Resumen de la clonación de ADN

La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un

fragmento particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN,
el gen u otro fragmento de ADN de interés (tal vez el gen de una proteína
humana médicamente importante) se inserta primero en un fragmento circular de
ADN llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y
pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN
ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.

Diagrama que muestra la construcción de una molécula de ADN recombinante.

Un fragmento circular de ADN plasmídico tiene extremos irregulares que
coinciden con los de un fragmento del gen. El plásmido y el fragmento de gen se
unen para producir un plásmido que contenga el gen. Este plásmido que contiene
el gen es un ejemplo de ADN recombinante, una molécula de ADN ensamblada a
partir de ADN de múltiples fuentes.

A continuación, se introduce el plásmido recombinante en bacterias. Se

seleccionan las bacterias que contengan el plásmido y se cultivan. Al
reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su descendencia, y de esta
forma hacen copias del ADN que contienen.

¿Qué sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un

plásmido? En algunos casos, necesitamos muchas copias de ADN para realizar
experimentos o construir nuevos plásmidos. En otros casos, el fragmento de
ADN codifica una proteína útil y las bacterias se utilizan como "fábricas" para
 producir la proteína. Por ejemplo, el gen de la insulina humana se expresa en
bacterias E. coli para producir la insulina que usan los diabéticos.
[Más sobre la insulina y la diabetes]

Los pasos de la clonación de ADN

La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos
cómo la clonación de ADN se puede utilizar para sintetizar una proteína (como la
insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:

1. Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de

restricción (que cortan el ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).

2. Transformar bacterias con el plásmido. Se usa selección con antibióticos para

identificar las bacterias que incorporaron el plásmido.

3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas como

"fábricas" para producir la proteína. Recolectar la proteína de las bacterias y
purificarla.

Revisemos con más detalle cada paso.

1. Cortar y pegar el ADN

¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? Un método
habitual utiliza dos tipos de enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasa.

Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco
específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar,
muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos que
sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que se empatan,
pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se combinan para
formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasalas une sellando
los espacios en el esqueleto del ADN.
[Observa un diagrama de las enzimas de restricción y la ADN ligasa]
 Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana,
por ejemplo) en un plásmido. Con ayuda de una enzima de restricción
cuidadosamente elegida, digerimos:

 El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.

 El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar
un plásmido recombinante que contenga el gen.

Diagrama que representa la digestión con enzimas de restricción y la

ligación en un esquema simplificado.

Empezamos con un plásmido bacteriano circular y un gen blanco. En

ambos extremos del gen blanco hay sitios de restricción, secuencias de
ADN reconocidas por una enzima de restricción particular. En el
plásmido, también hay un sitio de restricción reconocido por esa
misma enzima, justo después de un promotor que dirigirá su expresión
en bacterias.

El plásmido y el gen blanco (por separado) se digieren con la enzima

de restricción. Los fragmentos se purifican y se combinan. Ambos
tienen "extremos cohesivos", o salientes de ADN de cadena sencilla,
por lo que pueden pegarse.

La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos

complementarios para formar una única molécula completa de ADN.
Esto produce un plásmido recombinante que contiene el gen blanco.

2. Transformación y selección bacteriana

Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse
plásmidos y otros tipos de ADN en bacterias, como la inofensiva E.
coli que se usa en los laboratorios. Durante la transformación, células
bacterianas preparadas especialmente se someten a un choque (como
alta temperatura) que las anima a incorporar ADN extraño.

El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de

plásmidos deseados, plásmidos de productos secundarios y fragmentos
de ADN lineal) se agrega a las bacterias. Las bacterias se someten a un
golpe de calor, que mejora la eficacia con la que el ADN entra durante
la transformación. Sin embargo, solo una pequeña minoría de las
bacterias incorporará con éxito un plásmido.
[¿Por qué un golpe de calor hace que las bacterias tomen el ADN?]

^1start superscript, 1, end superscript

Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a

antibióticos que permite a las bacterias sobrevivir en presencia de un
antibiótico específico. Así, las bacterias que incorporan el plásmido
pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que contenga el
antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las
bacterias que contienen plásmido pueden vivir y reproducirse. Cada
bacteria sobreviviente dará lugar a un pequeño grupo con forma de
punto, o colonia, de bacterias idénticas que contienen el mismo
plásmido.

Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de

resistencia a antibióticos.

Panel de la derecha: todas las bacterias de la transformación se

colocan en una placa con antibióticos. Las bacterias sin plásmido
mueren a causa del antibiótico. Cada bacteria que tenga plásmido
forma una colonia, un grupo de bacterias clonales que contienen el
mismo plásmido. Una colonia típica se ve como un punto pequeño y
blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.
No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido
adecuado. Eso es porque, durante una ligación, los fragmentos de
ADN no siempre se "pegan" exactamente como queremos. Por el
contrario, debemos recolectar ADN de varias colonias y ver si cada
una contiene el plásmido correcto. Se usan métodos como la digestión
con enzimas de restricción y la PCR para revisar los plásmidos.

3. Producción de proteínas
Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el
plásmido adecuado, podemos hacer crecer un gran cultivo de bacterias
que contengan el plásmido. Luego le damos a las bacterias una señal
química que les ordena producir la proteína blanco.

Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes

cantidades de proteína. Por ejemplo, si nuestro plásmido contuviera el
gen de la insulina humana, las bacterias comenzarían a transcribir el
gen y traducir el ARNm para producir muchas moléculas de la
proteína de la insulina humana.
[Más acerca de la expresión de genes humanos en bacterias]
La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un matraz de 1 litro,
por ejemplo). Se induce la expresión del gen contenido en el plásmido
en las bacterias de ese cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe
en ARNm y el ARNm se traduce en proteína. La proteína codificada
por el gen se acumula dentro de las bacterias.

Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas

pueden romperse para liberarla. Hay muchas otras proteínas y
macromoléculas flotando en las bacterias además de la proteína
blanco (la insulina en nuestro ejemplo). Debido a esto, la proteína
blanco debe ser purificada o separada del resto del contenido de las
células con técnicas bioquímicas. La proteína purificada puede
utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina, administrarse a
pacientes.