Universidad Politécnica Estatal del Carchi

Facultad de industrias Agropecuarias y Ciencias Ambientales

Ingeniería de Alimentos
Asignatura: Análisis de Alimentos II
Nivel: Quinto “C”
Informe: N°2
Tema: Determinación cuantitativa de la actividad enzimática de un preparado
enzimático puro.
Recibido para su revisión fecha:Miércoles 16 de mayo del 2018
Autores:Marcelo Cucás- Estiven Chala- Andrés Reina.
Docente: Dra. Jenny Yambay

Resumen

La presencia de una enzima es determinada por la medida de la reacción que cataliza,

pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reacción. Además, la
caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad en diferentes
condiciones. Por esto, la medida de actividad enzimática es de importancia para la
investigación y análisis de proteínas, es así que, evidenciando la falta de investigación en
Ecuador, consideramos importante contribuir con algo más de información a este campo.
Utilizando 5 muestras un blanco y un cero Tabla 1. Espectrofotométricamente se trazó
una curva de calibración con la ayuda de Excel Fig1 empleado una longitud de onda de
550 nm. Con una relación masa volumen se estableció la concentración final de almidón
sin la acción de la papaína, después con la ecuación de la recta Fig. 1. Se obtuvo la
concentración final de cada una de las disoluciones catalizadas por la enzima. Obtenidos
estos datos se hace una resta de los dos valores dado como resultado la cantidad de
reactivo consumido en una unidad de tiempo (5min). Con lo que ahora ya se puede
estimar la acción enzimática a cualquier tiempo. Se concluye que las condiciones
prestadas para la enzima fueron adecuadas para su reacción catalítica y se resalta la
importancia de la investigación en este ámbito por los aportes que este hace a la industria
alimentaria a menor costo y tiempo.

Introducción velocidades, no se consume durante la

Una enzima es una proteína que actúa reacción y en general presenta un
como catalizador biológico, llevando a elevado grado deespecificidad. (Badui,
cabo reacciones bioquímicas a muy altas 2006).
Las enzimas, son clave para el
organismo. Hay diferentes tipos
de enzimas. Las más comunes trabajan
en el proceso de digestión, separando las
moléculas de los alimentos en piezas más
pequeñas para que el cuerpo pueda
absorberlas.
Cada enzima tiene una temperatura
óptima de actuación. Por debajo y por
encima de esta temperatura, la enzima
ralentiza la velocidad de la reacción
enzimática. Se observa que muchas de
las enzimas, duplican la velocidad de una
reacción enzimática cuando se aumenta
la temperatura de unos 10°
aproximadamente y luego cae muy
rápidamente por encima de los 40° C.
(Lehninger, 1995).
La determinación cuantitativa de la
activación enzimática se efectúa del
modo más rápido y conveniente cuando
el sustrato o el producto son coloreados
o absorben luz, en la región del
ultravioleta, ya que la velocidad de
aparición o de desaparición de un
producto o de un sustrato que absorbe la
luz puede seguirse con
espectrofotómetro, y permite efectuar un
registro continuo del curso d la reacción
si se emplea un registro provisto de una
banda de panel móvil. (Mathews& Van
Holde, 2002).
Algunos enzimas necesitan para llevar a
cabo su actividad catalítica de la
concurrencia de una o más sustancias de
naturaleza no proteica que reciben el
nombre de cofactores. No debe
entenderse que los cofactores son
sustancias que meramente potencian la
actividad enzimática, sino que, en
determinados enzimas, son
absolutamente imprescindibles para que
ésta se realice. (Lehninger, 1995).
Materiales y métodos
Para la determinación cuantitativa de la
actividad enzimática de un preparado
C enzimático puro; se utilizóuna papaya y
almidón y como reactivos agua destilada,
lugol, HCl 0,1N y KCl 0,054M. 20g de
la pulpa de la papaya triturada, se
homogenizó con una solución de KCl
0,154M, luego filtramos la muestra y se
lo llevo a centrifugación a (4000rpm)
durante 10 minutos y con eso obtuvimos
el PEC.
Para la determinación de la actividad
catalítica se utilizó el método de Street-
Close, donde también se logró medir la
un actividad de la celda. Preparamos los
tubos (blanco y problema), agregamos
2,5ml de la solución de almidón, 0,4ml
de H2O destilada y colocamos 0,1ml de
PEC al tubo problema, en el tubo blanco
agregamos 2,9ml de H2O destilada, y
0,1ml de PEC. A estas muestras las
llevamos a incubación en un baño maría de los tubos, como de detalla en la tabla
a 35°C por 10 minutos. Posteriormente 1; y finalmente dejamos reposar por 5
colocamos 2,5ml de HCl 0,1N y 0,1ml minutos para medir la longitud de onda a
de solución de yodo a ambos tubos. 550 nm en el espectrofotómetro.

Preparamos 6 tubos en donde se

colocódistintas disoluciones en cada uno

Resultados
Tabla 1. Datos previos a la curva de calibración.
g almidón 0.2 mg 0.4 mg 0.6 mg 0.8 mg 1 mg
Componentes Blanco Ms 1 Ms 2 Ms 3 Ms 4 Ms 5
Sln. Almidón 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
H2O destilada 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
HCl 0,1 N 2.5 2,5 2.5 2.5 2.5 2.5
Sln. Yodada 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Fuente: (Martínez & Yurico, 2012)

Tabla 2. Datos experimentales absorbancia concentración

Numero Absorbancia Concentración

de (longitud de mg/L
muestra onda 550nm)
0 0 0,0
1 0,415 35,7
2 0,682 71,4
3 1,01 107,1
4 1,446 142,9
5 1,666 178,6
Fuente: (Cucás, 2018)
 ABSORBANCIA VS CONCENTRACIÓN
1.8
1.6
1.4 y = 0.0094x + 0.0305
R² = 0.9942
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 140.0 160.0 180.0

Fig. 1. Representación gráfica de la curva de calibración, absorbancia vs la concentración.

Fuente: (Cucás, 2018)

CORRECCIÓN DE LA ABSORBANCIA

Blanco 0,076
Absorbancia 1,611

Absorbancia corregida= Absorbancia del blanco – Blanco

Absorbancia corregida= 1,611-0,076
Absorbancia corregida= 1,535
CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN FINAL
𝒄𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒅𝒆 𝒂𝒍𝒎𝒊𝒅ó𝒏 (𝒎𝒍) ∗ 𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒏
𝒄𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍 =
𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒅𝒊𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏
𝟐, 𝟓𝒎𝒍 ∗ 𝟒𝟎𝟎𝒎𝒈/𝑳
𝑪(𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍) =
𝟓, 𝟔𝒎𝒍
𝑪(𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍) = 𝟏𝟕𝟖, 𝟔 𝒎𝒈/𝑳
CALCULO DE CONCENTRACIÓN PROBLEMA (Fig.1)
𝒚 = 𝒎𝒙 + 𝒃
𝒚 = 𝟎, 𝟎𝟎𝟗𝟒𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟎𝟓
𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒈𝒊𝒅𝒂 − 𝒐𝒓𝒅𝒆𝒏𝒂𝒅𝒂 𝒂𝒍 𝒐𝒓𝒊𝒈𝒆𝒏
𝒙=
𝒑𝒆𝒏𝒅𝒊𝒆𝒏𝒕𝒆 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒕𝒂.
𝟏, 𝟓𝟑𝟓 − 𝟎, 𝟎𝟑𝟎𝟓
𝒙=
𝟎, 𝟎𝟎𝟗𝟒
𝒙 = 𝟏𝟔𝟎, 𝟎𝟓𝟑𝒎𝒈/𝑳
CALCULO DEL ALMIDÓN CALCULO DE LA DEGRADACIÓN
DEGRADADO EN 5 MINUTOS. DEL ALMIDÓN A DIFERENTES
TIEMPOS.
Almidón degradado= Concentración
inicial – concentración problema 5min degrada 18,518mg/L
Almidón degradado= 178,6 – 1min degrada x= 3,70mg/L
160,053= 18.518mg/L
2min degrada x= 7,40mg/L
3min degrada x= 11,11mg/L
4min degrada x= 14,81mg/L
Calculo de la actividad enzimática

Modelo matemático. Ecuación 1.

𝑎𝑏𝑠
𝑚 (𝑚𝑖𝑛) ∗ 𝑉. 𝑒𝑛𝑠𝑎𝑦𝑜(𝑚𝑙)
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑑𝑎 = = 𝑚𝑚𝑜𝑙𝑚𝑖𝑛−1
𝜀(𝑀−1 𝑐𝑚−1 ) ∗ 𝑏(𝑐𝑚)

m: es la pendiente de la recta (∆Abs/∆t) en unidades de abs/min

𝜀: es el coeficiente de extinción molar para el NADH que es 6220 𝑀−1 𝑐𝑚−1

b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm en este caso

V: es el volumen total del ensayo (ml)

Tabla 3. Datos para el cálculo de la actividad de la celda

Concentración Abs min C /min Abs/min

Problema 160,053 1,535 1 3,70 0,0262

<2 7,41 0,0524
Estándar 178,6ppm 178,6 1,666 3 11,11 0,0786
4 14,81 0,1048
ppm degradados 18,518 5 18,52 0,1310
Absconcentrdegrad 0,131
actividad celda 2,3588405 𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑚𝑖𝑛−1
Fuente (Cucás.,2018).
Tabla4. Datos previos para la actividad de la celda

min Abs/min
Problema 1 0,0262
2 0,0524
Estandar 178,6ppm st 5 3 0,0786
4 0,1048
ppm degradados 5 0,1310
Fuente (Cucás.,2018).

min vs Abs/min
0.1400
y = 0.0262x
0.1200

0.1000

0.0800

0.0600

0.0400

0.0200

0.0000
0 1 2 3 4 5 6

Fig. 2. Representación gráfica de la actividad de la celda minutos vs absorbancia/minuto

Fuente: (Cucás., 2018)

Discusión matemáticamente debe existir un valor

La velocidad de una reacción química constante. (Martínez & Yurico, 2012)
puede medirse como la velocidad de Según Vander(1975) afirma que la
formación de uno o más de sus productos medida adecuada de la actividad de una
o bien la velocidad de utilización de sus enzima requiere que se determine la
reactivos. Intuitivamente podemos velocidad inicial, esto es, obtener la
suponer que al aumentar la tangente al origen. De esta manera, las
concentración de los reactivos la diferentes causas que producen la
probabilidad de interacción de los disminución de la actividad con el
mismos aumenta conjuntamente con la tiempo son eliminadas.
velocidad que procede tal reacción.
En base a este principio podemos
Ambas variables (velocidad de reacción
determinar la actividad enzimática, en
y concentración de los reactivos) son
nuestro caso midiendo
directamente proporcionales, así que
espectrofotométricamente la relación para saber cuánto de almidón
concentración inicial y final de varias será capaz de hidrolizar esta enzima en
disoluciones con diferente cantidad de cualquier tiempo, por ejemplo: 5min
almidón como se indica en la Tabla degrada 18,518mg/Lentonces en
1.Todo esto en función del tiempo con 1min degrada x= 3,70mg/L.
condiciones de temperatura, presión y
Conclusiones
PH constantes. Al hacer esto se
evidencio la degradación del almidón  De acuerdo al mecanismo de

catalizado por la papaína, ya que, con reacción propuesto y en base a

ayuda del espectrofotómetro medimos los resultados de las enzimas

las absorbancias de las diferentes papaína, se determinó que la

disoluciones (Tabla1)a una longitud de hidrólisis enzimática se ajusta a

onda de 550nm, para determinar una un modelo de reacción de primer

curva de calibración (Fig1) como orden, debido a una asociación

especifica en la metodología. Lo que por rápida de la enzima (E) con el

medio de una regresión lineal nos sustrato (S) para formar el

permite conocer la concentración final complejo enzima-sustrato (ES) el

de cada una de las muestras, una vez cual posteriormente se convierte

obtenido este dato se puede emplear el en productos y enzima.

modelo C1. V1= C2. V2 para calcular la  En base a los resultados no

concentración final de almidón sin el estaría mal afirmar que las
efecto de la papaína, para así con una condiciones pre preparadas para
simple resta obtener la cantidad de la debida formación del complejo
almidón hidrolizada por la papaína, enzima sustrato y enzima
obteniendo como resultado esto: producto fueron las óptimas ya

Almidón degradado= Concentración que al reducir la energía de

final – concentración problema activación para la ruptura de los
enlaces glucosidicos alfa 1,4 y
EntoncesAlmidón degradado= 178,6 –
1,6 de presentes en la amilosa se
160,053= 18.518mg/L, adicionalmente
registró un incremento de la
tenemos que esta cantidad de almidón
velocidad de reacción de
fue degradada en 5 minutos, que es el
3,70mg/L por minuto, gracias a
tiempo que se dejó reposar las muestras,
la catálisis de la enzima papaína.
con lo que podemos establecer una
  El estudio de la cinética la preparación de una muestra
enzimática es de suma que sirva como blanco y también
importancia en la industria de otra que sirva como muestra cero,
alimentos, por la selectividad que ya que, si se va a utilizar el
estas tienen para determinados espectrofotómetro este necesita
sustratos y para abaratar costos, que le indiquen desde que punto
es indudablemente importante empezar a medir la absorbancia y
que exista más investigaciones transmitancia, esta es la función
acerca de la afinidad de de la muestra denominada cero y
determinadas enzimas con el blanco servirá para mostrar la
diferentes sustratos y las concentración sin el efecto de la
condiciones más óptimas para papaína.
obtener mejores resultados, con  La determinación cuantitativa de
este tipo de prácticas lo que se la activación enzimática se
espera es contribuir con algo de efectúa del modo más rápido y
información a este campo que conveniente cuando el sustrato o
hoy en día está en pleno auge y es el producto son coloreados o
de mucha popularidad. absorben luz, en la región del
ultravioleta, ya que la velocidad
de aparición o de desaparición de
Recomendaciones un producto o de un sustrato que

 Todo el procedimiento debe absorbe la luz puede seguirse con

hacerse de la manera más pronta un espectrofotómetro

posible ya que una vez agregado Referencias Bibliográficas.

la enzima esta empezara actuar y
Brubaker, J. (2018). Cómo calcular la
si no se hace la respectiva
concentración utilizando la
medición en un corto lapso de
absorbancia.
tiempo está ya habrá degradado
algo de reactivo y Recuperado de:
consecuentemente los datos a https://www.geniolandia.com/13
obtenerse ya no serán tan fiables. 074272/como-calcular-la-
 Para la determinación de la concentracion-utilizando-la-
actividad enzimática es necesario absorbencia
Villanueva, M. (2008). Curvas de Fuente: (Cucás, 2018)
calibración en los métodos
analíticos. Introducción a la
metrología química. Recuperado
de:
http://depa.fquim.unam.mx/amy
d/archivero/CURVASDECALIB
RACION_23498.pdf.

Vander,M.(1975).The enzymatic
hydrolysis of agar by FIG. 3: Colocación de lugol en las
muestras
CytophagafIevensLF sp. nov.
Thesis, üniversity of Groningen, Fuente: (Cucás, 2018)

Netherlands, 80 pp.
ANEXOS

FIG. 4: Peso del KCL

Fuente: (Cucás, 2018)
FIG. 1: Hidrólisis del almidón
Fuente: (Cucás, 2018)

FIG. 5: Adición de almidón a las

muestras
FIG. 2: Centrifugación de muestras Fuente: (Cucás, 2018)