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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGIA
NOVIEMBRE 2017
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AGRADECIMIENTOS
A mi directora de tesis Nadia por haberme guiado en cada momento y motivarme para
A mis padres Marta y Carlos, por darme la vida, por su apoyo incondicional,
comprensión, cariño a quienes espero recompensar un poquito con esta meta alcanzada.
A mis hermanas Carolina y Cristina por ser uno de los pilares de mi vida, por guiarme
y escucharme siempre.
obstáculos con alegría y porque sin ella no hubiera alcanzado este objetivo.
A Jorge y Gonzalo por el estímulo permanente y por compartir momentos de sus vidas
conmigo
A mis compañeros y amigos de siempre Bruno, Mariano, Vero, Nacho, Rodrigo, Naty,
A Juan Carlos, Tito, Mirta, Clarita y Carlita, por hacerme más simple este camino.
A Gaby, Eve, Rodrigo, Pao, Apa y Vero por ayudarme y apoyarme en el último y más
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Índice
I) Presentación a congresos
II) Glosario
III) Resumen
1) INTRODUCCIÓN
a) Historia de la Fibrosis Quística.
b) Incidencia.
c) Población no caucásica
d) Rol del CFTR en el transporte epitelial de fluidos y electrolitos.
e) Mutaciones.
f) Fisiopatología de la enfermedad pulmonar en pacientes con Fibrosis Quística.
g) Composición del moco respiratorio.
h) Mecanismo de defensa del epitelio respiratorio
i) Infección de las vías aéreas con Pseudomonas aeruginosa e inflamación.
j) Efecto de la inflamación de las vías aéreas y su relación con la enfermedad
pulmonar progresiva.
k) DNasa y elastasa.
l) Biofilm
m) Crecimiento planctónico frente a crecimiento en biofilm. La adherencia
primaria y el desarrollo del biofilm.
n) Regulación del proceso de formación de biofilm.
o) Pseudomonas aeruginosa.
p) Probióticos – Lactobacillus plantarum – Antecedentes.
2) HIPÓTESIS.
3) OBJETIVOS GENERALES.
4) OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
5) MATERIALES Y METODOS
A) Esputo
A1) Obtención de muestras.
A2) Estudio de la celularidad del esputo.
A3) Estudio microbiológico del esputo.
A3.1) Siembra y aislamiento.
A3.2) Examen macroscópico de las colonias
A3.3) Examen microscópico – Tinción de Gram.
A3.4) Identificación fenotípica.
A3.5) Antibiogramas.
A3.6) Conservación de cepas aisladas.
A4) Obtención de los sobrenadantes de Lactobacillus plantarum ATCC10241
A5) Obtención de polimorfonucleares por gradiente de Ficolle-Hipaque.
A6) Obtención de polimorfonucleares lisados (PMN lisados).
B) Efecto del sobrenadante de Lactobacillus plantarum sobre la patogenicidad de
Pseudomonas aeruginosa.
B1) Efecto sobre el biofilm de Pseudomonas aeruginosa.
B2) Efecto sobre la elastasa presente en el esputo.
B3) Efecto del sobrenadante de Lactobacillus plantarum in vivo.
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6) RESULTADOS Y DISCUCIÓN.
A) Esputo – Celularidad y bacterias identificadas.
B) Efecto sobre la elastasa.
C) Efecto del sobrenadante del cultivo de Lactobacillus plantarum in vivo.
D) Estudios histológicos de los pulmones.
7) CONCLUSIONES.
8) PROYECCIONES.
9) BIBLIOGRAFÍA.
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Los resultados obtenidos en este trabajo de investigación dieron lugar a
las siguientes presentaciones en congresos nacionales e internacional en
la modalidad póster:
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GLOSARIO
ABC: ATP-binding-cassette
AHL: Acil-homoserinlactonas
AMP: Adenosin monofosfato
ARN: Acido Ribonucleico
ASL: Líquidos de la superficie de las vías aérea
ATP: Adenosin trifosfato
BAL: Bacterias ácido lácticas
BNF: Bacilos no fermentadores
C: Cultivo
CFTR: (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) regulador de conductancia
transmembrana de la fibrosis quística.
DNA: Acido Desoxiribonucleico
DNasa I: Desoxirribonucleasa Humana I
DO: Densidad óptica
ENAC: canales de sodio epiteliales.
EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica
EPS: Exopolisacárido
FA: Filtrado ácido
FAO: Organización para la Alimentación y la Agricultura de las Naciones Unidas
FQ: Fibrosis Quística
GB: Glóbulos blancos
GR: Glóbulos rojos
HNE: Elastasa proveniente de los neutrófilos humanos
IFN- Interferon
IgA: Inmunoglobulina A
IL-1: Interleuquina 1
IL-8: Interleuquina 8
LB: Medio de cultivo Luria-Bertani
LBA: Lavado broncoalveolar
Lp: Lactobacillus plantarum
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LPS: Lipopolisacárido
MMP9: metaloproteinasa 9
MO: Macrofagos
MRS: Medio de cultivo
NE: Elastasa de Neutrofilos
O2: Oxigeno
OMS: Organización Mundial de la Salud
Pa qsc 101:Pseudomona aeruginosa mutante qsc 101
Pa: Pseudomonas aeruginosa
PCAs: péptidos catiónicos antimicrobianos
PCL: Líquido periciliar = ASL
pH: Potencial Hidrógeno
PMN: Polimorfonucleares
QS: Quorum Sensing
r.p.m: revoluciones por minuto
ROS: especies reactivas de oxígeno
Sa: Staphylococcus aureus
SF: Solución fisiológica
SLp: Sobrenadante de Lactobacillus plantarum
SLPI: Inhibidor de la Proteasa Secretora de Leucocitos
Th1: T helper 1
Th2: T helper 2
TIMP-1: del inhibidor tisular de mmp tipo 1
TNF-a: Factor de necrosis tumoral alfa
UFC/g : Unidades formadoras de colonias por gramo de tejido
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INTRODUCCION
“Ay, de aquel niño que al ser besado en la frente sabe salado. Él está
embrujado y pronto debe morir”. (Esta frase del folklore irlandés del siglo XV, atribuía el sabor salado
del sudor a una brujería). (Astudillo, Pedro 2010)
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INTRODUCCION
RESUMEN
resistente tanto a los antibióticos como a la respuesta inmune del hospedador. Los leucocitos
moco bronquial debido a que su gran aflujo y muerte en las vías aéreas lleva a la liberación de
como la elastasa que dañan el tejido pulmonar. La nebulización con DNasa para fluidificar el
síntomas de la enfermedad.
bacteriana y la que es liberada del esputo por la fluidificación con DNasa es inhibida por
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INTRODUCCION
Historia de la Fibrosis Quística
Nueva York) (Andersen DH, 1938), quien en 1938 publicó una revisión de las característica
de páncreas”, aunque ya había referencias en la literatura europea respecto a que “los niños
con una herencia autosómica recesiva. En aquella época el diagnóstico se realizaba por la
Gibson y Cooke en 1959 (Gibson LE, Cooke RE) diseñaron y publicaron la prueba de
estimulación del sudor, la cual permitía analizar las concentraciones electrolíticas de cloro en
en la secreción celular de cloro: Tsui LC et. al en 1985 localiza el gen responsable del defecto
anomalía genética más frecuente, que afectaba al 70% de los enfermos conocida como
F508del, consistía en una deleción de tres nucleótidos que originaba la alteración del
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INTRODUCCION
Incidencia
de 1:3.500 nacimientos (la prevalencia en la población general sería de 1/30 (Segal E. 1999).
sufren esta enfermedad, siendo una de las enfermedades genéticas letales más comunes entre
los caucásicos: 1 cada 3.500 niños que nacen por año en EEUU padecen FQ y tienen una
Existe una gran variabilidad entre los distintos países: en Quebec (Canadá) se reporta
una incidencia de 1 por cada 891 recién nacidos vivos (Canadian Patient Data Registry
Nacional Report, 1995); en Finlandia es de 1 por cada 25.000 nacimientos (Kollberg H, 1982);
en el Reino Unido es de 1 por 2.500 nacimientos (Dodge JA, 1988). En España, en el año
et al, 1994) mientras que en Cataluña 1 por cada 4.510 nacimientos (Telleria J et al, 2002).
Población no caucasiana
En los grupos no caucasianos las cifras son muy inferiores; así, en la población de
raza negra americana se indica una incidencia de 1 por cada 17.000, en la raza oriental de
Hawai 1 por cada 90.000 y en Japón de 1 cada 320.000 a 680.000 nacidos vivos (Casals T,
2003). Estos resultados pueden oscilar debido a factores genéticos o carencia de métodos
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INTRODUCCION
diagnósticos para la detección de la enfermedad, ya que en estos países existen otros
El gen CFTR de 230 kb está en el brazo largo del cromosoma 7 y se compone de 27 exones
que codifica una proteína de 1480 aminoácidos denominada CFTR, situada en la porción
apical de la membrana de las células epiteliales, que se expresa en las células secretorias,
senos paranasales, pulmones, páncreas, hígado y tracto reproductivo. Funciona como un canal
proteína CFTR en las células epiteliales se inicia con la transcripción en el núcleo celular de
un ARN mensajero, con modificaciones durante su paso por el Retículo Endoplásmico que
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INTRODUCCION
ABC). Contiene dos dominios de nucleótidos que se unen e hidrolizan ATP, dos conjuntos de
segmentos que abarcan la membrana que forman el canal y un dominio regulador (R) central.
El dominio R, único para la proteína CFTR, está altamente cargado con numerosos sitios de
Está formada por dos dominios transmembrana (TM1 y TM2), cada uno de los cuales
atraviesa 6 veces la doble capa lipídica de la membrana celular para anclar la proteína; dos
fosforilación (nueve en total), dependiente de AMP cíclico, mediante los cuales controla la
actividad del canal. El primer dominio (TM1) es el soporte físico del canal. La abertura y
cierre del canal se activa por fosforilación del domino R por una proteinquinasa dependiente
del AMP cíclico; parece ser que la fosforilación parcial de R al mismo tiempo que ocurre la
gradiente mientras que la fosforilación parcial de R y de NBF2 conduce al cierre del canal. El
CFTR normal funciona también como regulador de canales de Na, estableciendo un balance
entre absorción de Na+ y secreción de HCO3- para hidratar la superficie de la vía aérea
(Ostedgaard LS et al 2001).
del pulmón, páncreas, intestino, ductos biliares, riñón, glándulas salivales y del sudor, testículo
y útero. El CFTR normal funciona como un regulador de los canales de Na + y Cl- dependiente
entre la absorción de Na+ y la secreción de Cl- y HCO3- para hidratar la superficie de las vías
aéreas.
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INTRODUCCION
Como se observa en la figura 2 el epitelio de las vías aéreas es el encargado del
del ASL. El mal funcionamiento del CFTR daña el transporte de electrolitos lo que conduce a
una disminución de las defensas pulmonares ya que se daña el clearence mucociliar de las
Figura 2: Modelo de transporte de las vías aéreas de iones Cl- y de iones Na+ de las glándulas submucosas
A) y de la superficie del epitelio B) (PCL = periciliary fluid = ASL) (Kunzelmann and Schreiber, 2012)
del epitelio respiratorio y de las glándulas submucosas secretoras de moco; se produce una
acumulación de secreciones viscosas y purulentas en las vías aéreas de los pacientes con FQ,
tapones mucosos y la dilatación de los ductos y túbulos de las glándulas submucosas que están
presentes en estos pacientes y que aumentan la viscosidad del moco del epitelio respiratorio y
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INTRODUCCION
de las glándulas submucosas secretoras de moco. Por lo tanto la falta de secreción de iones Cl-
a través de la membrana apical de las células epiteliales de las glándulas submucosas conduce
agua en las secreciones por efecto osmolar lo que aumenta la viscoelasticidad del moco),
Mutaciones
mutaciones han sido identificadas con una frecuencia del 0,1 % de los alelos conocidos. Las
restantes mutaciones son muy raras o limitadas a uno o unos pocos pacientes. La mutación
más común y la primera que ha sido identificada es la deleción de tres pares de bases que
insertarse en la membrana de la célula donde funciona como canal de Cl-. Como toda
plegada, se procesa a través del aparato de Golgi para ser finalmente liberada en la membrana
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INTRODUCCION
Figura 3: Funcionamiento del gen CFTR en personas sanas (McKone E.F. et al, 2004)
Figura 4: 5 clases de mutaciones del gen CFTR (Ronald L. Gibson el al. 2003)
La mutación Clase I (ejemplo: G542X) (No hay síntesis): Es una mutación que
mensajero (RNAm) o de una proteína anormal, la cual es rápidamente degradada. Hay una
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INTRODUCCION
Las mutaciones Clase II (ejemplo: ∆F508) (Bloqueo del proceso): resultan de una
más común; consiste en una deleción de 3 nucleótidos que tiene como consecuencia la pérdida
del aminoácido fenilalanina en la posición 508. Cuando la proteína CFTR con la mutación
componente celular reconoce que esta proteína no tiene la conformación correcta, detecta esta
La deleción delta 508 es la causa más común de la Fibrosis Quística que se produce
modifica ya que codifica tanto con el triplete ATC (que tenía) como con el ATT (resultante
cloro. Esta mutación genera una proteína inmadura que llega a la membrana celular, pero el
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INTRODUCCION
canal de cloruro no está debidamente activado, lo que en consecuencia deriva una proteína
correctamente localizada y regulada pero tiene un defecto en la conductancia del cloro. Las
celular y el canal de cloruro está activado, pero hay una disminución en la conductancia, por lo
síntesis de CFTR, con una clara tendencia a presentar una enfermedad leve, con test de sudor
en valores límites y con una secreción intestinal residual de cloro. Esta mutación resulta en
mutación de una Citosina por una Timina en la posición 3849 + 10kb. En esta mutación existe
un pequeño porcentaje de empalmes correctos que dan proteínas CFTR funcionales y activas,
Los mecanismos de defensa del pulmón comprenden la tos, las barreras anatómicas,
los cambios aerodinámicos y los mecanismos celulares. El tracto respiratorio inferior está
protegido por el mecanismo de defensa mucociliar local que comprende la integridad del
epitelio ciliado (que se mueve de manera coordinada impulsando el mucus desde las vías
aéreas hacia la orofarínge donde son ingeridos o expulsados), el fluido periciliar (que es
esencial para el clearence mucociliar y para optimizar el medio en el cual son efectivos los
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INTRODUCCION
agentes antimicrobianos) y el mucus (actúa como barrera física y química contra los
Las células ciliadas y las células Globet son las más importantes en el mecanismo de
defensa mucociliar local. El epitelio ciliado asiste a la defensa mucoliar local modulando el
función del epitelio ciliado es el clearence del mucus desde el tracto respiratorio inferior a
través del bateo coordinado de las cilias. Los péptidos antimicrobianos (Travis SM et al, 1999)
son los principales mediadores de la muerte de las bacterias; incluyen péptidos como la
inespecíficas son el complemento, proteasas, IgA y las defensinas (Bals R et al, 1999) que son
péptidos antimicrobianos ricos en cisteína: las Alfa-Defensinas, que están en los gránulos
secretorios de los granulocitos y que actúan a nivel de las superficies mucosas de las vías
glicoproteínas de alto peso molecular (mucinas), 3-5% de lípidos y 95% de agua (Houtmeyers
E et al, 1999).
de los PMN y de las bacterias, que se puede unir a proteína, mucinas y lípidos aumentando la
viscosidad del moco, lo que lleva a un transporte ineficiente del mucus y que sirve de sustrato
para formar el biofilm bacteriano. La mucina es producida por las células Globet y las
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INTRODUCCION
exocitosis. La mucina liberada rápidamente se expande y se hincha por hidratación; todo este
contenido de agua y del pH; todos estos factores dependen del transporte de iones y agua
El mucus protege, hidrata y humidifica las vías respiratorias, actúa como una barrera
se adhieren a la capa de mucus donde son depuradas por los PMN y los macrófagos. También
actúan en el mucus los péptidos antibacterianos como la Lisosima junto con la antiproteasas y
las Inmunoglobulinas. Luego las células, bacterias y partículas son eliminadas de las vías
(aclaramiento mucociliar) (figura 6). Las células epiteliales secretan múltiples sustancias con
como una barrera inmunitaria innata. Los macrófagos, linfocitos B y T, neutrófilos y también
células epiteliales representan los componentes celulares de los sistemas inmunitarios (innato
y adaptativo).
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INTRODUCCION
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INTRODUCCION
Infección de las vías aéreas con Pseudomonas aeruginosa e inflamación
superficie de las vías respiratoria (ASL), que rompe el mecanismo de defensa mucociliar local:
infección crónica de las vías aéreas de pacientes con FQ por P.aeruginosa (verde claro: capa
de mucus; amarillo: células epiteliales de las vías aéreas; líquido periciliar o ASL: por debajo
PMN da como resultado una masa mucopurulenta con hipoxia (gradiente todo azul).
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INTRODUCCION
mucus.
creación de macrocolonias.
pulmonar progresiva
La FQ afecta principalmente las vías aéreas y las glándulas submucosas. Los pulmones
de los recién nacidos son estructuralmente normales a excepción del aumento del diámetro
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INTRODUCCION
acindar de las glándulas mucosas de la tráquea, lo que sugiere tapones mucosos como
evidencia de inflamación o infección. Con el tiempo, la infección se hace crónica con una
inflamación intensa. Las secreciones respiratorias de estos pacientes poseen alta concentración
las vías aéreas está dominada por los PMN con IL-8 y elastasa elevadas. Las vías aéreas se
las vías aéreas (Conesea M et al, 2003), con una respuesta inflamatoria prolongada la cual es
incapaz de eliminar las bacterias, especialmente Pa. Los mediadores para el influjo de PMN
son la IL-8, el factor de necrosis tumoral alfa, la IL-1, entre otros. La IL-8 es producida por
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INTRODUCCION
fibroblasatos), los macrófagos y los neutrófilos; es la quimiocina más importante de los PMN
en las vías aéreas de FQ. El macrófago alveolar tiene un rol central en el reclutamiento de los
neutrófilos en el pulmón ya que ellos producen IL-8 en respuesta a cualquier estímulo exógeno
Alfa estimula el proceso oxidativo y secretorio de los PMN y éste junto con la IL-1 pueden
gatillar a los PMN para una mayor respuesta a los quimiotácticos (Gibson RL et al, 2003).
pulmonar de la FQ (Figura 9)
El LPS bacteriano puede activar tanto a los macrófagos (MO) como a las células
epiteliales de las vías respiratorias, que a su vez producen IL-8, TNF-a e IL-1. Estos
neutrófilos y del reclutamiento en las vías respiratorias. Las citocinas secretadas por los
Macrófagos activados favorecen el desarrollo de una respuesta Th1 o una respuesta Th2. La
respuesta Th2 en la FQ está delimitada por una línea. Posiblemente en la FQ está afectada la
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INTRODUCCION
secreción de IFN- por las células Th1 y la activación de la actividad bactericida de los
Macrófagos.
Cualquiera que sea el mecanismo que lleve a una inflamación pulmonar donde
predominen los PMN, éstos no son capaces de eliminar la infección bacteriana (“fagocitosis
Los PMN activados son las primeras células efectoras en la patogénesis de la FQ. Los
PMN liberan cantidades masivas de Elastasa y otras proteasas como la alfa-1 antitripsina y el
PMN liberan grandes cantidades de DNA que contribuye a incrementar la viscosidad de las
quimiotácticos promueve la migración de los PMN en las vías aéreas. Una vez que llegaron,
Los PMN contienen proteasas en sus gránulos, que son críticas en la respuesta de los PMN
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INTRODUCCION
durante la infección. Sin embargo, grandes cantidades de proteasas escapan de los PMN
debido a la fagocitosis frustada de los mismos; entre ellas está la elastasa y la metaloproteinasa
9 de la matriz (MMP-9). Las metaloproteasas de matriz (MMP) son enzimas proteolíticas que
que la elastasa proveniente de los neutrófilos humanos (HNE) sería capaz de activar una pro-
MMP-9 y degradar TIMP-1; por lo que estos autores plantean como estrategia viable para
DNAasa y elastasa
respiratorias, que impide el aclaramiento del moco de las vías aéreas que aumenta la
viscosidad del esputo. ADN tiene una propiedad inherente para formar un gel viscoso y las
hebras de ADN polimerizadas junto a las glicoproteínas mucosas son responsables de las
actúa como un potente estimulador de la producción de IL-8 por las células epiteliales de las
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INTRODUCCION
La combinación de inflamación e infección determina obstrucción y destrucción
pulmones de los pacientes fibroquísticos se generan zonas fibróticas que dan lugar a las
moco. Este moco, que es más viscoso y espeso que el normal, se retiene en dichos bronquios,
haciendo muy costosa la expectoración y sirviendo también como medio de cultivo para que
el tratamiento de estos pacientes infectados son el tratamiento antibiótico precoz por vía
recombinante humana (Dornasa pancreática o Pulmozime) (Dosis: 2,5 mg (2 ml) 1 vez por
día) para fluidificar el moco eliminándolo por maniobras kinesiológicas para disminuir así la
incrementa la actividad elastolítica del esputo en la FQ “in vitro” (Cantin AM, 1998) como así
de la misma y debe incorporarse en la rutina diaria para facilitar la eliminación del moco,
disminuyendo la carga bacteriana y la proteólisis y mantener lo más limpio posible las vías
las vías aéreas respiratorias incrementan la resistencia al flujo aéreo con la necesidad de mayor
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INTRODUCCION
trabajo respiratorio. Se desencadena un proceso de inflamación, infección y obstrucción que se
(DNasa hr) se administra en forma de aerosol (nebulizaciones) a estos pacientes todos los días
polimérico reduciendo así la viscosidad del esputo en los pacientes con FQ, lo que se asocia a
una mejora en la obstrucción del flujo de aire y una disminución en el número de infecciones
Los neutrófilos también liberan elastasa (NE) que degrada la elastina, fibronectina,
que ejerce un efecto estimulador sobre las glándulas de las vías respiratorias aumentando la
Los efectos beneficiosos de las nebulizaciones con DNasa se deben a que incrementa
la actividad elastolítica del esputo ya que degrada el ADN extracelular polimérico reduciendo
así la viscosidad del esputo en los pacientes con FQ. Los efectos adversos del tratamiento con
La Elastasa es una serina proteasa que se encuentra en los gránulos azurófilos de los
bacteriano (LPS) (Roghanian A et al, 2008). Es una enzima degradativa que actúa
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INTRODUCCION
intracelularmente para degradar los patógenos ingeridos o extracelularmente para degradar
pacientes con FQ se libera más cantidad de elastasa a los tejidos lo que lleva a una mayor
Biofilm
biofilm es el agua, que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y
de las células bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente por
exopolisacáridos secretados por las propias células que forman parte del mismo. En menor
procedentes de la lisis de las bacterias. Las bacterias embebidas en esta matriz de biopolímero,
en comparación con las células planctónicas, están muy bien protegidas contra los antibióticos
y otros agentes antimicrobianos, así como de las defensas del hospedador (protegidas de la
acción de los anticuerpos y del ataque de las células fagocíticas) y por lo tanto son muy
biofilms de las infecciones agudas es su respuesta a tratamientos antibióticos. Mientras que las
infecciones agudas pueden ser eliminadas tras un breve tratamiento antibiótico, las infecciones
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INTRODUCCION
recurrentes. Esto se debe a que las bacterias del biofilm pueden ser hasta 1000 veces más
resistentes a los antibióticos que esas mismas bacterias crecidas en medio líquido.
El mecanismo de formación del biofilm (Figura 11) consta de varias etapas. En la etapa
inicial las células que están en estado planctónico (o sea que se mueven libremente) se
adhieren en forma reversible a una superficie o sustrato. En esta etapa las bacterias todavía
son susceptibles a los antibióticos lo que explica el éxito de la profilaxis en esta etapa. La
motilidad brindada por los flagelos y las fimbrias son importantes en bacterias gram-negativas
(P. aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella enteritidis); bacterias gram-
bacterias (las bacterias comienzan a dividirse), la formación de microcolonias (las células hijas
se extienden alrededor del sitio de unión formando microcolonias). En una etapa posterior
microcolonia que constituye la matriz del biofilm y forma estructuras similares a setas
matriz del biofilm se desprenden del mismo para poder colonizar nuevas superficies, cerrando
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INTRODUCCION
el proceso de desarrollo de propagación del biofilm. La matriz del biofilm maduro puede
contener canales llenos de agua a través de los cuales las bacterias móviles pueden colonizar
Figura 101: Formación de biofilm para Pseudomonas aeruginosa. (Høiby N et al. 2011).
que permite a la bacteria sentir la densidad de población existente. Para bacterias gram-
péptidos. Cuando se acumula en el medio una suficiente cantidad del autoinductor se activa un
receptor específico que altera la expresión de genes afectando a distintos fenotipos (Reading
NC et al. 2006)
Enterobacterias.
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INTRODUCCION
El porcentaje total de pacientes (todas las edades) que tenían al menos un cultivo en
inmunitarias en niños pequeños, la infección parece ocurrir mucho antes de lo que se creía
anteriormente. Hasta el 80% de los pacientes con FQ son finalmente infectados con este
organismo, y la adquisición del organismo está asociada con el deterioro clínico. La fuente de
lo que sugiere la adquisición de depósitos ambientales, y sólo rara vez los pacientes con FQ
cepas genéticas pueden colonizar diferentes sitios anatómicos en la vía respiratoria de la FQ.
se sugirió por primera vez debido a las señales de detección de quórum que los organismos
hipoxia local dentro de las placas de moco en las vías aéreas incrementa la producción de
Recientemente se ha informado de que las variantes del fenotipo resistentes a los antibióticos
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INTRODUCCION
de P. aeruginosa con una mayor capacidad para formar biofilms surgen a alta frecuencia en los
(FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) han declarado que los probióticos tienen
el potencial para proporcionar beneficios para la salud y que las cepas específicas son seguras
para su uso en humanos (Food and Agriculture Organization of the United Nations and World
Los probióticos se pueden definir como organismos vivos no patógenos que cuando
colonizan partes del cuerpo humano como bacterias comensales. En el cuerpo humano
colonizan tres regiones anatómicas: cavidad oral, los intestinos y el tracto vaginal.
(Bernardeau M et al, 2006). Las especies de Lactobacilos son las primeras bacterias en ser
descriptas como probióticos ya que ejercen un amplio rango de actividades que promueven la
salud, tal como mejora en la resistencia a los patógenos, reduce los niveles de colesterol en el
suero, mejora la diarrea inducida por antibióticos (Reid G et al, 2003); ejerce efectos en la
inmunomodulación del sistema inmune ya que pueden interactuar con las células inmunes
mucosas o las células epiteliales que recubren la mucosa para modular funciones específicas
del sistema inmune mucoso (Wells JM, 2011). Los Lactobacilos juegan un rol importante para
mantener la salud vaginal en las mujeres ya que producen ácido láctico, peróxido de
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INTRODUCCION
El uso de bacterias inofensivas para desplazar a organismos patógenos es una
alternativa para combatir las infecciones. La aplicación de esta estrategia conocida como
estimuladores de IL-12 potenciando así la inmunidad mediada por células; la interacción con
patógenos, resulta en una alternativa muy prometedora en la lucha contra las infecciones
Lactobacillus plantarum en las heridas crónicas infectadas, para interferir las infecciones
Unidad de Cirugía Plástica y Quemados del Hospital Centro de Salud de San Miguel de
Tucumán. El Dr. Juan Carlos Valdéz y su grupo de colaboradores realizaron estudios básicos y
clínicos de interferencia bacteriana entre Unidad de Cirugía Plástica y Quemados del Hospital
ratones y en úlceras crónicas estudiando su impacto en las células del lecho ulceroso (Peral
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INTRODUCCION
PMN y de otras células involucradas en la lesión (Valdez JC et al, 2005) y (Ramos A et al,
aeruginosa promueve procesos inflamatorios que son citotóxicos para los PMN y que el
actividad microbicida y menos lesivos para el tejido, mientras que disminuye la inflamación y
En base a los resultados obtenidos por este grupo de investigadores sobre la actividad
aeruginosa, se podría reproducir la infección pulmonar con esta bacteria en modelos animales
e investigar los mecanismos celulares y moleculares por los cuales la bacterioterapia revertiría
que se produce en este modelo animal. La infección pulmonar con P. aeruginosa, aunque con
la limitación de no ser una infección de años de cronicidad que se observa en FQ, serviría para
ensayos biológicos de sustancias que puedan paliar esta afección. Se podría proyectar el
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HIPOTESIS
Hipótesis
con Fibrosis Quística, para adicionar sus propiedades bacteriolíticas e inhibitorias del biofilm
calidad de vida y sobrevida del paciente ya que favorece la depuración pulmonar realizada por
los kinesiólogos.
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OBJETIVOS
Objetivos Generales
pues son refractarias al tratamiento con antibióticos y a los mecanismos de defensa del
sistemas de salud.
La estrategia utilizada hoy en día para la eliminación de las bacterias en estos pacientes
consiste en el tratamiento antibiótico precoz, cuyo éxito se basa en la ausencia del modo de
donde las bacterias ya están establecidas como biofilm, su eliminación es imposible, salvo de
con DNasa recombinante humana para fluidificar el mucus, de modo que se lo pueda eliminar
más ampliamente utilizado para reducir la viscosidad del esputo. La DNAsa digiere el DNA
extracelular polimérico reduciendo así la viscosidad del esputo en los pacientes con FQ.
Objetivos específicos
infecciones respiratorias pulmonares por bacterias productoras de biofilm con alta morbi-
mortalidad.
no puede eliminar a las bacterias en biofilm, sino que exacerba la enfermedad. Esto se debe a
que los PMN muertos, tras una fagocitosis frustrada, liberan DNA lo que aumenta la
viscosidad del moco y sirve de sustrato para el biofilm bacteriano. También liberan radicales
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OBJETIVOS
libres y enzimas tales como la elastasa, que contribuyen a la ruptura del tejido circundante y
son básicos en la patogénesis del daño estructural progresivo de las vías aéreas.
es altamente eficaz, motivo por el cual es necesario optimizar los tratamientos para tratar de
erradicarlas
En trabajos previos se demostró que los cultivos de Lactobacillus plantarum poseen una
disminuían la carga bacteriana en heridas crónicas. Esta acción está basada en la inhibición de
Aislar y tipificar las cepas bacterianas del moco de pacientes con Fibrosis Quística.
Lactobacillus plantarum.
lechos de mucus de pacientes con Fibrosis Quística; b) lechos de neutrófilos humanos aislados
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OBJETIVOS
Evaluar la liberación de elastasa del mucus de pacientes nebulizados y no nebulizados
con DNasa, después del tratamiento In Vitro del moco con DNasa y la inhibición que podría
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MATERIALES Y METODOS
Materiales y Métodos
ESPUTO
kinesiológicas para la depuración de las vías aéreas, con y sin nebulización previa con DNasa
Para fluidificar el moco los pacientes fueron previamente nebulizados con DNasa
Los pacientes que no recibían DNasa también fueron nebulizados pero sólo con
solución fisiológica más salbutamol veinte minutos antes de comenzar la terapia kinesiológica.
La cavidad bucal de los pacientes fue higienizada con un cepillado dental y buches con
etc) para la depuración de las vías aéreas y la toma de muestra del moco.
transportó en una conservadora con frío hasta el laboratorio. Cabe aclarar que las muestras de
Las muestras de esputo de cada paciente fueron utilizadas como lecho para el
mM de DTT preparado con H2O estéril) que disgrega la mucosidad y no afecta su viabilidad.
92
MATERIALES Y METODOS
Ética: La utilización de las muestras se realizó con la autorización del Comité de Ética
del Hospital del Niños Jesús y con el consentimiento informado de los padres o tutores de los
pacientes.
La celularidad y el estado de las células del esputo fueron estudiados en frotis teñidos
con May Grünwal- Giemsa. Técnica: realizar extendidos del esputo con un ansa sobre
llame de un mechero. Una vez secos colorear con la técnica de tinción de Gram. Contar 200
células por frotis con microscopia óptica de inmersión (100x) y determinar la cantidad
metodología microbiológica de rutina para bacterias que se aíslan del moco de pacientes con
92
MATERIALES Y METODOS
Las muestras se sembraron en los siguientes medio de cultivo por estría manteniendo
Agar chocolate
Mc Conkey (Britania)
37°C en estufa.
Luego de la incubación se observaron las colonias que crecieron en las cajas de Petri .
grandes grupos de bacterias: Bacterias Gram (+) y Bacterias Gram (-). Las bacterias Gram (+)
se tiñen de color violeta ya que retienen el Cristal Violeta tras la decoloración y las bacterias
Gram (-) se colorean de rojo rosadas ya que al no retener el Cristal Violeta tras la decoloración
se colorean con la Fucsina básica. Esta tinción es insuficiente para hacer diagnóstico
bacteriológico, pero es fundamental para dar una presunción rápida de los agentes patógenos
Técnica de Gram: Se preparó un extendido fino de la colonia en estudio: Se colocó una gota
de solución fisiológica (SF) en un portaobjeto limpio y desengrasado. Con ansa se tomó una
pequeña cantidad de la colonia y se formó una suspensión homogénea con la SF. Se dejó secar.
92
MATERIALES Y METODOS
Se fijó el material al portaobjeto por calor. Se pasó el portaobjeto 3 veces durante unos
Primer colorante: se cubrió los extendidos completamente con Violeta de Genciana y se dejó
actuar durante 1 min. Se añadió Lugol. Se decoloró rápidamente con etanol-acetona. Se lavó
Segundo colorante: se cubrió los extendidos con Fucsina básica (colorante de contraste) y se
dejó actuar por 3 min. Se lavó con agua corriente. Se dejó secar. Se observó al microscopio
Figura 12: Estructura de la pared celular bacteriana de (a) Gram positivas y (b) Gram negativas.
92
MATERIALES Y METODOS
c.4.- Identificación fenotípica
un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Los resultados de los test se analizaron según clasificaciones actualizadas obtenidas del
(-), productores de biofilm. Para la identificación de los bacilos Gram (-) se realizaron las
propiedades bioquímicas: TSI, urea, citrato, fenialanina, SIM, Dnasa, cetrimide, agar P y F.
Para la identificación de los cocos Gram (+), catalasa negativa se realizó sensiblidad a
optoquina, prueba de las cadenas, PYR, LAP, NaCl 6,5%; para los cocos Gram positivo,
Citocromo Oxidasa: Este test es fundamental para diferenciar dos grupos de bacterias
negativa) y las no fermentadoras de glucosa, oxidasa positiva, como es el caso del Género
tanto, es importante para identificar a los organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios obligados.
Técnica: con las colonias Gram (-) realizar suspensiones densas en 0,5 ml de solución
92
MATERIALES Y METODOS
fenilendiamina. Interpretación: Positivo: cuando la muestra toma color púrpura al cabo de diez
segundos.
Con las cepas oxidasa positivo realizar las pruebas bioquímicas para bacilos Gram (-) no
fermentación más sensible como el de Hugh y Leifson. Este medio difiere de los medios de
Peptona, que tiende a elevar el pH del medio y puede neutralizar los ácidos débiles producidos
por los bacilos no fermentadores; la mayor concentración de hidratos de carbono sirve para
aumentar la producción bacteriana de ácido. Y la consistencia semisólida del agar permite que
los ácidos formados en la superficie difundan por todo el medio, facilitando la visualización
Técnica: Se utilizaron dos tubos con medio O/F para cada cepa, previamente fundidos a baño
maría, y se adicionó Glucosa al 1%. Se dejó enfriar y se sembraron ambos tubos por punción.
A uno de los tubos, se lo cubrió con 1 cm de parafina fundida para poder observar el fenómeno
92
MATERIALES Y METODOS
Interpretación: Amarillo -Verde Azulado---- Oxidativo
b) TSI agar (Triple Sugar Iron): Es un medio diferencial que permite distinguir bacterias Gram
Lactosa y Sacarosa, con formación de ácido que es detectada por el Rojo de Fenol (se produce
viraje del indicador de rojo a amarillo); la producción de Acido Sulfhídrico por reducción del
Sulfato de Sodio, que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el Sulfuro de
analizar una única especie bacteriana tomada de una sola colonia aislada en placas de agar.
37°C.
Interpretación:
fermenta azúcares.
produce gas.
92
MATERIALES Y METODOS
c) Hidrolisis de Bilis Esculina: Medio para identificar microorganismos capaces de
hidrolizar la Esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde
oliva hasta negro. Se sembró por estría y se incubó a 37°C durante 24-48 h.
Interpretación:
durante 24-48 h.
Interpretación:
del pigmento.
Interpretación:
fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a
fenómenos de difusión.
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MATERIALES Y METODOS
f) Cetrimide: se usa para la identificación selectiva de Pseudomonas aeruginosa (P.
aeruginosa) cuyo crecimiento no es inhibido por Cetrimide. Se sembró por estría y se incubó a
37°C 24 h.
Interpretación:
g) Medio FLN:
Interpretación:
h) Medio M-N:
Permite detectar la reducción de NO3- a NO2- o bien a N2 y además si hay movilidad. Se sembró
Interpretación:
Interpretación:
Positivo: P. aeruginosa.
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MATERIALES Y METODOS
Negativo: otros bacilos no fermentadores (BNF).
Interpretación:
Negativo: P. aeruginosa.
c.5.- Antibiogramas
Para determinar la sensibilidad de las cepas bacterianas aisladas de las muestras de esputo
frente a los diferentes antibióticos se realizó el método de difusión en agar con monodiscos
Procedimiento: Para cada cepa, se preparó una suspensión utilizando como patrón la escala
0,5 de Mc Farland. Se sembró por diseminación utilizando hisopos estériles embebidos en las
suspensiones en placas de Petri que contenían medio de cultivo Mueller-Hinton agar de una
altura de 4 mm. Se colocaron los discos de antibióticos (Britania) siguiendo los patrones para
cada tipo de microorganismo, teniendo en cuenta las normativas de la CLSI (Clinical and
Los Discos utilizados para BNF fueron: Aztreonam (30 µg), Imipenem (10 µg),
Cefepime (30g), Ceftazidima (30 µg), Piperacilina (100 µg), Gentamicina (10 µg), Amikacina
(30 µg), Ciprofloxacina (5 µg), Ceftazidima+Ác. Clavulánico (30/10 µg), Meropenem (10
inhibición. Para determinar si la cepa era sensible o resistente a los antibióticos, se midieron
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MATERIALES Y METODOS
los diámetros en milímetros de cada halo y usando una tabla de valores (20º Curso intensivo
ml de BHI caldo adicionado con glicerol 40% para las Pseudomonas. Se conservaron a -20°C
U.N.T.
Se trabajó con una cepa de Lactobacillus plantarum ATCC 10241 (Lp) obtenida del
Química y Farmacia, U.N.T. Se realizó cultivo overnight en medio MRS (Man Rogosa
8000 rpm y filtrado con filtros millipore de 0,22 m para obtener un sobrenadante libre de
componentes celulares más importantes en el esputo de paciente con FQ, por lo que fueron
utilizados como lechos para el desarrollo de biofilm y para los ensayos de Elastasa en
92
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron PMN de sangre circulante purificados por gradiente en Ficoll-Hypaque y
Dextrano tipo 500 (Sigma, St. Louis MO, USA) al 6% en solución fisiológica. Los eritrocitos
(densidad: 1074-1077) más 5 ml de sangre venosa heparinizada, en forma suave con flujo
constante de modo que quede una interfase neta. Y centrifugar 30 minutos a 3000 rpm.
inversión suave. Dejar sedimentar durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Y separar
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MATERIALES Y METODOS
sobrenadante (PMN) y descartar el pellet. Depositar el sobrenadante en frascos de 50 ml y
destilada fría estéril; agitar con pipeta Pasteur durante 20 segundos y agregar 0,5 ml de
Bovino Fetal. Realizar el recuento de PMN con Azul Tripán en cámara de Neubauer.
Los PMN obtenidos como se indica en el párrafo anterior fueron lisados por congelación
PATOGENICIDAD DE P. AERUGINOSA
aeruginosa comparándolo con el uso de la DNasa recombinante humana. Para determinar los
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MATERIALES Y METODOS
III.- Efecto del sobrenadante in vivo. Las modificaciones histológicas del pulmón
técnica de O´Toole y Kolter (1998). Para este ensayo se utilizaron cultivos overnight de P.
aeruginosa los cuales fueron diluidos 1:7 con medio LB (Luria Bertoni). En todos los casos se
de los pacientes con FQ, para contar con cepas recientemente aisladas. La evidencia
epidemiológica en nuestro medio revela una alta incidencia de infecciones crónicas e indica a
ADN proveniente del hospedador, principalmente de los PMN. Con el objeto de imitar
parcialmente lo que ocurre in vivo, se dejó crecer el biofilm P. aeruginosa sobre distintos
Técnica:
1) Lechos de mocos de los pacientes (sin diluir y diluidos 1:4 con DDT).
3) Sin lecho.
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MATERIALES Y METODOS
b) Luego colocar en todos los pocillos 100 ul de una suspensión de P. aeruginosa, que
tenga una DO=0.7 leído a 540 nm en lector de ELISA e incubar 1 hora (fase planctónica). El
d) Lavar 2 veces con 200 ul de PBS, aspirando el contenido de cada pocillo. Se lavó 3
veces con PBS descartando cada vez el sobrenadante para eliminar las bacterias
e) Eluir 2 veces con 200 ul de etanol 95% (v/v) y transferir a tubo de hemólisis con 1,6
ml de etanol.
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MATERIALES Y METODOS
Figura 14: Biofilm de P aeruginosa en medio LB, TSI no fermentativo y Esquema de placa de PVC
de 96 pocillos.
Técnica:
1) Lechos de mocos de los pacientes (sin diluir y diluidos 1:4 con DDT).
3) Sin lecho.
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MATERIALES Y METODOS
b) Luego colocar en todos los pocillos 100 ul de una suspensión de P. aeruginosa, que
tenga una DO=0.7 leído a 540 nm en lector de ELISA diluida 1:7 en medio LB e incubar 6
horas (Formación del biofilm). El biofilm formado luego de esta incubación es dependiente
agua destilada. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente (tapar para evitar la evaporación).
d) Lavar 2 veces con 200 ul de PBS, aspirando el contenido de cada pocillo. Se lavó 3
veces con PBS descartando cada vez el sobrenadante para eliminar bacterias planctónicas y
exceso de colorante.
e) Eluir 2 veces con 200 ul de etanol 95% (v/v) y transferir a tubo de hemólisis con 1,6
ml de etanol.
92
MATERIALES Y METODOS
Alfa de Roche 100 mg%) o con el agregado de sobrenadantes de cultivos de L plantarum.
Técnica:
1) Lechos de mocos de los pacientes (sin diluir y diluidos 1:4 con DDT).
3) Sin lecho.
b) En todos los pocillos agregar 100 ul de una suspensión de P. aeruginosa, que tenga
ul de DNasa recombinante humana (Pulmozyme Dornasa Alfa de Roche 100 mg%) o con el
d) Lavar 2 veces con 200 ul de PBS, aspirando el contenido de cada pocillo. Se lavó 3
veces con PBS descartando cada vez el sobrenadante para eliminar las bacterias
e) Eluir 2 veces con 200 ul de etanol 95% (v/v) y transferir a tubo de hemólisis con 1,6
ml de etanol.
92
MATERIALES Y METODOS
Las muestras de esputos de cada paciente fueron utilizadas para medir el contenido de
tratados y no tratados con DNasa así como los esputos tratados in vitro con DNasa, fue
detectada con Elastina-Rojo Congo (Sigma, St Louis, MO, USA) como sustrato. Es un test
colorimétrico que se basa en medir la liberación del Rojo Congo cuando la Elastasa de las
muestras de esputo utiliza la elastina como sustrato (Gambello y Iglewski, 1991). Si hay
92
MATERIALES Y METODOS
elastasa en el esputo, la misma ataca a la elastina y libera el rojo congo al medio, lo cual
Técnica:
a) Agregar 500 ul de las muestras de esputo a tubos eppendorf que contenían 20 mg de Elastina-
Técnica:
e) Colocar 500 ul de las muestras de esputo a tubos eppendorf que contenían 20 mg de Elastina-
Rojo Congo en 1 ml de buffer ECR (Na2HPO4, 10 mM, pH 7.0) con el agregado de 100 ul de
92
MATERIALES Y METODOS
recibieron alimento standard y agua at libitum. Cada experimento consistió de 3 ratones por
ensayo.
Anestesia: Se utilizó Pentotal Sódico en una dosis de 70 mg/kg por vía intraperitoneal.
de la cánula para realizar la traqueotomía: la cánula para la traqueotomía se diseñó con una
92
MATERIALES Y METODOS
Figura 17: Material de cirugía y elementos descartables utilizados en la extracción del lavado broncoalveolar.
Instilación del esputo: para la instilación de las muestras de esputo los animales de
administración de las muestras de esputo fluidificados con DDT se llevó a cabo bajo anestesia
intraperitoneal (Figura 19) suave para suprimir el efecto de la deglución y facilitar que la
92
MATERIALES Y METODOS
92
MATERIALES Y METODOS
Con una jeringa de tuberculina usando una aguja truncada para evitar dañar al animal
figura 19 los ratones fueron instilados con 100 ul del esputo repartiendo 50 ul en cada una de
las narinas. Los ratones fueron sacrificados a la hora siguiente de la instilación del esputo, con
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MATERIALES Y METODOS
Daño tisular en los pulmones
a) Análisis del lavado bronquial (LBA), obtenido según técnica de (Vaughn JM et al. 2007).
Azul Tripán
Obtención del lavado broncoalveolar: con el ratón anestesiado, se procede a retirar la capa
de piel de la zona ventral utilizando elementos de cirugía, luego se quita la capa muscular,
teniendo especial cuidado en la zona torácica (figura 20). En la zona de la tráquea hay
depósitos de grasa que deben ser quitados cuidadosamente para que la tráquea quede a la
vista.
92
MATERIALES Y METODOS
Para sujetar la tráquea se pasó una aguja curva N° 2 con el hilo por debajo de la
misma (figura 21). Se realizó un nudo suave con un hilo de sutura para poder sujetar, en el
92
MATERIALES Y METODOS
Figura 21: Paso de la aguja curva N° 2 con el hilo de sutura.
Con una tijera se realizó un corte parcial de la tráquea para generar un hojal para el
ingreso de la cánula (figura 22). La cánula fue sujetada a la tráquea ajustando el nudo
Figura 22: Corte parcial de la tráquea para generar un hojal para el ingreso de la cánula.
La tráquea fue canalizada usando una pipeta Pasteur de 1ml y los pulmones fueron
lavados con 1,5 ml de PBS estéril muy lentamente (observar cómo se hinchan los pulmones) y
luego se aspira también muy lentamente el líquido introducido (para no dañar los pulmones)
(Figura 23 y 24).
92
MATERIALES Y METODOS
92
MATERIALES Y METODOS
92
MATERIALES Y METODOS
Se midió el volumen del líquido bronco-alveolar recuperado de cada lavado,
En el pellet se determinó:
II) Cantidad de glóbulos rojos con la técnica de hemólisis (lisis con agua destilada a 4
III) Recuento en cámara de Neubauer de los glóbulos blancos y determinación de la viabilidad con
Azul Tripán.
b) ESTUDIOS HISTOLÓGICOS
1) Toma de muestra:
92
MATERIALES Y METODOS
de las muestras ya que se detienen todos los procesos líticos; ésto se logra sometiendo el
material a la acción de los fijadores, que producen la muerte instantánea de las células de la
muestra. Los pulmones fueron fijados con Formol al 10% en agua destilada.
están hidratadas. La parafina es insoluble en agua; por lo tanto es necesario deshidratar las
muestras por medio de reactivos líquidos anhidros, pero ávidos en agua (Alcohol Etílico).
por los cambios bruscos usando una batería de Alcohol Etílico ascendente, constituida por 6
baños: 50º, 70°, 80°, 96°, 100º I y 100° II. Las muestras se pasaron por cada uno de los baños
durante 2 min.
92
MATERIALES Y METODOS
b) Diafanización: Como la parafina no es soluble en alcohol, es necesario pasar la
muestra por un reactivo intermedio que permite extraer el alcohol de la muestra para que
penetre la parafina a los tejidos. Estos reactivos se llaman aclarantes ya que cuando se coloca
la muestra, ésta se pone traslúcida. Este proceso se llama Diafanización y se lo realizó pasando
la muestra por 2 baños de Xilol con una duración de 10 min en cada baño.
II) Formación del bloque: La parafina fundida se colocó en moldes de papel. Se tomó la
muestra con pinzas y se la colocó en los moldes de modo que el plano de corte quede hacia
4) Cortes con micrótomo: Se realizaron los cortes con micrótomo (Figura 26) (espesor
menor de 4 micras) obteniendo láminas delgadas para ser observadas al microscopio óptico
92
MATERIALES Y METODOS
II) Hidratación: la hidratación de los cortes es necesaria para poder colorear las muestras. Se
usó una batería descendente de alcoholes: 2 baños de Alcohol Absoluto (100º I y 100º II), 96º,
80º, 70º, 50º y finalmente agua destilada. La duración en cada uno varía de 1 a 2 min.
colorea frente a la acción de un colorante, de modo que cuando se lave en la solución en que
el núcleo. Los núcleos se colorean de violeta a azul, mientras que el citoplasma se colorea de
rosa.
92
MATERIALES Y METODOS
Técnica: Los cortes se colorearon con Hematoxilina de Mayer durante 10 min; se
diferenciaron con agua corriente durante 10 min y ligeramente en agua destilada. Luego, se
colorearon con Eosina durante 5 min, se lavaron con agua destilada y posteriormente con
alcohol 80º, 96º, 100º I y 100º II (2 min en cada uno), y finalmente Xilol I y Xilol II (2 min
Los cortes histológicos coloreados se observaron con microscopio óptico 40x y 100x
++:10-20/campo 40x
92
RESULTADOS Y DISCUSION
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las muestras de esputo procedían de pacientes que fueron previamente nebulizados con
observó que las muestras tenían gran cantidad de moco lo que dificultaba su manejo por lo que
fue necesario usar el DDT para poder pipetear. Y muchas células epiteliales.
Las bacterias aisladas por técnicas de cultivo de rutina fueron: P. aeruginosa cepa
mucoide multiresistente, St. aureus pigmentado, St. pyógenes beta hemolítico del grupo F.
Esputo
Tratamiento
de Coloración con Giemsa Estudio bacteriológico
con DNasa
pacientes
M1a
Células +++ / PMN + / P. aeruginosa
M1b
macrófagos + / moco +++ St aureus
M1e
M2b DNasa
M2f DNasa
M3a St aureus
Células + / PMN +++ /
St. pyógenes beta hemolítico
M3b macrófagos + / moco +
del grupo F
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RESULTADOS Y DISCUSION
Células + / PMN +++ / P. aeruginosa mucoide
M4a
macrófagos + / moco + multiresistente
M5c DNasa Células +++ / PMN +++ / St. pyógenes beta hemolítico
M6a
Células ++ / PMN +++ /
M6b DNasa P. aeruginosa cepa mucoide
macrófagos + / moco +++
M6c DNasa
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RESULTADOS Y DISCUSION
Producción del biofilm de Pseudomonas aeruginosa y su inhibición con sobrenadantes
92
RESULTADOS Y DISCUSION
mayor inhibición que la DNasa sobre el biofilm dependiente del crecimiento (p<0,005) e
En los lechos con esputo no hay diferencias entre ambos inhibidores en el ensayo
92
RESULTADOS Y DISCUSION
siguientes:
Considerando que el tratamiento in vitro con DNasa del esputo de los pacientes no
nebulizados con DNasa produce la máxima liberación de elastasa, se observa que los
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RESULTADOS Y DISCUSION
Cuando se compara el efecto que produce la mezcla de DNasa+SLp y SLp solo, se
observa que la mezcla DNasa+SLp ejerce un porcentaje mayor de inhibición con respecto al
siguientes:
contenido de elastasa que se incrementa cuando éste es tratado in vitro con DNasa. El
tratamiento del esputo con SLp produce una importante inhibición de la elastasa semejante a la
Los esputos de los pacientes que han sido previamente nebulizados con DNasa tienen un
importante contenido de elastasa que proviene de la necrosis de los PMN y de las bacterias.
La combinación de SLp con DNasa no afecta la capacidad inhibitoria del SLp sobre la
92
RESULTADOS Y DISCUSION
III.- EFECTO DEL SOBRENADANTE DE CULTIVOS DE LACTOBACILLUS
PLANTARUM “IN VIVO” para estudiar el daño tisular en los pulmones de los ratones
frotis coloreado con May Grünwall-Giemsa mediante microscopía óptica. Se observaron gran
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RESULTADOS Y DISCUSION
92
RESULTADOS Y DISCUSION
92
RESULTADOS Y DISCUSION
Cantidad de glóbulos rojos mediante la técnica de hemólisis
Grafico 5: recuento de GR del LBA de muestras de pacientes con y sin tratamiento con DNasa previo
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RESULTADOS Y DISCUSION
En muestras de pacientes nebulizados previamente con DNasa se observa mayores
cantidades de GR, como así también en las muestras tratadas con DNasa, donde se observo la
DNasa+SLp.
que en muestras de pacientes con nebulización previa con DNasa los valores de hemoglobina
92
RESULTADOS Y DISCUSION
son mayores que en los que no se nebulizaron, y la cantidad de hemoglobina en todos los
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RESULTADOS Y DISCUSION
RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS EN CÁMARA DE NEUBAUER Y
de DNasa+SLp, obteniéndose mayores valores en las muestras con PBS, DNasa y SLp por
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RESULTADOS Y DISCUSION
Determinación de Elastasa por el método de la Elastina Rojo Congo
El método no tiene sensibilidad para determinar la Elastasa del LBA por la baja concentración.
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RESULTADOS Y DISCUSION
2.- ESTUDIOS HISTOLÓGICOS DE LOS PULMONES.
Figura 30: Grupo de ratones instilados sólo con esputo de pacientes con Fibrosis Quística.
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RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 31: Grupo de ratones instilados con esputo de pacientes con Fibrosis Quística y tratados
zonas de hemorragia.
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RESULTADOS Y DISCUSION
Figura 32: Grupo de ratones instilados con esputo de pacientes con Fibrosis Quística y tratados
Se consideró que existe protección cuando la mayoría de los cortes muestren ausencia
de patologías pulmonares.
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CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
De acuerdo a los ensayos realizados y expuestos en esta tesina así como los resultados
inhibitoria de biofilm de Pseudomonas aeruginosa crecida en los esputos de pacientes con FQ.
Su actividad es similar que la encontrada para la DNasa, la cual actúa específicamente sobre el
No sólo inhibe al biofilm de P aeruginosa sino también al biofilm de las superficies bióticas
como son los lisados de PMN y sobre los esputos de los pacientes con FQ.
La Elastasa es liberada del esputo por la fluidificación con DNasa e inhibida por el
fluidificación del moco por la nebulización con DNasa libera gran cantidad de elastasa
inhibiría su actividad lítica sobre los tejidos así como su actividad inductora de secreción de
No solo inhibe la elastasa bacteriana, sino también la elastasa liberada por los PMN. Esta
actividad es muy manifiesta en los esputos de los pacientes previamente tratados con DNasa.
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CONCLUSIONES
En ensayos “in vivo” se estableció, en ratones instilados con el esputo de los pacientes con FQ,
que un cultivo de Lactobacillus plantarum en MRS puede inhibir dicha infección modificando
elastasa es difícil de lograr por interferentes naturales o de síntesis y que el sobrenadante del
La infección no se elimina por que las bacterias persisten gracias a la formación del
Lactobacillus plantarum podría controlar elastasa y biofilm. Los tiempos de aplicación, las
las características físicas del esputo, deberán ser controlados por kinesiólogos con un profundo
multidisciplinarias.
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PROYECCIONES
PROYECCIONES
aeruginosa aislada de esputos de pacientes con Fibrosis Quística de manera tal de estudiar la
Se estudiarán las funciones de la respuesta inmune innata cuya desregulación es una de las
componentes del esputo y las bacterias aisladas del mismo sobre Polimorfonucleares de sangre
circulante de voluntarios.
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BIBLIOGRAFIA
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