Objetivos

 Describir todos los conceptos de espectrofotometría

 Diferenciar las técnicas de aplicación

ESPECTROFOTOMETRÍA

1.1 LA ESPECTROFOTOMETRÍA

Es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia química,

midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra,

basándose en la. Esta medición también puede usarse para medir la cantidad de un producto

químico conocido en una sustancia.

También con el espectrofotómetro, la cantidad de una sustancia química conocida

(concentraciones) también puede determinarse midiendo la intensidad de la luz detectada.

Dependiendo del rango de longitud de onda de la fuente de luz, se puede clasificar en dos tipos

diferentes:

Espectrofotómetro UV-Vis: utiliza luz en el rango ultravioleta (185 – 400 nm) y rango visible

(400 – 700 nm) de espectro de radiación electromagnética.

Espectrofotómetro de infrarrojos: utiliza luz en el espectro de infrarrojos (700 – 15,000 nm)

del espectro de radiación electromagnética.

La estructura básica de los espectrofotómetros consiste en una fuente de luz, un colimador, un

monocromador, un selector de longitud de onda, una cubeta para la solución muestra, un detector

fotoeléctrico y una pantalla digital o un medidor.

1.1.1 Partes del espectrofotómetro.

El espectrofotómetro, en general, consta de dos dispositivos; un espectrómetro y un fotómetro.

Un espectrómetro es un dispositivo que produce, dispersa y mide la luz. Un fotómetro tiene un

detector fotoeléctrico que mide la intensidad de la luz.

 Espectrómetro: Produce un rango deseado de longitud de onda de luz. Primero un

colimador (lente) transmite un haz recto de luz (fotones) que pasa a través de un

monocromador (prisma) para dividirlo en varias componentes de longitudes de onda

(espectro). Entonces un selector de longitud de onda (ranura) transmite sólo las

longitudes de onda deseadas.

 Fotómetro: Después de que el rango deseado de longitud de onda de luz pasa a través

de la solución muestra en la cubeta, el fotómetro detecta la cantidad de fotones que se

absorbe y luego envía una señal a un galvanómetro o una pantalla digital.

Para la fuente de luz se tiene que puede ser:

a) Deuterio

Las lámparas de arco de deuterio proporcionan una luz potente y estable en la región UV, 190-

370 nm. Produce una buena intensidad continua en la región UV y proporciona una intensidad útil

en el visible. Con el tiempo, la intensidad de la luz de una lámpara de arco de deuterio disminuye

constantemente. Dicha lámpara tiene típicamente una vida media (el tiempo que dura la intensidad

hasta caer a la mitad de su valor inicial) de aproximadamente 1,000 h. En espectrofotómetros de

mayor especificación se utiliza el diseño especial de lámpara de deuterio para maximizar la vida

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útil sin reducir la salida, llamada tecnología “pulsar para leer” (Pulso). Esto puede aumentar la

vida de la lámpara hasta 3 veces la de una lámpara de deuterio convencional. Las lámparas de

deuterio se emparejan con lámparas de tungsteno para permitir la cobertura del espectro visible.

b) Tungsteno

Las lámparas de tungsteno dan luz estable en las áreas visibles y cercanas a las infrarrojas del

espectro, cubriendo 320 – 1,100 nm. Las lámparas de tungsteno también emplean “pulsar para

leer” (Pulso) para prolongar la vida útil de la lámpara.

c) Xenón

Las lámparas de flash de xenón son una fuente de luz de alta energía que emite luz a través de

los rayos UV, Vis y cerca espectro IR. Se conocen como lámparas de flash, hasta 80 veces por

segundo. Las lámparas de xenón tienen una vida útil muy larga, pero no proporcionan la estabilidad

óptica del deuterio/tungsteno establecido en los sistemas de mayor especificación. Típicamente

tiene una vida útil de 10,000 h.

d) LED

Se utiliza para aplicaciones de longitud de onda única, como la medición de cultivos celulares.

Los LED son estables, de bajo costo y ofrecen una larga vida útil.

Según la tecnología del haz de luz, puede ser:

e) De haz simple

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 Se refiere al hecho de que la luz sólo pasa a través del soporte de la muestra al detector. Se

requiere una referencia inicial para estandarizar el instrumento antes de poder comenzar con el

análisis. Los instrumentos de haz único son generalmente muy simples y económicos de comprar.

f) De haz dividido

La luz de la fuente se divide en dos trayectorias, con aproximadamente el 30% de la energía

siendo desviado de la trayectoria principal en un detector de realimentación. El 70% se pasa a

través de un monocromador, a través del compartimiento de la muestra a un detector. El detector

de realimentación es utilizado para corregir variaciones en la energía emitida por la lámpara. Se

requiere una muestra de referencia al comienzo de cada ensayo para corregir la absorción de la

cubeta y del solvente.

g) De doble haz

La luz se divide en dos caminos, cada uno de los cuales pasa a través de un soporte de celda en

su propio detector. Un soporte de celda es para la muestra y el segundo es para una referencia. La

referencia debe contener el mismo tipo de cubeta y solvente que la muestra. La absorción de la

trayectoria de referencia se resta de la de la trayectoria de la muestra. Cada medición tiene su

propia referencia, dando resultados más fiables.

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1.2 ABSORCIÓN ATÓMICA

Es un método de química analítica cuantificable que está basado en la atomización del analito

en matriz líquida y que utiliza comúnmente un nebulizador prequemador (o cámara de

nebulización) para crear una niebla de la muestra y un quemador con forma de ranura que da una

llama con una longitud de trayecto más larga, en caso de que la transmisión de energía inicial al

analito sea por el método "de llama". La niebla atómica queda desolvatada y expuesta a una energía

a una determinada longitud de onda emitida ya sea por la llama susodicha, o por una lámpara de

cátodo hueco (Hollow Cathode Lamp o HCL) construida con el mismo analito a determinar o una

Lámpara de Descarga sin Electrodo. Normalmente las curvas de calibración no cumplen la ley de

Beer-Lambert en su estricto rigor.

 Nebulizadores neumáticos. La clase más común de nebulizador es el tipo neumático

de tubo concéntrico en el que la muestra líquida se extrae por un tubo capilar mediante

una corriente de gas de alta presión que fluye alrededor de la punta del tubo (efecto

Bernoulli). Este proceso de transporte de líquido se llama aspiración. El gas de alta

velocidad descompone al líquido en gotitas de varios tamaños, que son llevadas después

al atomizador.

El nebulizador Babington consta de una esfera hueca en la que se bombea un gas de

alta presión que sale a través de un pequeño orificio en la superficie de la esfera. El

chorro de gas en expansión nebuliza la muestra líquida que fluye en una delgada película

sobre la superficie de la esfera. Este tipo de nebulizador está menos sujeto a

taponamiento que otros dispositivos y, por lo tanto, es útil para muestras que tienen un

alto contenido de sales o para lechadas con un contenido importante de partículas.

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 Nebulizadores ultrasónicos. Varios fabricantes de instrumentos ofrecen también

nebulizadores ultrasónicos en los que la muestra se bombea sobre la superficie de un

cristal piezoeléctrico que vibra a una frecuencia que varía de 20kHz a varios megahertz.

Los nebulizadores ultrasónicos producen aerosoles más densos y más homogéneos que

los nebulizadores neumáticos. Sin embargo, estos dispositivos tienen bajas eficiencias

con soluciones viscosas y con las que contienen partículas.

 Vaporizadores electrotérmicos. Es un evaporador colocado en una cámara por la

que fluye un gas inerte como el argón para llevar la muestra evaporada hacia el

atomizador. Una pequeña muestra de líquido o sólido se coloca en un conductor, como

un tubo de carbono o un filamento de tántalo. Una corriente eléctrica evapora con

rapidez y por completo la muestra en el flujo de argón. en contraste con los sistemas de

nebulizado anteriores, un sistema electrotérmico produce una señal discreta en vez de

una continua. Es decir, la señal de la muestra atomizada se incrementa al máximo y

luego disminuye a cero a medida que la muestra es barrida por la región de observación.

Las alturas o las áreas del pico proporcionan entonces la información cuantitativa

deseada.

 Técnicas de generación de hidruros. Estas representan un método para introducir

muestras que contengan arsénico. antimonio, estaño, selenio, bismuto y plomo. Tal

procedimiento incrementa los límites de detección para estos elementos por un factor

de 10 a 100. Debido a que varias de estas especies son muy tóxicas, es muy importante

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 determinarlas en niveles de concentración bajos. Esta toxicidad dicta también que los

gases de la atomización deben ser eliminados de modo seguro y eficiente. Los hidruros

volátiles se generan al añadir una solución acuosa acidificada de la muestra a un

pequeño volumen de una disolución acuosa al 1% de borohidruro de sodio contenida en

un recipiente de vidrio.

 Introducción de muestras sólidas. La introducción de polvos, metales o partículas en

atomizadores de plasma o llama tiene la ventaja de evitar el paso de descomponer y

disolver la muestra. Sin embargo, dichos procedimientos sufren casi siempre

dificultades graves con la calibración, el acondicionamiento de la muestra, la precisión

y la exactitud. En general las diferentes técnicas para la introducción directa de sólidos

en atomizadores no dan resultados tan satisfactorios como los que se obtienen al

introducir las soluciones de muestra mediante nebulización. La mayor parte de estas

técnicas dan lugar a una señal analítica discreta en vez de una continua.

1.3 ESPECTROFOTOMETRÍA UV Visible

La espectrofotometría uv-visible (UV-VIS) es una práctica analítica que permite determinar la

concentración de un compuesto en solución. La espectrofotometría uv-visible se basa en la

medición de absorción de radiación UV o visible por determinadas moléculas, la radiación

correspondiente a estas regiones del espectro electromagnético causa transiciones electrónicas a

longitudes de onda característica de la estructura molecular de un compuesto.

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1.3.1 Aplicación de la espectrofotometría uv-visible.

La espectrofotometría uv-visible es utilizada generalmente en la valoración cuantitativa de

soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos, ambos absorben la luz.

La Ley de Beer-Lambert1 estipula que la absorbancia de una solución es directamente

proporcional de la concentración de la solución, por lo que la espectrofotometría uv-visible puede

usarse para determinar la concentración de la solución.

a) Espectrofotómetro uv-visible

El espectrofotómetro uv-visible es un instrumento óptico que tiene la capacidad de resolver

radiaciones de diferentes longitudes de onda dentro del rango ultravioleta y visible (por lo general

este rango se encuentra dentro de los valores de 190 a 1,100 nm).

b) Descripción del equipo:

Está compuesto por una fase luminosa, monocromador, elementos fotodetectores y un sistema

de registro.

• Fase luminosa: una bombilla pequeña de filamento enrollado es ideal para concentrar la luz

en un haz intenso. La incandescencia causada por la luz visible de la lámpara de tungsteno-

halógeno se basa en las altas temperaturas de calentamiento que alcanzan el filamento.

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A altas concentraciones = intercambio entre moléculas afecta la carga, alterando el coeficiente de absorción
molar.

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 • Moncromadores: descompone la luz incidente de un espectro de luz, es decir, se encarga de

separar y seleccionar la radiación de onda que se quiere analizar. Está compuesto por las rendijas

de entradas y salida de, colimadores y el elemento de dispersión, en los monocromadores

convencionales se usa el prisma como elemento de dispersión.

• Elementos fotodetectores: es la parte del instrumento que recibe la intensidad de radiación

monocromática de la muestra analizada y la transforma en una señal eléctrica que es medida y

comparada con un valor de referencia. El material fotosensible del cátodo emite electrones al ser

irradiados, debido al voltaje aplicado entre los electrodos los electrones se dirigen a los ánodos,

este flujo de electrones permite que por el circuito fluya una corriente cuya intensidad es

directamente proporcional a la intensidad de la luz que se mueve al fototubo.

• Sistema de registro: sirve como controlador del equipo, ya que este será el encargado de

procesar la información que proviene de los circuitos electrónicos.

1.4 ICP MASA

El espectrómetro de masas es un aparato utilizado en la espectrometría de masas como una

herramienta de análisis e investigación. Con la ayuda de este aparato se pueden realizar diversas

técnica de análisis, una de ellas es el análisis de los isotopos (átomos del mismo elementos pero

que tienen una masa diferente debido al número de neutrones que contienen) lo que se hace es

calcular un promedio de la masa atómica o peso atómico y es lo que vemos en la tabla periódica,

la espectrometría de masas también se caracteriza por el análisis de átomos individuales,

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identificar cual es el átomo presente en una muestra o incluso romper grandes macromoléculas y

analizar sus fragmentos.

Un espectrómetro de masas tiene tres componentes fundamentales, la fuente de ionización, el

analizador de masa y el detector.

 La fuente de ionización del espectrómetro de masas: proceso donde se ioniza la

muestra por analizar. Su función se desempeña cuando se coloca la muestra (ya sea en

estado líquido, gaseoso o solido) se inyecta en el tubo ionizador y luego se golpea la

muestra con electrones, es decir, los electrones se moverán a través de la muestra,

mediante un tubo catódico que produce todos esos electrones, así es como se erradica

todos los electrones de la muestra al mismo tiempo que ciertos números de iones

positivos y allí se pasa a ionizar la muestra.

 Analizador de masas del espectrómetro de masas: subdividido en dos partes un

campo eléctrico que es negativo, porque lo que se busca es mover los iones al analizador

de masas y después está un imán que direcciona circularmente el desplazamiento de los

iones para poder evaluar la intensidad y velocidad, es en este proceso donde se puede

reconocer la diferencia de las masas de esos iones.

 Detector del espectrómetro de masas: consiste en dos cosas, primero, un

multiplicador de electrones, que esencialmente es una placa donde choca el electrón y

mediante ese impacto provoca que de ese electrón se desprendan otros electrones que

chocan con una segunda placa la cual emite una señal, segundo, un amplificador se

requiere aumentar esa señal emitida por los electrones y así se podrá tener el resultado

del espectro que tiene diferentes masas.

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 

1.5 ICP OPTICO

1.5.1 Principios de la técnica

El plasma de acoplamiento inductivo (ICP) es una fuente de ionización que junto a un

espectrofotómetro de emisión óptico (OES) constituye el equipo de ICP-OES.

En esta técnica, la introducción continua de la muestra líquida y un sistema de nebulización

forma un aerosol que es transportado por el Argon a la antorcha del plasma, acoplado

inductivamente por radio frecuencia. En el plasma, debido las altas temperaturas generadas, los

analitos son atomizados e ionizados generándose los espectros de Emisión atómicos de líneas

características. Los espectros son dispersados por la red de difracción y el detector sensible a la

luz se encarga de medir las intensidades de las líneas. La información es procesada por el sistema

informático.

 Equipo

Espectrofotómetro de emisión atómica ICP-OES Radial Simultáneo Varian 725-ES

Se oferta análisis elemental cuantitativo mediante curva de calibrado en mg/l (elementos a

escoger).

 Aplicaciones

Los análisis que se ofrecen incluyen prácticamente todos los elementos de la tabla periódica en

una amplia variedad de muestras líquidas y sólidas.

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1.6 CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es esencialmente un método físico de separación en el que los componentes

a separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (lecho estacionario), y otra móvil (fase móvil)

la cual percola a través de la primera. El proceso cromatográfico se da como resultado de repetidos

procesos de sorción-desorción durante el movimiento de los componentes de la mezcla arrastrados

por la fase móvil a lo largo del lecho estacionario (elución), produciéndose la separación debido a

las diferencias en las constantes de distribución de los componentes de la mezcla entre la fase

estacionaria y la móvil. A la distribución final de los componentes en función de su posición sobre

el lecho estacionario, o del tiempo en que eluden se le denomina cromatograma.

1.6.1 Tipos de cromatografía

Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse en función del mecanismo de separación de

los componentes.

 Cromatografía de papel: es un proceso donde el absorbente lo constituye un papel de

Filtro. Una vez corrido el disolvente se retira el papel y se deja secar, se trata con un

reactivo químico con el fin de poder revelar las manchas.

 Cromatografía de capa fina: basa en el principio del reparto entre dos fases. En

general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se

desea separar (muestra) interaccione con un medio que se denomina fase estacionaria.

Un segundo medio la fase móvil que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir

a través de ésta para eludir a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintas

moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente, la fase móvil a los distintos

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 componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que en la fase móvil serán

eludidos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.

 Cromatografía de columna: Los elementos básicos en la cromatografía de columna

son una son la fase estacionaria y la fase móvil. La fase estacionaria la forma un sólido

poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada

en plástico o vidrió. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente

va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se

reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor

por la parte superior de la columna. La Cromatografía en columna se emplea para la

separación de sustancias en escala preparativa.

 Cromatografía gaseosa: La muestra es vaporizada e introducida en un flujo de un gas

apropiado denominado de fase móvil o gas de arrastre. Este flujo de gas con la muestra

vaporizada pasa por un tubo conteniendo la fase estacionaria, donde ocurre la separación

de la mezcla. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente o, más comúnmente,

una película de un líquido poco volátil, soportado sobre un sólido inerte o sobre la propia

pared del tubo. Las sustancias separadas salen de la columna disueltas en el gas de

arrastre y pasan por un detector; dispositivo que genera una señal eléctrica proporcional

a la cantidad del material eludido.

La Cromatografía Gaseosa es una técnica utilizada para la separación y análisis de

mezclas de sustancias volátiles.

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1.7 ELECTROFORESIS

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de estas en

un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños

moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use. La técnica clásica utiliza una

tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en

dos depósitos independientes que contienen ambos al electrolito y están unidos a los electrodos

del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeño trazo transversal en la

tira. La distancia de migración se mide en relación un marcador interno. Las placas son reveladas

con sales de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.

1.7.1 Técnicas Electroforéticas.

 Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE). Es el procedimiento de

electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por el electrolito a través

de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico (borato), o anfótero

(carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico crece con el pH del medio

electroforético.

 Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC). En esta variante del

procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico para

formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución

retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad

hidrófilahidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que

tienen tendencia a migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiomeros.

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  Electroforesis capilar en gel (CGE). Esta es la transposición de la electroforesis en

egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno con un electrolito que

contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las grandes moléculas

y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco

frágiles, se pueden separar de este modo.

 Isoelectroenfoque capilar (CIEF). Esta técnica, también conocida como electroforesis

en soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada

que contiene un anfótero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor

que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de

una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se desplazan las especies

separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedim iento

permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH.

REFERENCIAS

 Castellan, G. (1998) Fisicoquímica, 2 ed. México, Pearson-Adisson Wesley. Págs. 461-

462 Rouessac.

 F. (2003) Análisis Químico: Métodos y Técnicas Instrumentales Modernas. España,

McGraw Hill. Págs. 121-133

 Nelson, D. (2001) Lehninger Principios de Bioquímica, 3 ed. España, Omega. Págs. 123-

125

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