Sunteți pe pagina 1din 11

C7

http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0

SINTEZA REPLICATIVĂ A ADN

Procesul de sinteza a ADN se mai numeste si replicare si are loc in interfaza ciclului celular. In
timpul interfazei se produce dublarea cantităţii de ADN care apoi revine la normal în urma diviziunii
celulare.
Incă din 1950 se stabilise că, în celulele meristematice apicale ale tulpinii sau rădăcinii, în timpul
interfazei se produce dublarea cantităţii de ADN care apoi revine la normal în urma diviziunii celulare.
În 1957, Delbrück şi Stent au denumit semiconservativ mecanismul de replicare a ADN prezentat de
Watson şi Crick în 1953. Prin acesta se avansează ideea că: în procesul de replicare are loc
despiralizarea dublului helix, urmată de separarea progresivă a celor două catene complementare (după
modelul de deschidere a unui fermoar), iar ulterior are loc sinteza de noi catene complementare. În final
se formează două molecule identice de ADN bicatenar.
Sistemul prin care are loc dublarea cantităţii de ADN se bazează pe complementaritatea
structural-funcţională a celor două catene ADN, fiecare servind drept model sau matriţă pentru
sinteza unei noi catene complementare care se numeşte replică.
Moleculele de ADN nou formate vor avea fiecare o catena veche, care a servit drept matrita, si o
catena nou sintetizata. În final se formează două molecule identice de ADN bicatenar.Acest mod de
replicare se numeste replicare semiconservativa.

1
Caracterul semiconservativ al replicării ADN la bacterii a fost demonstrat de Meselson şi Stahl
(1958) cu ajutorul tehnicilor de separare a moleculelor de ADN în funcţie de densitatea lor prin
centrifugare în gradient de clorură de cesiu.
• Ei au cultivat bacteria E. coli, pentru mai multe generaţii celulare, pe un mediu de cultură în care
sursa unică de azot, clorura de amoniu (NH4Cl), nu conţine azotul normal 14N ci izotopul greu al
acestuia 15N.
• In paralel, celulele bacteriene au fost cultivate şi pe un mediu de cultură “normal” (ce conţine o
sursă de azot cu 14N)

2
Reprezentarea schematică a experimentului lui Meselson şi Stahl
• Ultracentrifugarea ADN izolat de la ambele tipuri de bacterii (cultivate pe acest mediu cu 14N şi
pe mediu cu 15N) a evidenţiat prezenţa a două tipuri de ADN care sedimentează (formează benzi
compacte) în tubul de centrifugă la niveluri diferite sub forma unor benzi: ADN cu 15N apare ca o
bandă “grea”, spre baza tubului de centrifugă, iar ADN cu 14N apare ca o bandă “uşoară”, dispusă
mai spre vârf.
• Cultivând bacteriile pe mediu cu 15NH4Cl, ADN bacterian izolat şi purificat a prezentat o
sedimentare corespunzătoare benzii de la baza tubului de centrifugă. Asemenea bacterii au fost
apoi trecute pe mediu cu 14NH4Cl pentru a se desfăşura un singur ciclu apoi două, trei de
diviziune celulară, după care s-a extras de fiecare dată ADN şi s-a ultracentrifugat în gradient de
densitate de CsCl. S-a constatat că ADN al bacteriilor care au desfăşurat un singur ciclu de
diviziune prezintă un model de bandare intermediar între cele ce au crescut pe mediu cu izotopul
greu şi cele ce au crescut pe mediu cu izotopul uşor al azotului (fig.31).
• De aici s-a tras concluzia că acest ADN este un hibrid, având catena matriţă grea, iar replica
conţine izotopul uşor. Aceasta a fost prima dovadă experimentală la nivel molecular a modelului
semiconservativ de replicare a ADN.
• la procariote, cultivarea bacteriilor în prezenţa unor deoxiribonucleozide radioactive (de exemplu,
timidină tritiată), urmată de liza celulară, de izolarea ADN şi apoi de autoradiografia preparatului
obţinut a permis evidenţierea separării catenelor complementare şi bifurcaţiei de replicare de
forma literei Y.
• De asemenea, această metodă a contribuit la stabilirea faptului că la procariote cromosomul este
circular şi are un punct de origine a replicării şi un punct de încheiere a acesteia, replicarea
realizându-se bidirecţional.
• Mai mult, s-a putut observa că, în cursul replicării cromosomul se prezintă sub forma literei
greceşti theta (θ), ceea ce reprezintă de fapt un intermediar de replicare.
• Aplicarea aceleiaşi metode de marcare pentru ADN de la eucariote a permis evidenţierea
faptului că, după o rundă de replicare în prezenţa timidinei radioactive, fiecare moleculă de ADN
rezultată este alcătuită dintr-o catenă polinucleotidică radioactivă şi o alta neradioactivă.
• Dacă celulele eucariote sunt lăsate să realizeze încă o rundă de replicare în absenţa timidinei
marcate, celulele rezultate vor conţine două tipuri de molecule de ADN: unele molecule vor fi
“hibride” (cu o catenă radioactivă şi cealaltă neradioactivă), iar alte molecule vor avea ambele
catene neradioactive.
• Toate aceste rezultate experimentale indică faptul că, atât la procariote cât şi la eucariote,
replicare a ADN cromosomal este de tip semiconservativ.
Deci: sinteza de noi molecule de ADN se realizează printr-un sistem de copiere care este unic în
lumea macromoleculelor. Replicarea este un proces caracteristic numai acizilor nucleici. Structura

3
acizilor nucleici este foarte potrivită pentru realizarea replicării lor: astfel dintr-o moleculă rezultă două
molecule fiice, identice între ele şi totodată, identice cu molecula iniţială.
Se asigură astfel:
 reproducerea fidelă şi continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaţiilor si
 dublarea cantităţii de informaţie genetică (respectiv multiplicarea sistemelor biologice).
Cantitatea dublată de material genetic este repartizată în mod echilibrat, prin procesul diviziunii
celulare, la cele două celule fiice.

Mecanismul molecular al replicării ADN

In general sinteza ADN dupa modelul semiconservativ se realizeaza astfel:


 Procesul este initiat la nivelul unei secvente specifice numita originea replicarii.
 intai are loc ruperea legaturilor de H2 dintre cele 2 lanturi polinucleotidice
 ruperea se continua de-a lungul macromoleculei asemanator cu desfacerea unui fermoar;
 In acelasi timp are loc o derulare a catenelor polinucleotidice, fiecare catena rotindu-se in
plan exterior in jurul radicalilor fosforici;
 separarea si desfasurarea moleculei initiale determina formarea unei structuri asemanatoare
literei Y numita furca de replicare.
Catenele noi sunt sintetizate concomitent in ambele directii (proces bidirectional) (figura).

4
 In citoplasma se afla nucleotide diferite care au fost sintetizate in celula si care contin cele
4 baze: adenina, guanina, citozina si timina;
 Tinandu-se seama de corespondenta care trebuie sa existe intre bazele purinice si
pirimidinice, o nucleotida care contine adenina se va lega prin punti de H2 cu o nucleotida
ce contine timina, iar una care contine guanina se va lega cu una ce contine citozina;
In felul acesta are loc replicarea macromoleculelor de ADN, fiecare molecula fiica fiind formata
dintr-o catena veche si una noua.

Aparatul de replicare.
La procesul de replicare a ADN participă numeroase enzime care constituie un adevărat
"aparat de replicare" care a primit denumirea de replisom.
Acestea sunt:
 ADN-polimeraza - I, II si III- la bacterii si
 ADN polimeraza α la eucariote.

Aceste enzime au o importanta deosebita in procesul de replicare. In afara de abilitatea lor de a


polimeriza nucleotidele, cele mai multe ADN polimeraze poseda si o activitate nucleazica prin care taie
legaturile fosfodiesterice dintre glucid- radical fosfat ale lantului polinucleotidic.

Alte ADN polimeraze au numai activitate nucleazica. Acestea sunt de 2 tipuri:


1. Exonucleaze – care pot numai sa indeparteze o nucleotida de la un capat al lantului
polinucleotidic, si
2. Endonucleaze- care rup legaturile dintre lanturile polinucleotidice
Enzimele Pol I si Pol III de la E.coli au activitate exonucleazica la capatul 3’ .

Alte enzime cu rol in procesul de replicare sunt:


 enzimele de derulare (helicaze), care distorsionează moleculele de ADN la nivelul bifurcaţiei
de replicare (deschide dublul helix);
 ARN-polimeraza de tip primază care determină sinteza unei scurte secvenţe de ARN numită
ARN primer;
 enzimele de relaxare care elimină zonele suprahelicale ce apar de- a lungul moleculei de ADN;
 topoizomerazele (I şi II) care determină suprarăsuciri sau relaxări ale moleculei de ADN;
 ADN ligazele care închid breşele din catenele de ADN asigurând continuitatea acestor
molecule
 RN-aza H şi exonucleaze cu acţiune de tip 5’→3’ care asigură eliminarea ARN primer de la
nivelul fragmentelor Okazaki.
5
Rolul ADN polimeraza in procesul de replicare a ADN
La procariote -Funcţionează trei ADN polimeraze dependente de ADN (I, II si III) (ADN
replicaze), potenţial capabile să asigure sinteza moleculelor de ADN, precum şi alte enzime cum ar fi:
primaza, ligaze, helicaze, topoizomeraze.
Astfel:
 ADN polimeraza I (Pol I sau Pol A) - ea intervine doar în finalul procesului, în umplerea
golurilor rămase după îndepărtarea primer-ului ARN (prin activitate exonucleazică atât de tip
5’→3’cât şi de tip 3’→5’)
 ADN polimeraza II umple golurile dintre fragmentele de ADN sintetizate discontinuu.
 ADN polimeraza III (Pol C) este esenţială pentru replicare dar numai în prezenţa unui primer
ARN. Are funcţie exonucleazică de tip 3'→5', care îi permite corectarea rapidă a
eventualelor greşeli de incorporare.

• Direcţia de înaintare (“citire”) a enzimei pe catena de ADN matriţă este 3'→5'


şi determină realizarea de legături fosfodiesterice (în catena nou sintetizată) în
sensul 5'→ 3'.
La eucariote. Aparatul enzimatic necesar replicării ADN este şi mai complex, existând ADN
polimeraze nucleare, cloroplastice sau mitocondriale :
• ADN-polimeraza a se găseşte numai în nucleu şi este implicată în iniţierea procesului de
sinteză a ADN;
• ADN-polimeraza b , localizată atât în nucleu cât şi în citoplasmă, la nivelul organitelor
celulare, are funcţii reparatorii;
• ADN-polimeraza δ este localizată în nucleu şi este implicată în sinteza catenei în avans la
nivelul bifurcaţiei de replicare. Enzima are şi activitate exonucleazică de tip 3'→ 5',
participând astfel şi la procesul reparator;
• ADN-polimeraza ε localizată tot în nucleu are funcţii multiple: realizează sinteza catenei în
întârziere în cursul replicării; are funcţii reparatorii, de recombinare şi poate exercita
activitate exonucleazică de tip 3’→5’.
Ca şi polimerazele bacteriene, cele de la eucariote necesită ARN primer pentru a declanşa
sinteza ADN, sensul polimerizării fiind acelaşi, 5’→3’.

SINTEZA REPLICATIVĂ A ADN. ETAPE

6
Pentru a realiza sinteza ADN, enzima ADN-polimeraza are nevoie de:
 O matrita monocatenara de ADN;
 Nucleotide sub forma de trifosfati (dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP) necesare pentru sinteza noii
catene; enzima ataseaza nucleotidele numai la extremitatea 3’-OH
 Prezenta unei scurte secvente de nucleotide (de 10- 12 nucleotide) numita primer (pentru ca
enzima nu poate initia sinteza de novo, ci adauga nucleotidele la o catena preexistenta –primer-ce
ofera capatul 3’-OH).

Etapele replicării ADN


Studiul biochimic “in vitro” al replicării ADN a permis stabilirea a trei etape succesive de desfăşurare
a acestui proces:
• iniţierea replicării,
• alungirea catenelor de ADN şi
• terminarea sintezei.

In 1963 Jacob, Brenner şi Cuzin au enunţat ideea funcţionării cromosomului bacterian ca unitate de
replicare pe care au denumit-o replicon.
Ulterior noţiunea de replicon, prin care se înţelege secvenţa de ADN la nivelul căreia se desfăşoară
un proces individual de replicare (cu cele trei etape distincte), s-a extins asupra tuturor elementelor
genetice capabile de replicare autonomă.

1. Iniţierea procesului de replicare


La procariote (bacterii) cromosomul prezintă o singură regiune de origine a replicării, oriC, deci
un singur replicon,
La eucariote, unde cromosomii sunt reprezentaţi de molecule lineare de ADN numărul repliconilor
este mult mai mare (în genomul uman există aproximativ 20.000-100.000 regiuni ori). Acest lucru
explică, între altele, de ce există diferenţe între momentul replicării unor anumite regiuni ale ADN (există
regiuni ale ADN ce se replică la începutul fazei S a ciclului celular şi alte regiuni ale ADN la sfârşitul
acesteia).
Cu ajutorul tehnicilor de clonare a fost stabilită structura şi secvenţa nucleotidică a mai multor
regiuni ori de la virusuri, bacterii şi ADN mitocondrial. Toate aceste regiuni au o serie de caracteristici
comune:
• grad mare de repetitivitate al bazelor;
• conţinut bogat în A–T, ceea ce presupune o separare mult mai uşoară a celor două catene la
nivelul acestei regiuni;

7
• prezenţa unor secvenţe repetate invers care determină capacitatea de a forma structuri
secundare intracatenare de forma “ac de păr” sau “formă de trifoi”, structuri ce uşurează
recunoaşterea regiunilor respective de către enzimele şi proteinele specifice de iniţiere.

INITIEREA REPLICARII începe la nivelul regiunii ori , unde dublul helix de ADN suferă un proces
local de denaturare şi despiralizare catalizat de enzima helicază – care taie legaturile de hidrogen
dintre cele 2 catene.
• După ce procesul de replicare a început procesul de despiralizare şi de formare a unor
suprarăsuciri negative a ADN continuă şi dincolo de regiunea ori, fenomenul realizându-se în
ambele direcţii (bidirecţional).
• Rezultatul procesului de despiralizare şi denaturare localizată este formarea unei regiuni de ADN
monocatenar, în care cele două catene vor servi drept matriţă pentru replicare.

• Separarea celor două catene la nivelul originii replicării determină formarea unei “bifurcaţii de
replicare” (“replication fork”) sau punctul de creştere al ADN .Furca de replicare este o
structura asimetrica din cauza ca cele 2 catene au sensuri diferite datorită polarităţii diferite
a celor două catene. Natura lor antiparalelă face ca una din catene să aibă o extremitate 3'–
OH, iar cealaltă una 5'–P. Bifurcaţia de replicare corespunde regiunii cel mai recent
replicate şi marchează zona de înaintare a replicării pe cromosom
De asemenea, la nivelul bifurcaţiei de replicare se găsesc şi enzimele ce declanşează sinteza noilor
catene de ADN:
• ARN polimeraza (primaza) şi
• ADN polimeraza III (în cazul E.coli)
ADN polimeraza poate cataliza sinteza diferitelor tipuri de ADN celular, dar trăsătura
caracteristică a bifurcaţiei de replicare, formată la nivelul regiunii ori, nu este ADN polimeraza ci un
complex proteic macromolecular denumit primosom
ARN polimeraza (primaza) recunoaşte secvenţa ori şi determină sinteza unei scurte secvenţe
oligonucleotidice ARN (ARN primer) în sensul 5’→3’.
Capătul 3’-OH al primerului este apoi recunoscut de ADN-polimerază care adaugă
deoxiribonucleotidele corespunzătoare (deoxiadenozina, deoxicitidina, deoxiguanozina, timidina) în
sensul 5’→3’.

8
2. Creşterea (alungirea) moleculei de ADN
• ADN–polimeraza nu poate copia, în mod continuu, decât una din catene, pe cea care are
orientarea 3'→5', care a fost denumită catena în avans (“leading chain”), sinteza noii catene
facandu-se in directia 5'→3' .

• Replicarea celeilalte catene trebuie făcută în sens invers faţă de direcţia de înaintare a
bifurcaţiei de replicare.
• De aceea, o altă moleculă de ADN polimerază trebuie să aştepte ca bifurcaţia de replicare să
fie suficient de lungă înainte de a-şi începe activitatea în sens opus (la nivelul unui nou primer
sintetizat tot de primază).
• Sinteza noii catene, complementară catenei matriţă şi orientată în direcţia 5'→3' se face deci
discontinuu şi în întârziere faţă de catena “leading”, motiv pentru care ea se mai numeşte catenă
în întârziere (“lagging chain)”.
• In 1968, Okazaki şi colab. au demonstrat că sinteza catenei în întârziere se realizează
discontinuu, sub forma unor fragmente nucleotidice intermediare scurte, care au fost numite
fragmente Okazaki

9
• Pentru sinteza fiecărui fragment Okazaki este necesară sinteza unui scurt primer ARN, după
care ADN-polimeraza adaugă nucleotidele corespunzătoare la extremitatea 3’-OH a
primerului.
• După sinteza fragmentului Okazaki, ARN-primer este îndepărtat prin excizie (prin intervenţia
RN-azei H şi unor exonucleaze), iar golul rămas este “umplut” de ADN-polimeraza I.
• ADN-polimeraza I se leagă la nivelul unui situs localizat la nivelul extremităţii 3’ a unui
fragment Okazaki şi adaugă nucleotide în sensul 5’→3’, „plombând” catena după
îndepărtarea primerului.
• De asemenea, enzima este capabilă să recunoască şi să “corecteze” eventualele greşeli de
incorporare a nucleotidelor (datorită activităţii exonucleazice 3’→5’).
• Imediat după formare, cele două catene de ADN interacţionează cu proteine specifice, numite
proteine de legare la ADN monocatenar = SSB (“single-strand DNA-binding proteins”) care
stabilizează bifurcaţia de replicare, obligatorie pentru realizarea biosintezei ADN. In absenţa
proteinelor SSB, cele două catene de ADN ar interacţiona între ele prin formarea de legături de
hidrogen între nucleotidele complementare intercatenare sau intracatenare.
Despiralizarea ADN dintr-o regiune a macromoleculei circulare de ADN este obligatoriu urmată de un
proces de supraspiralizare într-o altă regiune a ADN. Pentru ca procesul de replicare să se desfăşoare
normal, suprarăsucirile pozitive trebuie eliminate, fenomenul fiind catalizat de giraze
O altă familie de enzime, topoizomerazele de tip I, relaxează constrângerile structurale printr-un
mecanism diferit. Ele sunt endonucleaze care fac incizii monocatenare în ADN superhelical realizând
despiralizarea, pentru ca apoi, prin activitatea lor ligazică să refacă continuitatea ADN, după ce condiţia
superhelicală a dispărut.

• După utilizarea sa de către ADN-polimerază, ARN primer este îndepărtat de o nuclează numită
RN–ază H care degradează în mod specific ARN din hibrizi ARN – ADN.
• In final, breşele rămase sunt “plombate” de o altă ADN–polimerază care adaugă
nucleotidele complementare, iar ADN–ligaza restabileşte continuitatea normală a moleculei.

10
In cazul eucariotelor, deşi bifurcaţia de replicare se formează într-un mod asemănător bacteriilor,
echipamentul enzimatic localizat la acest nivel şi care formează replisomul este mult mai complex .

3. Terminarea procesului de replicare


• Terminarea replicării se realizează, de obicei, la nivelul unui punct fix în replicarea
bidirecţională.
Procesul de încheiere a replicării este însoţit de mai multe evenimente:
• eliminarea ARN primer sub acţiunea RN-azei H sau a unor exonucleaze (de exemplu, ADN-
polimeraza I care are funcţie exonucleazică 5’→3’ şi 3’→5’);
• “umplerea” breşelor rămase prin eliminarea ARN primer sub acţiunea unor ADN-
polimeraze cu funcţii reparatorii;
• fragmentele Okazaki sunt sudate de către ligază.
• ADN ligaza catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice dintre extremitatea 3’OH a unui
fragment Okazaki şi cea 5’ P a fragmentului următor, procesul realizându-se cu consum
energetic.
La majoritatea procariotelor şi eucariotelor, energia procesului de polimerizare este furnizată de ATP.
Mecanismul reacţiei de polimerizare presupune:
• mai întâi, acceptarea de către enzimă (E) a unui grup AMP (rezultat prin hidroliza ATP), cu
eliberare de pirofosfat:
E + ATP→E - AMP + Ppi
• iar apoi transferarea AMP la capătul 5’ P al ADN:
E - AMP + P - 5’ ADN → E + AMP – P - 5’ ADN
• In final, ADN-AMP interacţionează cu extremitatea 3’OH a ADN, eliberând AMP şi
“sigilând” astfel breşele din catenele ADN.
ADN 3’OH + AMP - 5’ P ADN → ADN 3’ - O - P 5’ ADN + AMP
• In final, giraza şi topoizomeraza refac structura suprahelicală

11