Dr. Vivian A. Negron.)
Tehnici de hibridizare
Hibridizarea este o metodă de localizare a ARN-ului mesager
(ARNm) sau a ADN-ului prin cuplarea secvenței de interes cu
un lanț complementar de nucleotide al unei probe, într-un
complex hibrid.
În general, termenul hibridizare descrie capacitatea mole-
culelor cu lanț singular de ARN sau ADN de a interacționa
(hibridiza) cu secvențe complementare. În laborator, hibri-
dizarea necesită izolarea de ADN sau ARN, care apoi sunt
amestecate cu secvențe nucleotidice complementare (numite
probe nucleotidice). Hibrizii sunt cel mai adesea detectați
prin folosirea de etichete radioactive în unul din componen-
tele din proba nucleotidică.
Legarea probei la secvența de detectat poate avea loc în soluție
sau pe membrană de nitroceluloză. În hibridizarea in situ,
legarea probei nucleotidice la secvența de ADN sau ARN de
interes se realizează în celule sau țesuturi, cum ar fi celule în
cultură sau embrion întreb. Această tehnică permite locali-
zarea unor secvențe specifice de nucleotide prezente în doar
10-20 de copii de ARNm sau ADN per celulă.
Pentru hibridizare in situ sunt utilizate câteva probe de nucle-
otide. Probele oligonucleotidice pot fi de doar 20-40 de
perechi de baze. Probele cu lanțuri simple sau duble de ADN
sunt mult mai lungi și pot conține până la 1.000 de perechi
de baze. Pentru localizarea specifică a ARNm, sunt folosite
probe de ARN complementar. Aceste probe sunt marcate cu
izotopi radioactivi (ex. 32P, 35S, 3H), cu un nucleotid modi-
ficat specific (digoxigenina) sau cu biotină (o etichetă legată
covalent utilizată în mod curent în scopuri multiple). Probele
radioactive se pot detecta și vizualiza prin autoradiografie. Di-
goxigenina și biotina sunt detectate prin metode imunocito-
chimice, respectiv citochimice.
Tăria legăturilor dintre probe și secvențele complementare de-
pinde de tipul de acid nucleic din cele două lanțuri. Cea mai
puternică legătură se formează între o probă de ADN și un
lanț de ADN complementar, iar cea mai slabă între o probă
de ARN și un lanț complementar de ARN. Dacă o probă de
țesut se așteaptă a conține o cantitate minimală de ARNm sau
de transcript viral, atunci se poate folosi amplificarea prin re-
acția în lanț a polimerazei (polimerase chain reaction,
PCR) pentru ADN sau prin revers-transcriptaza-PCR
(RT-PCR) pentru ARN. Transcriptele amplificate, obținute
prin aceste proceduri, sunt în mod obișnuit detectate prin
folosirea unor probe nucleotidice complementare marcate și
tehnici standard sau de hibridizare in situ.
Recent, au fost combinate probe nucleotidice cu coloranți flu-
orescenți, ceea ce a făcut posibilă vizualizarea unor probe mul-
tiple simultan (Fig. 1.7). Această tehnică, numită procedeu
fluorescent de hibridizare in situ (fluorescent in situ
hybridization, FISH), este larg utilizat în clinică pentru teste
genetice. De exemplu, o probă hibridizată pentru cromozomi
metafazici poate fi folosită pentru identificarea poziția unei
gene în cromozom. Procedeul FISH este folosit pentru a
examina simultan cromozomii, expresia genică și distribuția
produsului genei cum sunt proteine patologice sau anormale.
Multe probe fluorescente specifice sunt acum disponibile
comercial și sunt folosite în clinică pentru proceduri de veri-
ficare a cancerului cervical sau pentru detectarea celulelor in-
fectate cu HIV. Procedeul FISH poate fi folosit și la examinarea
cromozomilor din limfocitele astronauților pentru a se estima
doza de radiație adsorbită de aceștia în timpul prezenței lor în
spațiu. Frecvența translocărilor cromozomiale din limfocite
este proporțională cu doza de radiații absorbită.
Autoradiografia
Autoradiografia utilizează o emulsie fotografică întinsă
peste o secțiune de țesut pentru a localiza material radi-
oactiv în țesuturi.
FIGURA 1.7 ▲ Exemplu de tehnică FISH folosită într-un test de
verificare parentală. Nucleii interfazici ai celulelor obţinuţi din probe
de lichid amniotic au fost hibridizaţi cu două probe specifice de ADN.
Proba portocalie (LSI 21) este locul specific pentru cromozomul 21, iar
proba verde (LSI 13) este locul specific pentru cromozomul 13. Nucleul
din dreapta este dintr-o probă de fluid amniotic normal și prezintă două
semnale verzi și două semnale portocalii, care indică două copii ale cro-
mozomilor 13, respectiv 21. Nucleul din stânga are trei semnale portocalii,
ceea ce indică trizomie 21 (sindrom Down). ADN-ul a fost contra-colorat
cu un colorant albastru nespecific (colorant DAPI) pentru a face nucleul
vizibil. 31.250. (Prin amabilitatea Dr. Robert B. Jenkins.)
 Multe molecule mici precursori ai moleculelor mai mari,
cum ar fi aminoacizii care fac proteine și nucleotidele care
constituie acizi nucleici, pot fi etichetate prin încorporarea
unui atom radioactiv în structura lor moleculară. Radioacti-
vitatea este apoi urmărită pentru a se localiza moleculele mai
Aceste granule pot fi folosite pentru a indica simpla loca-
lizare a substanței sau pot fi numărate pentru a furniza infor-
mații semicantitative asupra cantității unei anumite substanțe, 11
într-un anumit loc. De exemplu, după injectarea unui animal
cu timidină tritiată, celulele care au încorporat nucleotidul în

mari în celule și țesuturi. Precursorii moleculari marcați pot
fi injectați în animale sau introduși în celule sau organe în
cultură. În acest mod, au fost studiate sinteza de ADN și divi-
ziunea celulară care îi urmează, sinteza și secreția de proteine
de către celule, sau localizarea produșilor de sinteză în celule
sau în matricea extracelulară.
Secțiunile probelor care au încorporat material radioactiv
se montează pe lame. La întuneric, lama este de regulă înmu-
CAPITOLUL 1
ADN-ul lor înainte de a se divide vor avea de aproape două ori
mai multe granule de argint față de celulele care s-au divizat
după încorporarea nucleotidului marcat.
Autoradiografia poate fi realizată și prin folosirea secțiuni-
lor ultrafine de plastic, utilizate în examinarea la EM. În prin-
cipiu, se folosește aceeași procedură, dar, ca în toate tehnicile
de preparare pentru TEM, procesul este mult mai delicat și
dificil; totuși, se obțin și o rezoluție mult mai bună și o loca-

Metode
iată într-o emulsie fotografică topită, obținându-se astfel un lizare mult mai precisă (Fig. 1.8b).
film fotografic subțire pe suprafața ei. După o expunere adec-
vată într-o casetă întunecată, de regulă timp de zile sau săp- MICR O SC O PIE
tămâni, emulsia impresionată de pe lamă se developează prin
tehnica fotografică standard și montată permanent prin aco- Microscopie optică
perire cu lamelă. Lamele pot fi colorate fie înainte, fie după Un microscop fie că el este simplu (o lentilă), sau compus

expunere și developate. Granulele de argint din emulsia de
deasupra moleculelor marcate radioactiv sunt impresionate și
developate prin această procedură apar negre, fiind suprapuse
peste locurile emisiei radioactive când se examinează prepara-
tul la microscopul optic (Fig. 1.8a).
M ICR O S C O PIE
(mai multe lentile), este un instrument care mărește o ima-
gine și permite vizualizarea unor detalii față de ce se poate
vedea cu ochiul liber. Cel mai simplu microscop este o lupă
sau o pereche de ochelari de citire.

inv

tub

a b
FIGURA 1.8 ▲ Exemple de autoradiografie folosite în microscopie optică sau electronică. a. Imagine a unei secţiuni prin nodul limfatic al
unui animal injectat cu [3H]timidină. Unele dintre celule prezintă agregate de granule de argint metalic, care apar ca mici particule negre (săgeţi). Aceste
celule au sintetizat ADN pregătind diviziunea celulară și au încorporat [3H]timidină în ADN-ul nou format. În timp, cuantele radioactive de energie scăzută
emise de [3H]timidină au lovit cristalele de halogenură de argint din emulsia fotografică care a acoperit proba (impresionare) și au creat o imagine latentă
(așa cum face lumina care ajunge la filmul fotografic dintr-un aparat foto). În timpul developării fotografice a lamei cu emulsia care o acoperă, imaginea
latentă, de fapt halogenura de argint activată din emulsie, este redusă la argint metalic, care apare de aceea sub forma unor granule negre în microscop.
31.200. (Lama cu proba originală obţinută prin amabilitatea Dr. Ernst Kallenbach.) b. Imagine autoradiografică de microscopie electronică a zonei apicale
a unei celule absorptive intestinale. Pentru această probă, în animal a fost injectat factor de creștere neurală (nerve growth factor, NGF) marcat cu, 125I, iar
ţesutul a fost recoltat 1 oră mai târziu. Proba a fost pregătită de o manieră similară cu cea pentru microscopie optică. Granulele de argint cu o dimensiune
relativ mică ajută la localizarea precisă a complexelor de 125I–NGF. A se observa că granulele de argint sunt aglomerate deasupra invaginărilor apicale (inv) și
în profilurile tubulare ale endozomilor timpurii (tub). 332.000. (Imagine de microscopie electronică obţinută prin amabilitatea Dr. Marian R. Neutra.)
 T A BELUL 1.3 Rezoluția ochiului comparativ cu
12 a instrumentelor
Distanța dintre punctele distinse separat
M ICR OSCOPIE
Ochi omenesc 0.2 mm
Microscop cu câmp luminos 0.2 mm
SEM 2.5 nm
TEM
Teoretic 0.05 nm
Pe secțiuni de țesut 1.0 nm
Microscopie de forță atomică 50.0 pm
Metode
SEM, microscop electronic de baleiaj; TEM, microscop electronic de
transmisie.
Puterea de rezoluție a ochiului uman – adică, distanța prin
care două obiecte trebuie să fie separate pentru a fi văzute ca
CAPITOLUL 1
distincte (0,2 mm) – este determinată de spațiul dintre două
celule fotoreceptoare din retină. Rolul microscopului este
acela de a mări o imagine până la nivelul la care retina poate
rezolva informația care ar fi altfel sub limitele ei de rezoluție.
Tabelul 1.3 compară rezoluția ochiului cu cea a diferitelor
instrumente.
Puterea de rezoluție este capacitatea unei lentile microsco-
pice sau a unui sistem optic de a produce imagini separate
pentru obiecte așezate aproape.
Rezoluția depinde nu doar de sistemul optic ci și de lungi-
mea de undă a sursei de lumină sau de alți factori cum ar fi
grosimea probei, calitatea fixării și intensitatea colorării. Cu o
lumină de lungime de undă de 540 nm (vezi Tabelul 1.1), o
lumină filtrată verde la care ochiul uman este foarte sensibil, și
cu obiectiv și lentilă condensatoare corespunzătoare, cea mai
mare putere de rezoluție care se poate atinge cu un microscop
cu câmp luminos ar putea fi de 0,2 mm (vezi Planșa 1.4, pa-
gina 13 pentru modul de calcul). Aceasta este rezoluția teore-
tică și, așa cum s-a menționat, ea depinde de faptul ca toate
condițiile să fie cele optime. Lentila ocular mărește imaginea
produsă de lentila obiectiv, dar nu poate crește rezoluția.
În cercetarea biologică actuală se folosesc diferite micro-
scoape optice disponibile pentru scopuri generale sau speci-
fice. Diferențele dintre ele se bazează mult pe factori cum ar
fi lungimea de undă a luminii cu care se iluminează proba,
alterările fizice ale luminii care vine a probă sau care iese din
aceasta, sau procesele de analiză specifică ce pot fi aplicate
imaginii finale. Aceste instrumente și aplicațiile ce se pot face
cu ele sunt succint descrise în această secțiune.
Microscopul folosit de cei mai mulți studenți și cercetători
este cel cu câmp luminos.
Microscopul cu câmp luminos este descendentul direct al
celui care a devenit larg accesibil în anii 1800 și a deschis
prima eră majoră a cercetării histologice. Microscopul cu
câmp luminos (Fig. 1.9) constă, în principal, din:
• o sursă de lumină pentru iluminarea probei (ex. un bec
aflat sub măsuță),
• o lentilă condensator care focalizează fasciculul de lu-
mină la nivelul probei,
• o măsuță pe care se așază lama sau altă probă,
• o lentilă obiectiv pentru colectarea luminii ce a trecut
prin probă și
• o lentilă ocular (sau o pereche de lentile ocular în micro-
scoapele binoculare folosite uzual) prin care imaginea for-
mată de lentila obiectiv poate fi examinată direct.
O probă care se examinează cu microscopul cu câmp lu-
minos trebuie să fie suficient de subțire pentru ca lumina să
treacă prin ea. Deși o parte din lumină este absorbită în tim-
pul trecerii prin probă, sistemul optic al microscopului cu
câmp luminos nu produce un nivel satisfăcător de contrast
în probele necolorate. Din acest motiv, se folosesc diferitele
metode de colorare discutate mai sus.
Examinarea unui preparat histologic cu
microscopul optic
Organele sunt tridimensionale, în timp ce secțiunile sunt
doar în două dimensiuni.
Așa cum s-a prezentat în secțiunea de mai sus „Prepararea
țesuturilor“, orice probă de țesut pregătită pentru examinare
în microscopie optică trebuie să fie tăiată în secțiuni subțiri.
Astfel, se obțin secțiuni bidimensionale dintr-o probă inițial
tridimensională a țesutului. Pentru studenții care utilizează
microscopul optic în studiul histologiei, cea mai provocatoare
problemă este capacitatea de a reconstrui mintal cea de-a treia
dimensiune, care lipsește.
De exemplu, în Figura 1.10 este prezentat rezultatul tăie-
rii în planuri diferite a unei portocale. Se observă că fiecare
suprafață a tăieturii unei portocale întregi (indicată prin linie
punctată) dezvăluie dimensiuni și fațete diferite ale secțiunii,
în funcție de orientarea tăieturii. Astfel, devine important
când observăm o anumită secțiune tăiată printr-o portocală să
avem capacitatea de a reconstrui mintal organizarea obiectului
din părțile sale componente. Un exemplu de structură histo-
logică – în acest caz, un corpuscul renal dintr-un rinichi – este
prezentată așa cum apare în planuri diferite de secționare (vezi
Fig. 1.10). De notat diferențele remarcabile dintre fiecare din
secțiunile corpusculului renal. Prin examinarea unui număr
de asemenea secțiuni bidimensionale, este posibil să se creeze
configurația tridimensională a structurii examinate.
Artefactele din lamele histologice pot fi generate în orice
etapă a preparării țesutului.
Prepararea unei lame histologice necesită o serie de pași în-
cepând cu recoltarea probei și sfârșind cu acoperirea cu la-
melă. În timpul fiecărui pas, pot apărea artefacte (greșeli
din procesul de preparare care distorsionează realitatea mor-
fologică) În general, artefactele care apar pe lama finalizată
sunt legate de metodologie, echipament sau reactivii care se
folosesc în timpul preparării. Puritatea scăzută a chimicalelor
și reactivilor folosiți în preparare (fixatori, reactivi sau colo-
ranți), imperfecțiunile din efectuarea metodei (intervale de
fixare, deshidratare, colorare prea scurte sau prea lungi, sau
de lipsa de atenție la montare și la poziționarea lamelei), ori
echipamentele neadecvate (ex. microtom cu lamă de tăiere cu
defecte) pot produce artefacte în preparatul final. Este impor-
tant ca studenții să recunoască că nu toate lamele din colecția
lor sunt perfecte și ca ei să fie familiarizați cu cele mai întâl-
nite artefacte ce se pot găsi în preparate.
 sursă de lumină sursă de electroni
(bec) (catod)
13
anod

CAPITOLUL 1
lentilă condensator
lentilă condensator
bobină de baleiere
detector
fascicul de baleiere secundar de
probă electroni
lentilă obiectiv detector de
electroni
împrăștiați

Metode
probă
lentilă proiector
vacuum
lentilă ocular
imagine pe ecranul
de vizualizare
imagine vizibilă

M ICR O S C O PIE
cu ochiul detector de
electroni cu
cameră CCD
MICROSCOP
OPTIC
imagine imagine
TEM SEM

MICROSCOP ELECTRONIC MICROSCOP ELECTRONIC

DE TRANSMISIE DE BALEIAJ
FIGURA 1.9 ▲ Schemă în care se compară căile optice în diferite tipuri de microscoape. Pentru o comparare mai bună între cele trei
tipuri de microscoape, microscopul optic (stânga) este prezentat cu susul în jos; TEM (mijloc); iar SEM (dreapta). De notat că atât în TEM cât și în SEM,
probele trebuie să fie introduse în cameră cu vacuum ridicat (1024 la 1027 Pa).

Alte sisteme optice

În afară de microscopul optic cu câmp luminos, care este uzual
folosit pentru examinarea obișnuită a lamelor histologice, în cli-
nică și în laboratoarele de cercetare sunt folosite și alte sisteme
optice (unele descrise mai jos). Parte dintre acestea sunt folosite
pentru creșterea contrastului fără colorare (cum ar fi microsco-
pul cu contrast de fază), în timp ce altele sunt menite a vizualiza
structurile prin utilizarea unor tehnici specifice cum ar fi imuno-
fluorescenţa (microscoape cu fluorescență și confocale).
Microscopul cu contrast de fază permite examinarea celu-
lelor și țesuturilor necolorate și sunt utile în special studie-
rii celulelor vii.
Microscopul cu contrast de fază exploatează diferențele
mici de indice de refracție din diferitele părți ale probei celulare
sau tisulare. Lumina care trece prin zone cu indice de refracție
mare (zone mai dense) este întârziată și devine defazată față
de restul fasciculului care trece prin alte zone ale probei. Mi-
croscopul cu contrast de fază folosește și alte unde de lumină,
cu defazare indusă printr-o serie de inele optice din lentilele
condensator și obiectiv, care diminuează semnificativ amplitu-
dinea fasciculului întârziat inițial de trecerea prin probă produ-
când o imagine cu contrast. Porțiunile întunecate din imagine
corespund zonelor dense din probă; porțiunile luminate din
imagine corespund zonelor mai puțin dense din probă. Micro-
scopul cu contrast de fază este astfel folosit pentru examinarea
celulelor și țesuturilor vii (cum ar fi celule din țesuturi în cul-
tură) și este larg utilizat pentru examinarea secțiunilor semifine
(de aproximativ 0,5-mm) necolorate de țesut incluzionat în
materiale plastice.
Microscopul cu interferență, care permite, de asemenea,
cuantificarea masei tisulare și microscopul cu interferență
diferențială (folosind optica Nomarski), care este util mai ales
în abordarea proprietăților suprafețelor celulare sau altor sco-
puri biologice sunt două variante ale microscopului cu contrast
de fază.
În microscopia cu câmp întunecat, lentila obiectiv nu colec-
tează niciun fascicul direct de lumină venind de la sursă.
În microscopia cu câmp întunecat, prin obiectiv trece
numai lumina care a fost împrăștiată sau refractată de struc-
turile din probă. Microscopul cu câmp întunecat este echipat
cu o lentilă condensator care iluminează proba cu un fascicul
de lumină puternic, orientat oblic. De aceea, câmpul apare ca
un fundal negru pe care se văd puncte mici strălucitoare din
probă care reflectă parte a luminii în obiectiv.
Efectul este asemănător aceluia al particulelor de praf văzute
în fasciculul de lumină care iese dintr-un proiector aflat într-o
cameră întunecată. Lumina reflectată de particulele de praf
impresionează retina, făcând astfel particulele vizibile.
Rezoluția microscopului cu câmp întunecat nu poate fi mai
bună decât a microscopului cu câmp luminos, deoarece folo-
sește aceeași sursă de lumină. Totuși, în imaginile de microsco-
 14
M ICR OSCOPIE
Metode
CAPITOLUL 1

FIGURA 1.10 ▲ Exemple de secțiuni printr-o portocală și printr-un corpuscul renal. Liniile punctate de pe portocala intactă indică plan-
urile de secţionare care se corelează cu suprafeţele tăieturilor. La fel, diferitele secţiuni printr-un corpuscul renal, care este tot o structură sferică, prezintă
aspecte diferite. Dimensiunea și aspectul structural sunt reflectate prin planul de secţionare.

pie cu câmp întunecat pot fi detectate particule individuale mai
mici, datorită unui contrast mai mare care este creat.
Microscopul cu câmp întunecat este util pentru exami-
narea autoradiografiilor, unde granulele developate de argint
apar albe pe fundalul întunecat. Din punct de vedere clinic,
microscopia cu câmp întunecat este utilă în examinarea
urinei pentru prezența cristalelor, cum ar fi acelea de acid uric
sau oxalat și pentru detectarea unor anumite bacterii ca spi-
rochetele, în special Treponema pallidum, microorganism
care provoacă sifilisul, o boală transmisibilă sexual.
Microscopul cu fluorescență folosește capacitatea unor mo-
lecule de a emite fluorescență prin excitare cu lumină ultra-
violetă.
PLANŞA 1.4 Considerații funcționale: utilizarea adecvată a
microscopului optic 15
Această introducere sumară a folosirii corespunzătoare a mi- • Centrați câmpul diafragmei prin controalele de cen-

croscopului optic este adresată acelor studenți care vor fo-
losi aparatul pentru o examinare de rutină a țesuturilor. Dacă
observațiile care urmează vor părea prea simple, aceasta va
fi deoarece cei mai mulți utilizatori ai microscopului nu reu-
șesc să-l folosească la capacitatea tuturor avantajelor sale.
În ciuda accesibilității la echipamentele actuale de finețe,
câteva mici recomandări pentru folosirea corectă a micro-
scopului optic sunt de făcut.
Echipamentele optice costisitoare și corecte la nivel
CAPITOLUL 1
trare de sub masa lentilei condensator. Deschideți apoi
diafragma până când fasciculul de lumină umple întregul
câmp observat.
• Scoateți ocularele (sau folosiți telescopul de centrare sau
telescopul de fază din accesorii, dacă sunt disponibile) și
observați pupila obiectivului. Veți vedea un câmp circular
care are o rază direct proporțională cu apertura numerică
a obiectivului. Dacă închideți diafragma lentilei conden-
sator, limitele acesteia vor apărea în acest câmp circular

înalt operează adecvat numai dacă iluminarea și calea
fasciculului care permite observarea sunt corect centrate
și ajustate. Folosirea unei setări corecte și a unei alinieri
adecvate a căii optice vor contribui în mod substanțial la
recunoașterea unor detalii de finețe din probă și la pre-
zentarea fidelă a culorii în imaginea văzută sau în fotogra-
fia preparatului.
Metode
al obiectivului. Pentru cele mai multe materiale colorate,
setați diafragma lentilei condensator pentru a acoperi cam
două treimi din apertura obiectivului. Această setare va
duce la cel mai bun compromis între rezoluție și contrast
(contrastul fiind, simplu, diferența de intensitate dintre zo-
nele luminate și cele întunecate din probă).

M ICR O S C O PIE
Doar folosind acești pași simpli, imaginea va fi atât de bună,
Iluminarea Köhler este unul din secretele unei bune
cât permite optica microscopului. Acum să vedem de ce.
microscopii și este inclusă în construcția tuturor micro-
În primul rând, de ce să ajustăm câmpul diafragmei doar
scoapelor actuale de laborator și de cercetare. Figura P1.4.1
ca să acopere câmpul observat? Iluminarea unui câmp mai
prezintă o cale tipică de lumină și toate controalele necesare
larg, decât poate fi „văzut“ din punctul de vedere al opticii
alinierii unui microscop dintr-un laborator din zilele noastre;
microscopului doar, conduce la reflexii interne sau la lumină
ar trebui prin instrucțiunile date în ce urmează să ne referim
excedentară ce determină „zgomot“ optic suplimentar și scă-
la iluminarea corespunzătoare a microscopului dumnea-
derea contrastului imaginii.
voastră.
În al doilea rând, de ce să dăm atenție setării diafrag-
Pașii alinierii, necesari unei bune iluminări Köhler, sunt
mei lentilei condensator – adică iluminării aperturii?
puțini și simpli:
Această diafragmă influențează puternic rezoluția și con-
• Focalizați proba. trastul cu care se pot observa detaliile din probă.
• Închideți diafragma câmpului.
• Focalizați lentila condensator prin mișcarea ei în sus și în
jos până liniile de demarcație ale câmpului ei sunt într-o
focalizare clară.
ocular
ocular
cale opțională
pentru aparat foto

căile ocularelor

obiectiv
lentilă condensator auxiliară
auxiliar
măsuța lamei (platină)
diafragma
agma lentilei condensator
condensato
lentilă condensator

butoane
toane de poziționate a platinei
platine
butoane de
diafragma câmpului focalizare
FIGURA F1.4.1 ▲ Schema unui mi- (macro- și
croscop optic tipic. Imaginea prezintă micro-viză)
o imagine în secţiune printr-un micro- sursă de lumină (lampă)
scop, componentele sale operaţionale și
calea luminii.
(continuare în pagina 16)
 Considerații funcționale: utilizarea adecvată a
16 PLANŞA 1.4 microscopului optic (continuare)
Pentru cea mai mare parte a aplicațiilor practice, rezolu-
M ICR OSCOPIE
ția este dată de ecuația
l cel mai bun transfer de contrast de la probă la imagine ar
d5
NAobiectiv 1 NAcondensator
unde
d 5 rezoluția, distanța dintre puncte ce pot fi observate
separat (în nm),
Metode
l 5 lungimea de undă a luminii folosite (verde = 540 nm),
NA 5 apertura numerică sau produsul dintre valoarea
sinus din jumătatea unghiului deschiderii lentilei
obiectiv, respectiv lentilei condensator față de
punctul central al probei și indicele de refracție
al mediului dintre lentila obiectiv sau lentila con
CAPITOLUL 1
densator și probă.
Cum influențează rezoluția lungimea de undă și apertura
numerică? Structura probei difractă lumina. Unghiul de difrac-
ție este direct proporțional cu lungimea de undă și invers pro-
porțional cu spațiul dintre structuri. Conform fizicianului Ernst
Abbé, o spațiere structurală dată poate fi observată numai
dacă sistemul optic de observare (obiectivul) poate distinge
parte din lumina difractată produsă de spațiere. Cu cât este
mai mare apertura obiectivului, cu atât există mai multă lu-
mină refractată care participă la formarea imaginii, conducând
la rezolvarea unor detalii mai mici și la o imagine mai clară.
Formula simplă de mai sus, însă, arată că apertura lentilei
condensator este cel puțin la fel de importantă ca apertura
lentilei obiectiv. Acest aspect devine logic numai dacă vom
considera unghiul de difracție pentru un fascicul oblic sau
pentru o apertură mai mare. Acest unghi rămâne în esență
O moleculă fluorescentă emite o undă luminoasă în domeniul
vizibil când este expusă unei surse ultraviolete (UV). Micro-
scopul cu fluorescență este folosit pentru a arăta prezența
moleculelor fiziologice cu fluorescență intrinsecă (autofluo-
rescență) cum ar fi vitamina A sau unii neurotransmiţători
. Deoarece moleculele autofluorescente nu sunt numeroase,
cele mai larg utilizate aplicații ale microscopului cu fluores-
cență sunt legate de evidențierea fluorescenței introduse în
probe, cum ar fi în cazul detectării antigenelor sau anticorpi-
lor în procedurile de imunocitochimie (vezi Fig. 1.6). Mole-
cule fluorescente specifice pot fi injectate într-un animal sau
direct în celule și folosite ca trasori. Astfel de metode au fost
utile în studiul unor joncțiuni intercelulare (gap), pentru tra-
sarea căilor fibrelor nervoase în neurobiologie și în detectarea
makerilor fluorescenți de creștere din țesuturile mineralizate.
Pentru a produce lumină monocromatică sau aproape mono-
cromatică (lungime de undă unică sau de bandă îngustă) între
sursa de lumină UV și probă se introduc diferite filtre. Un al
doilea set de filtre, introdus între probă și obiectiv, permite
să ajungă la ocular și la ochi sau la emulsia fotografică, ori la
procesorul analitic numai banda îngustă a luminii de undă a
fluorescenței emise.
Microscopul cu lumină ultravioletă folosește lentile din
cuarț și o lampă ultravioletă.
constant, dar este oferit obiectivului într-o asemenea modali-
tate încât poate fi ușor mărit.
Cum influențează contrastul, setarea aperturii? Teoretic,
putea fi obținut prin interacțiunea (interferența) dintre frontul
undei ne-difractate și toate fronturile undei difractate.
Pentru transferul de contrast dintre transmisia completă
și absorbția completă din probă, relația dintre intensitățile
luminii difractate și ne-difractate trebuie să fie de 1:1 pen-
tru a realiza interferența complet distructivă (negru) și cea
complet constructivă (strălucitor). Dacă apertura lentilei con-
densator se adaptează la apertura lentilei obiectiv, lumina
ne-difractată pătrunde în obiectiv cu intensitate maximă, dar
dacă doar o parte a luminii difractate poate intra, va duce la
un contrast scăzut. Cu alte cuvinte, închiderea aperturii len-
tilei condensator la două treimi din apertura lentilei obiectiv
duce relația dintre intensitățile luminii difractate și ne-difrac-
tate aproape de 1:1 și optimizează astfel contrastul.
Închiderea aperturii lentilei condensator (sau coborâ-
rea acestei lentile) dincolo de acest echilibru va produce
fenomene de interferență sau artefacte de imagine cum ar
fi inele de difracție sau linii artificiale împrejurul structurilor
din probă. Cele mai multe dintre tehnicile microscopice
folosite pentru creșterea contrastului – cum sunt câmpul în-
tunecat, iluminarea oblică, contrastul de fază sau modularea
contrastului – sunt bazate pe principii asemănătoare (ele
suprimă sau reduc intensitatea luminii ne-difractate pentru a
îmbunătăți contrastul slab, inerent al probei).
Prin considerarea pașilor menționați mai sus și menține-
rea curățeniei lentilelor, calitatea și fidelitatea imaginilor vă-
zute vor varia numai datorită caracteristicilor de performanță
ale sistemului optic.
Imaginea din microscopul cu lumină ultravioletă (UV)
depinde de absorbția luminii UV de către moleculele din
probă. Lampa UV are o lungime de undă de aproximativ 200
nm. Astfel, microscopul UV se aseamănă ca mod de lucru
unui spectrofotometru; rezultatele sunt de regulă înregistrate
fotografic. Proba nu poate fi examinată direct printr-un ocu-
lar deoarece lumina UV nu se vede și este vătămătoare pentru
ochi.
Microscopia UV este utilă în detectarea acizilor nucleici, în
mod specific a bazelor purinice și pirimidinice din nucleotide.
Ea este de asemenea utilă în detectarea unor proteine care
conțin anumiți aminoacizi. Folosindu-se lungimi de undă
specifice pentru iluminare, cu microscopul UV se pot efec-
tua măsurători uzuale spectrofotometrice pentru determinări
cantitative de ADN și ARN în celule. Așa cum a fost descris
în Planșa 1.2 de la pagina 7, microspectrofotometria Fe-
ulgen este folosită în clinică pentru evaluarea gradului de
ploidie (multipli de cantitate normală de ADN) din secțiuni
de tumori.
Microscopul confocal cu baleiere combină componente ale
microscopului optic cu un sistem de baleiere pentru a deta-
lia din punct de vedere optic o probă.
Microscopul confocal permite vizualizarea unei probe bio-
logice în trei dimensiuni. Cele două lentile ale microscopului
 detector
FIGURA 1.11 ▲ Schema luminii
emise în focus și afară din focus
la microscopul confocal. a. Această
minideschidere 17
schemă prezintă calea fasciculului laser
lentilă
și a luminii emise când structura din

CAPITOLUL 1
fototub
imagine este plasată exact în punctul
focal al lentilei. Ecranul cu minideschi- sursă de
derea, de pe cealaltă parte a sistemului
oglinda de lumină
optic al microscopului confocal, permite
să treacă prin aceasta numai luminii care
separare a
vine în focus de la structura din probă.
fasciculului
Lumina este apoi transpusă în imagine
de programul computerului. Deoarece minideschidere
punctul focal al lentilei obiectiv a mi-
croscopului formează o imagine clară la

Metode
nivelul la care se află minideschiderea, lentilă obiectiv
aceste două puncte se cheamă că sunt probă
puncte confocale. b. Schema prezintă
calea fasciculului laser și a luminii emise,
care sunt în afara focusului faţă de min- planul de focalizare
ideschidere. Astfel, lumina de la probă,
fiind blocată de ecranul minideschiderii,
a ÎN FOCUS b AFARĂ DIN FOCUS

M ICR O S C O PIE
nu va fi detectată.

confocal (lentila obiectiv și lentila fototub) sunt perfect aliniate Microscopul cu lumină polarizată este o modificare sim-
pentru a focaliza lumina din punctul focal al uneia în punctul plă a microscopului optic în care un filtru de polarizare (po-
focal al celeilalte. Diferența majoră dintre un microscop con- larizatorul) se plasează între sursa de lumină și probă, iar un
vențional și unul confocal constă în adăugarea unei aperturi al doilea polarizator (analizatorul) se plasează între lentila
detectoare (minideschidere – „pinhole”) care este concatenată obiectiv și ocular.
cu punctul focal al lentilelor; astfel, microscopul este confocal. Atât polarizatorul, cât și analizatorul se pot roti; diferența
Această poziționare precisă a minideschiderilor permite trece- dintre unghiurile lor de rotație este folosită pentru determi-
rea doar a luminii „în focus” către fotomultiplicator (detector), narea gradului în care structura examinată afectează fasciculul
în timp ce lumina „afară din focus” este blocată și nu intră în
detector (Fig. 1.11). Acest sistem are capacitatea de a asigura
separator al
rezoluție (0,2-0,5 mm) și claritate excepționale dintr-o secțiune fasciculului dicroic fascicul
subțire a unei probe biologice doar prin eliminarea luminii ie- oglinzi de laser
șite din focus. Microscopul confocal folosește ca sistem de baleiere
apertură a
iluminare un laser care este puternic convergent și, de aceea, detectorului
produce o lumină de excitare de mare intensitate sub forma (minideschidere)
unui spot de baleiere superficială. Un sistem de oglinzi este
folosit pentru a mișca fasciculul laser peste probă, iluminând
un singur spot odată (Fig. 1.12). Mai multe spoturi singulare Microscop
sunt scanate pentru același plan focal, iar un computer cu un
fototub fotomultiplicator
program adecvat reconstruiește imaginea din datele înregistrate
în cursul baleierii. Din acest punct de vedere, microscopia con-
focală se aseamănă cu procesul de realizare a unei imagini prin
ocular cursor de reflecție
baleierea din tomografia axială computerizată (CAT).
Mai mult, prin utilizarea doar a unei profunzimi reduse
pentru imaginea în focus, este posibil să se creeze imagini mul- obiectiv
tiple la adâncimi diferite ale probei. Astfel, se poate literalmente probă
diseca strat după strat în toată grosimea probei. De asemenea,
se poate utiliza un computer pentru a se face reconstrucții tridi-
mensionale din seria de imagini. Deoarece fiecare imagine indi- FIGURA 1.12 ▲ Structura microscopului confocal și calea fas-
viduală localizată la o adâncime proprie din probă este extrem ciculului . Sursa de lumină pentru un microscop confocal este un laser.
Fasciculul laser (linia roșie) merge până la proba de ţesut ghidată de un
de clară, imaginea tridimensională rezultată este și ea la fel de separator al fasciculului dicroic, iar după aceea la două oglinzi mișcătoare,
clară. În plus, odată ce computerul a asamblat fiecare imagine de baleiere; aceste oglinzi baleiază fasciculul laser peste probă în am-
secționată, imaginea tridimensională reconstruită poate fi ani- bele direcţii x și y. La sfârșit, fasciculul laser pătrunde în microscopul cu
mată pentru a fi privită pe monitor sau de pe Internet din orice fluorescenţă și merge prin sistemul optic al acestuia să ilumineze o probă
de ţesut destinată examinării. Lumina emisă de proba de ţesut după ilu-
unghi dorit (vezi Fig. 1.4). minare (linia albastră) merge înapoi prin sistemul optic al microscopului,
Microscopul cu lumină polarizată folosește faptul că mo- prin ambele oglinzi de baleiere, trece prin separatorul de fascicul și este
leculele înalt ordonate sau rețele de molecule pot roti un- focalizată asupra minideschiderii. Lumina care trece prin minideschi-
dere este primită și înregistrată de detectorul legat la un computer care
ghiul planului luminii polarizate. construiește imaginea pixel cu pixel.
 de lumină polarizată. Capacitatea unui cristal sau a unei rețele
paracristaline de a roti planul luminii polarizate se numește
18 birefringență (dublă refracție). Mușchiul striat și incluziu-
nile cristaloide din celulele interstițiale testiculare (celule Ley-
dig), printre alte structuri obișnuite, prezintă birefringență.
M ICR OSCOPIE
Microscopie electronică
Există două tipuri de microscoape electronice care pot furniza
date morfologice și analitice asupra celulelor și țesuturilor:
microscopul electronic de transmisie (TEM) și microscopul
electronic de baleiaj (SEM). Prima îmbunătățire în EM față
de microscopia optică este aceea că lungimea de undă a fas-
ciculului de electroni este de aproximativ 1/2.000 din cea a
Metode
fasciculului de lumină din microscopul optic, ridicând prin
aceasta rezoluția cu un factor de 103.
TEM folosește interacțiunea unui fascicul de electroni cu
proba, pentru a produce o imagine.
Optica în TEM este, în principiu, similară aceleia din micro-
CAPITOLUL 1
scopul optic (vezi Fig. 1.9), cu excepția faptului că la primul
se folosește un fascicul de electroni în loc de unul de lumină.
Principiul microscopului în discuție este următorul:
• O sursă de electroni (catod, tun de electroni), cum ar
fi un filament de tungsten incandescent, emite electroni.
• Electronii sunt atrași de un anod.
• O diferență de potențial între suprafața catodului și anod
oferă un voltaj de accelerare între 20.000 și 200.000 de
volți electronilor, producând un fascicul de electroni.
• Fasciculul trece apoi printr-o serie de lentile electro-
magnetice care au aceeași funcție ca și lentilele de sticlă
din microscopul optic.
Lentila condensator dă formă și schimbă diametrul
fasciculului de electroni care ajunge în planul probei.
Fasciculul trecut prin probă este apoi focalizat și mărit de o
lentilă obiectiv, iar apoi mărit și mai mult de una sau mai
multe lentile proiector. Imaginea finală se vizualizează pe
un ecran fluorescent acoperit cu fosfor sau captată pe o
placă fotografică. Porțiunile din probă prin care electronii
au trecut apar strălucitoare; porțiunile întunecate din prepa-
rat au absorbit sau împrăștiat electronii din cauza densității
lor intrinseci sau datorită unor metale grele adăugate în tim-
pul pregătirii probei. Adesea, un detector de electroni cu un
senzor sensibil la lumină, cum ar fi un dispozitiv cuplat la
sarcină electrică (CCD de la „charge-coupled device“) este
plasat deasupra sau dedesubtul ecranului de vizualizare pen-
tru a se observa imaginea în timp real, pe un monitor. Acest
lucru permite proceduri facile de arhivare a imaginilor sau
videoclipurilor pe computer.
Pregătirea probelor pentru microscopie electronică de
transmisie este asemănătoare cu aceea pentru microscopia
optică, cu excepția faptului că necesită metode mai de fi-
nețe.
Principiile folosite în prepararea secțiunilor de examinat la
TEM sunt în esență aceleași cu cele utilizate în microscopia
optică, cu adăugarea constrângerii că la fiecare pas trebuie să
se lucreze cu trei sau patru ordine de mărime mai mici sau
mai subțiri decât în microscopie optică. TEM, care folosește
un fascicul de electroni cu lungime de undă de aproximativ
0,1 nm, poate ajunge la o rezoluție teoretică de 0,05 nm.
Datorită rezoluției excepționale din TEM, calitatea fixării
– adică gradul de conservare a morfologiei sub-celulare – tre-
buie să fie cea mai bună care se poate face.
Prepararea obișnuită a probelor pentru microscopia elec-
tronică de transmisie începe prin fixarea cu glutaraldehidă
urmată de spălare într-un tampon și post-fixare cu tetra-
oxid de osmiu.
Glutaraldehida, o di-aldehidă, conservă constituenții pro-
teici prin legarea încrucișată a lor; tetraoxidul de osmiu
reacționează cu acizii grași nesaturați din lipide, în special din
fosfolipide. Osmiul introduce și electrono-densitate în celule
și țesuturi deoarece este un metal greu, accentuând astfel for-
marea ulterioară a imaginii în TEM.
În mod ideal, țesuturile ar trebui perfuzate cu glutaralde-
hidă tamponată înainte de recoltarea din animal. Mult mai
adesea, bucăți de țesut cu volume de până la 1 mm3 sunt
fixate pentru TEM (a se compara cu probele de microsco-
pie optică ce pot fi cu dimensiuni de ordinul centimetrilor).
Procesul de deshidratare este identic celui din microscopia
optică, iar țesutul este impregnat cu monomer de rășină, de
regulă rășină epoxidică, ce este ulterior polimerizată.
Țesutul incluzionat în materialul plastic este secționat cu mi-
crotoame special construite ce folosesc cuțite de diamant.
Din cauza puterii limitate de penetrare a electronilor, secți-
unile obișnuite de microscopie electronică de transmisie se
plasează într-un domeniu de grosime de la 50 nm la nu mai
mult de 150 nm. De asemenea, pentru motivul că materialele
abrazive folosite la ascuțirea cuțitelor metalice lasă zgârieturi
de neacceptat pe secțiunile vizualizate în TEM, se folosesc
cuțite de diamant cu o margine de tăiere aproape perfectă.
Secțiunile tăiate cu cuțite de diamant sunt mult prea subțiri
ca să poată fi manevrate; ele plutesc de la vârful cuțitului pe
suprafața unei băi de lichid și sunt preluate de pe această su-
prafață direct pe grile cu rețea de fire de cupru acoperite cu
material plastic. Grilele au 20-155 de ochiuri/cm sau fante
special destinate examinării secțiunilor seriate. Fasciculul de
electroni trece prin probă, apoi prin deschiderile grilei de
cupru, iar imaginea se focalizează pe ecranul de vizualizare,
CCD, sau pe filmul fotografic.
Este necesară o „colorare“ de rutină a secțiunilor pentru
microscopie electronică de transmisie, pentru a se crește
contrastul obișnuit astfel încât detaliile morfologiei celu-
lare să fie ușor de văzut și de fotografiat.
În general, secțiunile pentru microscopie electronică de trans-
misie se „colorează“ (contrastează) prin adăugarea în probă a
unor materiale de densitate mare, cum ar fi ioni de metale
grele. Ionii de metale grele se pot lega de țesuturi în timpul
post-fixării sau deshidratării sau prin expunerea secțiunilor la
soluții ale unor asemenea ioni, după secționare. Tetraoxidul
de osmiu, folosit standard pentru post-fixare, se leagă de aci-
zii grași nesaturați din fosfolipidele componente ale membra-
nelor, oferind densitate suplimentară membranelor.
Azotatul de uranil este adesea adăugat soluțiilor alcoo-
lice folosite la deshidratare pentru a crește densitatea compo-
nentelor din joncțiuni celulare sau din alte locuri. Expunerea
secvențială la soluții de acetat de uranil sau citrat de plumb,
prin așezarea secțiunilor pe picături ale acestor soluții, este
uzual folosită pentru contrastarea secțiunilor înainte de exa-
minarea la TEM pentru a oferi o rezoluție ridicată și contrast
mare imaginilor microscopice.
Uneori, sunt necesare tratamente speciale pentru a vizu-
aliza rezultatele reacțiilor de histochimie sau imunocitochi-
mie la MET. Procedurile implicând fosfatazele sau esterazele
pot fi folosite în acest scop (vezi Fig. 1.3). Substituirea unui
compus fluorescent cu un compus ce conține metal greu
pentru conjugare cu un anticorp permite adaptarea metode-
lor imunocitochimice la microscopia electronică. Asemănă-
tor, tehnici autoradiografice de EM au fost îmbunătățite
pentru a fi utilizate în microscopie electronică de transmisie
(vezi Fig. 1.8b). Aceste metode au fost în mod deosebit utile
pentru elucidarea surselor celulare sau căilor intracelulare a
unor produși de secreție, localizarea unor receptori specifici
la suprafața celulei și localizarea intracelulară a unor medica-
mente sau substanțe ingerate.
Înghețarea-fracturarea este o metodă deosebită de prepa-
rare a probelor pentru microscopie electronică de trans-
misie; ea este importantă în mod deosebit pentru studiul
membranelor.
Țesutul ce trebuie examinat poate fi fixat sau nu; dacă a fost
fixat, atunci fixatorul se spală pentru ca excesul să fie eliminat
din țesut înainte de continuarea prelucrării. Se infiltrează țesu-
tul cu un agent crioprotectant, cum ar fi glicerina, iar țesutul
este înghețat instantaneu la aproape 2160°C. Crioprotectan-
tul, înghețarea rapidă și dimensiunile extrem de mici ale probei
de țesut previn formarea cristalelor mari de gheață care ar de-
teriora ultrastructurile celulare. Țesutul astfel înghețat este apoi
plasat într-un aparat de înghețare-fracturare, cu incinta vidată
și izbit în mod controlat, cu marginea unui cuțit sau a unei
lame de ras, pentru a fi rupt.
Planul de fractură trece preferențial prin porțiunea hidro-
fobă a membranelor expunând zona dintre cele două foițe
ale bistratului lipidic.
Fractura care rezultă la nivelul membranei produce două noi
suprafețe. Suprafața membranei, ca parte opusă a feței externe
cu spațiul extracelular dedesubt, este numită față E; fața care
are în spate protoplasma (citoplasma) este numită față P.
Proba astfel fracturată este apoi acoperită, de obicei cu platină
atomizată prin evaporare, pentru a se crea o replică a supra-
feței de fractură. Țesutul este apoi digerat pentru solubilizare,
iar replica suprafeței, nu și țesutul însuși, este așezată pe o
grilă pentru a fi examinată la TEM. O asemenea replică pre-
zintă detalii până la nivel molecular (vezi Fig. 2.5, pagina 29).
În microscopia electronică de baleiaj, fasciculul de electroni
nu trece prin probă ci este baleiat pe suprafața acesteia.
Din multe puncte de vedere, imaginile obținute prin SEM
seamănă mai degrabă celor văzute pe un ecran de televizor,
decât pe un monitor de TEM. Ele au un aspect tridimen-
sional și reprezintă organizarea suprafeței probei examinate.
Pentru examinarea celor mai multe țesuturi, proba este fixată,
deshidratată prin evaporare la punct critic (sublimarea apei),
acoperită cu un film atomic de aur, susținut de un strat de car-
bon (ambele obținute prin evaporare), montate pe un trunchi
de aluminiu și plasată în camera probei dintr-un SEM. Pentru
țesuturile mineralizate, se pot elimina toate componentele or-
ganice tisulare cu soluții de degradare gen înălbitori și apoi să
se examineze aspectele structurale ale componentei minerale.
Baleierea este realizată în același mod, pe trasee de linii
paralele, cum se baleiază fasciculul de electroni pe supra-
fața unui tub de televizor. Electronii reflectați de suprafața 19
baleiată (electroni împrăștiați) și cei respinși (electroni
secundari) sunt colectați de unul sau mai mulți detectori
CAPITOLUL 1
și reprocesați pentru a forma o imagine tridimensională de
mare rezoluție a suprafeței probei. În modelele de început ale
microscopului, imaginile erau captate într-un tub catodic de
rezoluție ridicată (cathode ray tube, CRT) sau pe placă foto-
grafică; instrumentele actuale, însă, captează imagini digitale
prin folosirea unor detectori sensibili și CCD pentru afișarea
pe un monitor cu rezoluție ridicată al unui computer.
Pot fi utilizați și alți detectori pentru a măsura radiațiile X
Metode
emise de pe suprafață, catodoluminiscența moleculelor din țe-
sutul de sub suprafață, sau electronii Auger emiși de suprafață.
Microscopia electronică de baleiaj-transmisie (STEM) com-
bină caracteristici ale TEM și SEM pentru a permite microa-
naliza de raze X a electronilor din probă.
În SEM configurația poate fi utilizată pentru a produce o ima-
M ICR O S C O PIE
gine de transmisie prin inserarea unui braț grilă la nivelul pro-
bei, care să colecteze printr-un detector electronii transmiși și să
reconstruiască imaginea pe un CRT. O asemenea configurare a
unui SEM sau microscopul electronic de baleiere-trans-
misie (STEM) facilitează folosirea instrumentului pentru mi-
croanaliza de raze X a electronilor probei.
Detectorii se pot adapta microscopului pentru a colecta
razele X emise pe măsură ce fasciculul incident bombardează
secțiunea; cu analizatori corespunzători, poate fi construită
o hartă care prezintă distribuția în secțiune a elementelor cu
masa atomică peste 12, aflați într-o concentrație suficientă
pentru a produce destule raze X care să fie analizate. De ase-
menea, se pot extrage date semicantitative pentru elementele
cu concentrație suficientă. Astfel, atât TEM, cât și SEM pot fi
transformate în mijloace analitice sofisticate, în plus față de a
fi folosite ca instrumente „optice”.
Microscopie de forță atomică
Microscopia de forță atomică s-a constituit ca unul dintre
cele mai puternice instrumente de studiere a topografiei
suprafețelor la rezoluții moleculare și atomice.
Un nou microscop care s-a dovedit a fi mult mai util stu-
diilor biologice este microscopul de forță atomică (ato-
mic force microscopy, AFM). Acesta este un microscop
non-optic care operează în același mod ca un vârf de deget
ce palpează și simte pielea de pe față, fără să o vedem. Senzația
vârfului de deget este procesată de creier, care este capabil să
deducă topografia suprafeței feței când este atinsă.
În AFM, o sondă ultra-ascuțită, punctiformă, care se apropie
de dimensiunea unui singur atom în vârf, baleiază proba ur-
mărind linii paralele de-a lungul axei x, repetând baleierea la
intervale mici de-a lungul axei y. Vârful ascuțit este montat în
capătul unui braț în consolă foarte flexibil (cantilever) astfel
încât vârful deplasează consola după cum simte „forța ato-
mică” de pe suprafața probei (Fig. 1.13). Suprafața superioară
a consolei are proprietăți reflectorii, iar un fascicul laser este
direcționat de aceasta către o diodă. Acest aranjament acţio-
nează ca o „pârghie optică” deoarece înclinări extrem de fine
ale consolei sunt puternic amplificate de diodă. AFM poate
opera cu vârful consolei atingând proba (mod contact), sau
 laser
20
fotodiodă
M ICR OSCOPIE

vârf
braț în consolă

piesă probă
Z piezoelectrică
cu baleiere
Y
Metode

X
CAPITOLUL 1

computer MOD CONTACT MOD „TAPPING”

FIGURA 1.13 ▲ Schema microscopului de forță atomică (AFM). Un vârf extrem de ascuţit de pe un braţ în consolă se mișcă deasupra unei
suprafeţe a unei probe biologice. Mecanismul de răspuns furnizat de o piesă piezoelectrică cu baleiere permite vârfului să se menţină la o forţă constantă dea-
supra suprafeţei probei. Vârful se află sub capătul unui braţ în consolă cu proprietăţii reflectorii asupra unui fascicul laser. Fasciculul laser se focalizează asupra
consolei. Pe măsură ce vârful baleiază suprafaţa probei, mișcându-se în sus sau în jos, în funcţie de conturul suprafeţei, fasciculul laser este trimis de consolă
către o fotodiodă. Fotodioda măsoară schimbările de intensitate ale fasciculului laser și convertește această informaţie în curent electric. Răspunsul primit de
la fotodiodă este prelucrat de un computer sub forma unei imagini a suprafeţei și, în plus, reglează piesa piezoelectrică cu baleiere. În modul contact (insertul
din stânga), forţele electrostatice sau tensiunea de suprafaţă ghidează vârful care baleiază pe suprafaţa probei. În modul „tapping” (insertul din dreapta), vârful
consolei oscilează. Acest din urmă mod de lucru permite examinarea unor probe moi și fragile obţinându-se astfel rezoluţii ridicate.

cu vârful deplasându-se tangent peste suprafață (mod „tap-

FIGURA 1.14 ▲ Imagine de microscopie de forță atomică pentru
o singură moleculă de ADN. Această imagine a fost obţinută prin modul
contact prin care vârful ascuţit de baleiere „dansează” în sus și în jos după cum
se mișcă înainte și înapoi pe deasupra suprafeţei probei. Proba este așezată pe
o suprafaţă ultra-netedă de mică. O moleculă individuală de ADN produce ușor
suficientă denivelare pentru a fi detectată. Îngroșările aflate de-a lungul mol-
eculei de ADN sunt date de proteinele legate, iar aceste îngroșări produc chiar
o mai mare deplasare a vârfului care baleiază. Câmpul baleiat măsoară 540 nm
pe 540 nm. Lungimea moleculei de ADN variază între 0 și 40 nm. 3185.000.
(Prin amabilitatea Dr. Gabriela Bogordo, JPK Instruments AG, Berlin Germany.)
ping”) mult mai apropiat de folosirea bastonului de către un
orb (vezi Fig. 1.13, inserturi).
Pe măsură ce vârful se mișcă în sus sau în jos, pe axa z, în
timp ce traversează proba, mișcările sunt înregistrate de diodă
ca mișcări ale fasciculului laser reflectat. O piesă piezoelectrică
de sub probă se activează ca o buclă de răspuns la ce înregis-
trează dioda, pentru a muta proba în sus sau în jos, astfel
încât fasciculul laser să rămână centrat pe diodă. Dacă vârful
se afundă într-o depresiune, piesa piezoelectrică mișcă proba
în sus pentru a face compensarea, iar dacă vârful se mișcă în
sus pe o ridicătură, piesa compensează prin coborârea probei.
Curentul din piesa piezoelectrică este interpretat ca valoare
pe axa z, care împreună cu pozițiile de pe axele x și y dau
topografia probei la rezoluții moleculare, iar uneori atomice
(Fig. 1.14).
Un avantaj major al AFM în examinarea probelor biolo-
gice este acela că, spre deosebire de instrumentele optice de
rezoluție ridicată (TEM sau SEM), probele nu trebuie să fie
plasate în vid; ele pot chiar să fie în apă. Astfel, se pot realiza
imagini ale celulelor vii și ale mediului care le înconjoară.
Microscopie virtuală
Microscopia virtuală este un procedeu digital și reprezintă
o alternativă la examinarea unei lame prin folosirea unui
microscop optic.
Microscopia virtuală integrează microscopul optic con-
vențional, tehnologiilor digitale. Folosindu-se sisteme cu
 21

CAPITOLUL 1
scaner de lame servere

colecții de lame program de microscop

virtual

Metode
M ICR O S C O PIE
laborator de histologie și dispozitive mobile
FIGURA 1.15 ▲ Microscopie virtuală. Lamele sunt scanate folosindu-se scanere automate de lame, de mare rezoluţie, pentru a se crea fișiere
digitale care sunt depozitate de regulă în servere dedicate microscopiei virtuale. Lama virtuală este o reprezentare digitală a unei lame reale și poate fi
prezentată pe un ecran prin folosirea unui program specializat de vizualizare numit microscop virtual. Lamele virtuale sunt distribuite printr-o reţea de
computere sau pe internet pentru vizualizare la distanţă. De notat că lamele virtuale pot fi examinate individual sau în grup pe orice dispozitiv mobil,
cum ar fi tabletă sau telefon inteligent dotate cu aplicaţii de microscopie virtuală.

focalizare automată destinate achiziției imaginilor optice,
lamele sunt scanate pentru a se crea fișiere digitale bidimen-
sionale care sunt depozitate în servere dedicate microscopiei
virtuale (Fig. 1.15). Procesul de scanare implică achizițio-
narea de imagini de pe o lamă. Diferitele sisteme achiziți-
onează imaginile fie ca niște plăci, fie ca fâșii liniare care
sunt grupate împreună pentru a crea lama virtuală. Lama
virtuală este o reprezentare digitală a unei lame reale, care
poate fi observată de la distanță, fără un microscop optic.
Lamele sunt în mod obișnuit digitalizate într-un singur plan
focal (ex. cu lentila obiectiv 340), dar ele pot fi captate și în
planuri focale multiple.
Multe pachete de programe denumite microscoape vir-
tuale furnizează acces Web celor interesați pentru a examina
lame digitale pe orice dispozitiv din rețea la fel ca în micro-
scopia optică. Microscoapele virtuale oferă posibilități noi
pentru vizualizarea și manevrarea probelor, posibilități care
nu sunt disponibile pe un microscop optic standard. Acestea
includ următoarele:
• examinarea de la distanță a oricărei lame digitalizate, pe
orice dispozitiv din rețea (ex. tablete, telefoane inteligente
etc.) conținând un program de microscopie virtuală,
• mărire progresivă continuă, ca și micșorare (în mod nor-
mal de la 0,06 la 403),
• trecere ușoară de la foarte mică la foarte mare putere de mărire
fără afectarea câmpului observat sau a planului de focalizare,
• o imagine miniaturală de orientare (navigare) a întregii
lame, care indică în timp real localizarea imaginii din
ecran pe lamă (această imagine de orientare rămâne pe
ecran chiar în timpul măririi),
• o imagine integrală mărită care afișează măriri digitale su-
plimentare ale regiunii corelate cu poziția indicatorului pe
ecran și
• funcții suplimentare cum ar fi instrumente de extras, de
rotit sau de măsurare, matrice de ajustare a culorii și o op-
țiune de focalizare între diferite planuri ale imaginii pentru
acelea captate în planuri focale multiple.
Într-o perspectivă educațională, studenții care folosesc
microscopia virtuală sunt capabili să compare lamă cu lamă
imagini ale diferitelor țesuturi și/sau același țesut în dife-
rite colorații. O caracteristică importantă care nu este dis-
ponibilă cu microscoapele optice este legată de capacitatea
studenților sau instructorilor de a face adnotări personale
pe fiecare lamă virtuală, inclusiv desene de mână sau texte
dactilografiate. Aceste notații pot fi ușor salvate ca fișiere
suprapuse lamelor de microscopie virtuală. În plus, micro-
scopia virtuală facilitează abordări de studii colaborative sau
în echipă între diverși studenți care împart un microscop
virtual în contextul unui laborator (vezi Fig. 1.15).
Microscopia virtuală este utilizată și în educația patologică
sau în practica patologică (telepatologie). Ea poate fi reali-
zată în mediul virtual prin distribuirea lamelor virtuale online
între specialiștii anatomopatologi.
 22
Metode
HISTOLOGIE 101

PRIVIRE DE ANSAMBLU ASUPRA METODELOR UTILIZATE ÎN

HISTOLOGIE
w Histologia (anatomia microscopică) este studiul științific al structurilor microscop-
ice din țesuturi ale organelor corpului.
w Microscopia optică (pentru observarea lamelor) și microscopia virtuală (pentru vizual-
izarea probelor microscopice digitalizate pe un ecran de computer sau un dispozitiv
mobil) sunt cele mai obișnuite metode de deprindere a examinării celulelor, țesuturilor
Metode

și organelor la cursurile de histologie.

PREPARAREA HISTOCHIMIE ȘI CITOCHIMIE

ŢESUTURILOR w Procedurile histochimice și citochimice se bazează pe legările specifice ale unui colo-
w Secțiunile colorate standard rant la o componentă anume din celulă care prezintă activitate enzimatică intrinsecă.
CAPITOLUL 1

cu hemalaun și eozină (H&E)
obținute din țesut fixat cu
formol sunt probe examinate
cel mai adesea cu microscopul
optic, în studii histologice.
w Primul pas în prepararea unei
probe de țesut este fixarea, care
conservă structurile și previne
degradările enzimatice.
w În pasul al doilea, probele
sunt deshidratate, clarificate
și apoi incluse în parafină
sau rășini epoxidice pentru a
permite secționarea.
w În al treilea pas, probele sunt
montate pe o lamă de sticlă și
colorate pentru a permite exa-
minarea la microscopul optic.
w Eozina este un colorant acid (roz) și poartă o sarcină negativă netă. Ea reacționează
cu grupări cationice încărcate din celule și țesuturi, în special cu grupările amino din
proteine (structuri eozinofilice).
w Hemalaunul acționează ca un colorant bazic (albastru) și poartă sarcină pozitivă netă.
El reacționează cu grupările fosfat ionizate având sarcini negative din acizii nucleici
(structuri bazofile).
w Reacţia acid periodic-Schiff (PAS) colorează moleculele de carbohidrați sau bogate în
carbohidrați într-o culoare magenta, distinctă. Este utilizată pentru a dovedi prezența în
celulă a glicogenului, a mucusului în celule și țesuturi, a membranei bazale și a fibrelor
reticulare din țesutul conjunctiv.
w Imunocitochimia se bazează pe interacțiunea specifică dintre un antigen și un anticorp
conjugat fie cu un compus fluorescent (pentru microscopia optică), fie cu particule de
aur coloidal (pentru microscopia electronică). Se folosesc atât metode imunocitochi-
mice directe, cât și indirecte pentru a localiza un antigen țintă din celule sau țesuturi.
w Hibridizarea este o metodă destinată localizării de ARNm sau ADN prin interacțiunea
secvenței de interes cu un lanț complementar al unei probe de nucleotide.
w Procedeul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) utilizează coloranți fluorescenți
combinați cu probe de nucleotide pentru vizualizarea simultană a unor probe multiple.
Această tehnică este foarte utilizată în teste genetice.
w Autoradiografia folosește o emulsie fotografică întinsă peste o secțiune de țesut
pentru a localiza material radioactiv în țesuturi.

MICROSCOPIE
w Interpretarea corectă a imaginilor microscopice este foarte importantă deoarece organele sunt tridimensionale, în timp
ce secțiunile histologice sunt doar bidimensionale.
w Puterea de rezoluţie este capacitatea unei lentile a unui microscop sau a unui sistem optic de a produce imaginea separată
a două obiecte așezate foarte aproape unul de altul. Puterea de rezoluție a unui microscop cu câmp luminos (cel mai larg
utilizat de studenți și cercetători) este de aproximativ 0,2 mm.
w Pe lângă microscopul cu câmp luminos, există alte sisteme optice cum ar fi următoarele: microscopul cu contrast de fază, mi-
croscopul cu câmp întunecat, microscopul cu fluorescenţă, microscopul confocal cu baleiaj și microscopul cu lumină ultravioletă.
w Microscopul electronic de transmisie (TEM; puterea de rezoluție teoretică de 0,05 nm) folosește interacțiunea unui
fascicul de electroni cu o probă pentru a produce o imagine.
w Pașii din prepararea probei pentru TEM sunt asemănători cu cei din microscopia optică numai că ei necesită fixatori diferiți (glu-
taraldehidă și tetraoxid de osmiu), alte medii de includere (plastic sau rășini epoxidice) și compuși de contrastare (metale grele).
w Microscopul electronic de baleiaj (SEM; puterea de rezoluție 2,5 nm) folosește electronii reflectați sau respinși de supra-
fața probei, care sunt colectați de detectori și reprelucrați pentru a construi o imagine a suprafeței.
w Microscopul de forţă atomică (AFM; puterea de rezoluție de 50 pm) este un microscop non-optic care utilizează un
vârf ultra-ascuțit, punctiform în consolă (cantilever) care este purtat peste suprafața probei. Mișcările în sus și în jos ale
vârfului sunt înregistrate și transformate într-o imagine grafică.