Tratamiento de Aguas Residuales
Bioadsorción de metales
Se ha caracterizado la
composición química y los
estados fisicoquímico y ecológico
de las aguas ácidas de dos minas
a cielo abierto de la cuenca del
río Duero. Asimismo, se han
establecido las condiciones para
la obtención y manipulación
adecuadas de diferentes residuos
biológicos, abundantes y baratos,
que se muestren útiles para la
descontaminación de metales
pesados de dichas aguas ácidas.
Se ha ensayado, a escala de
laboratorio (<100 l), una
tecnología innovadora para la
depuración de estas aguas ácidas
contaminadas con metales
pesados, basada en las
características fisicoquímicas de
adsorción, intercambio iónico y
complejación de iones metálicos
(bioadsorción) que poseen
biopolímeros, tales como la
queratina, la quitina y otros
constituyentes mayoritarios de
distintos tipos de residuos
biológicos industriales, como son
las levaduras cerveceras
exhaustas, objeto de detalle en el
presente artículo, y otros como
pelos de cerdo, plumas de ave y
caparazones de cangrejos de río
que serán objeto de un artículo
posterior.
 Ingeniería Química
www.alcion.es
pesados de aguas ácidas
de minas (I)
Sobre residuos de levaduras cerveceras
M. García Roig, F. I. Ramírez Paredes
Dpto. de Química Física. Facultad de Ciencias Químicas.
1. Introducción
La contaminación por aguas de
drenaje ácidas que contienen meta-
les pesados es un problema común
en muchas zonas metalogénicas y
particularmente importante en
explotaciones mineras de carbón o
de metales [1]. En las minas a cielo
abierto tiene lugar un proceso natu-
ral aerobio de biolixiviación debido
a la existencia en el terreno de deter-
minados microorganismos y de
agua (de escorrentías que circulan a
través de cortas, filones piríticos y
escombreras). Las reacciones redox
de tipo bioquímico que constituyen
este proceso de biolixiviación [2-5]
provocan la formación de ácido sul-
fúrico a partir de los sulfuros metá-
licos presentes en los residuos mine-
rales [2], con la consecuente dismi-
nución del pH del agua y la solubili-
zación de los metales pesados que
pueden llegar a difundirse en forma
de contaminación metalogenética a
masas de agua próximas más exten-
sas (ríos, embalses).
Si bien las minas son fenóme-
nos locales y sus mayores impac-
tos sobre los ecosistemas terrestres
y acuáticos son fundamentalmente
de carácter local, no siempre es así
y la dispersión de los metales
pesados puede llegar a ser regional
e incluso más global. Las minas
generan grandes cantidades de
rocas y escombreras que deben
depositarse sobre la tierra o en los
ecosistemas acuáticos. Los resul-
tados principales en términos de
contaminación por metales pesa-
dos son áreas de tierras contami-
nadas baldías, aguas ácidas ricas
en metales surgidas a partir de
residuos y escombreras deposita-
y T. Manzano Muñoz
Universidad de Salamanca
das sobre el terreno y la conse-
cuente contaminación de tierras,
lagos, ríos y áreas costeras. En
este sentido, y como triste ejem-
plo, en España, la dispersión de la
contaminación por metales pesa-
dos y sus nocivos efectos a lo
largo de la cuenca del río Guadia-
mar y del coto de Doñana tuvo su
causa en la rotura del embalse de
las aguas ácidas de la mina de
Aznalcóllar (Sevilla).
Un primer objetivo de este tra-
bajo ha sido la identificación y
evaluación de problemas de conta-
minación metalogénica en aguas
superficiales de diferentes zonas
mineras de las provincias de Sala-
manca y Zamora, donde existen
menas de W, U, Sn, Bi, etc., que en
la actualidad han dejado de explo-
tarse y que mantienen cortas a
cielo abierto desde hace bastantes
años, con volúmenes más o menos
importantes de agua retenida, y
escombreras, en algunos casos, de
notable magnitud.
Dada la creciente percepción de
los riesgos que conlleva la contami-
nación ambiental por metales pesa-
dos, en los casos evaluados positi-
vamente (drenajes ácidos de las
minas Merladet y Fé en la provincia
de Salamanca), nuestro segundo
objetivo sería investigar la capaci-
dad de biorremediación de dichas
aguas ácidas de mina mediante pro-
cesos de bioadsorción por biopolí-
meros abundantes y baratos.
1.1. Bioadsorción de
metales
–––––––––––––––––––––––––––––––
Existen en la naturaleza bioma-
sas muertas e inactivas con capaci-
abril 03
155
 INGENIERIA QUIMICA

Tabla I. Grupos ionizables en polímeros biológicos susceptibles de grupos están sujetos a posibles cam-
participar en la unión de metales bios post- traducción por metilación
in vivo y esto afectará a todas sus
características de carga. Existirán
Grupo Localización pKa centros de carga positiva en los áci-
Carboxilo Proteína c-terminal 3,5-4 dos nucleicos en los grupos amino
Carboxilo Beta aspartato 4-5 de los anillos protonados de la
Carboxilo Gamma glutamato 4-5 purina o de la pirimidina o en el
Carboxilo Acido urónico 3-4,4 nitrógeno heterocíclico también
Carboxilo Acido siálico 2,6 protonado.
Carboxilo Lactato (Acido murámico) 3,8(3,9)
Sulfato Carbohidrato como éster. Sin datos Los polisacáridos considerados
Tirosina (probablemente <-0,5) como grupo son macromoléculas
Acido sulfónico Acido cisteico 1,3 ácidas o neutras con escasos grupos
Fosfato Serina como éster 6,8 funcionales básicos, apareciendo
Fosfato Azúcar o poliol mono éster Pk1 0,94-2,10 como aminoazúcares no acetilados.
Pk2 6,11-6,75 La quitina es un ejemplo notable en
Fosfato Acido teicoico y otro Probablemente similar al la que una proporción de los resi-
polisacárido diéster ácido nucleico duos de glucosamina están no aceti-
Hidroxilo Tirosina fenólica 12,3-13,0 lados, lo que facilita la formación de
Hidroxilo Serina, treonina-alcohol, >13 quitosano deacetilado, con una alta
sacarido-alcohol proporción de centros de carga posi-
(p.ej. Ribosil 2 en ARN) tiva protonable. Algunas de las
Sulfhidrilo Cisteína 10 constantes de ionización representa-
Amino Hexosamina- 7,3/7,7/7,85 tivas para algunos de estos grupos se
ManNH2,GalNH,GlcNH2 pueden observar en la Tabla I.
Amino Proteína N- terminal 7,5-8
Amino Lysina ε 10 La formación de complejos entre
Amino Histidina (pirimidina) 4,11 grupos funcionales orgánicos de
Amino Adenosina (purina) 3,45 biopolímeros adsorbentes y átomos
Amino Guanosina (purina) 1,6 metálicos implica la presencia en
Lactam-NH Uridina (piramidina) 9,17 los restos orgánicos de uno o varios
Lactam-NH Timidina (pirimidina) 9,8 átomos que tengan un par de elec-
Lactam-NH Adenosina (purina) 3,6 trones solitarios para donar. Entre
Lactam-NH Guanosina (purina) 9,2 ellos, los más probables serán áto-
Imidazol- NH Guanosina (purina) 2,3 mos neutros trivalentes de nitró-
Una base de ácido geno y átomos de oxígeno y de azu-
nucleico -NH, o un fre neutros y divalentes que existen
imidazol incluido en la en una amplia diversidad de grupos
unión con la ribosa amino, imino y nitrógenos heterocí-
Imidazol Histidina 6-7 clicos de las proteínas y los ácidos
Guanidino-NH2 Arginina 12 nucleicos, en los grupos carbonilo y
Imino Péptido 13 en los oxígenos hidroxilados distri-
buidos en proteínas, ácidos nuclei-
cos, polisacáridos, polifenoles y
dad para acumular metales por pro- unión catiónica en los biopolímeros poliheterociclos y, finalmente, en el
cesos de bioadsorción, ya que son carboxilo, fosfato y sulfato azufre del grupo tiol y del grupo tio-
poseen biopolímeros con grupos orgánicos. Así, a modo de ejemplo, éter de los aminoácidos cisteína y
funcionales con afinidad para unir el grupo carboxilo está distribuido metionina, respectivamente.
metales presentes en las aguas. ampliamente en los biopolímeros y
Dada la complejidad de la mayor se encuentra casi siempre como 1.2. Biopolímeros de
parte de los biopolímeros, en la constituyente de las cadenas latera- residuos industriales para la
unión entre los iones metálicos y los les de las proteínas, así como en los bioadsorción de metales
biopolímeros pueden intervenir ácidos urónico, neuramínico, murá- –––––––––––––––––––––––––––––––
simultáneamente diferentes tipos de mico y monosacáridos sustituidos
procesos fisicoquímicos: intercam- relacionados de los polisacáridos. El Los biopolímeros naturales han
bio iónico, formación de complejos intercambio de aniones metálicos existido siempre; estas macromolé-
de coordinación, adsorción física, puede tener lugar por medio de una culas producidas por el metabo-
procesos de microprecipitación, amplia variedad de compuestos lismo de seres vivos datan de más de
reacciones redox. En cuanto con- orgánicos basados en nitrógeno. En 3.000 millones de años.
cierne al intercambio de cationes las proteínas, los grupos amino, imi-
metálicos en disolución acuosa, los dazol y guanidina son sitios comu- El uso de estos polímeros para el
principales grupos ionizables de nes de carga positiva. Todos estos intercambio iónico no es en absoluto

156
 INGENIERIA QUIMICA
nuevo. Baste decir que aparece ya
una cita en el Exodo (15:23-25), en
la que se comenta cómo Moisés, tras
ser aconsejado por Jehová, arrojó un
tronco de árbol seco a las aguas sala-
das del río Marah convirtiéndolas en
aguas dulces. Durante mucho
tiempo a lo largo de la historia se usó
la arena y la turba como material de
intercambio iónico, pero no fue
hasta el año 1912 cuando se pensó
que esta capacidad para remover
iones se debía a los grupos ácidos.
El estudio de los polímeros sinté-
ticos es muy reciente; tan sólo
abarca el siglo XX. Aunque el
poliestireno se sintetizó en 1839, el
polietilénglicol en 1860 y el polime-
tilmetacrilato en 1880, la percepción
generalizada de las macromoléculas
no se dio hasta los años 20 [3].
De hecho, el primer material de
intercambio iónico sintético no se
produce hasta el año 1903 por
Harm y Rumpler [4], pero el uso
de fragmentos de discos de gramó-
fono rotos como intercambiadores
iónicos, por Adams y Holmes [5],
no se produce hasta el año 1935,
arrancando así la síntesis de inter-
cambiadores sintéticos propia-
mente dichos. Aunque la mayoría
de los biopolímeros presentan pro-
piedades de intercambio iónico, lo
cierto es que no se han utilizado
mucho con este fin hasta que salie-
ron al mercado los materiales
semisintéticos para el intercambio
iónico. Los biopolímeros son en la
actualidad muy usados en las sepa-
raciones bioquímicas, por ejemplo
para el fraccionamiento de proteí-
nas, polisacáridos y ácidos nuclei-
cos. Y la mayoría, por no decir
todos, de estos materiales de inter-
cambio iónico son polisacáridos.
En 1931 Kullgren [6] fue posi-
blemente el primero en aplicar
para fines analíticos las propieda-
des como intercambiador iónico
de la celulosa modificada al com-
probar que la celulosa tratada con
sulfito era capaz de eliminar los
iones de cobre que existieran en el
agua y que además estos iones de
cobre podían recuperarse después
mediante un tratamiento ácido.
Así, desde los años 50, celulo-
sas tanto de intercambio aniónico
158
como catiónico, dextranos y otros
polisacáridos marinos se han
comercializado con una gran varie-
dad de grupos de intercambio.
Mucho más recientemente ha
comenzado a existir cierto interés
por la quitina y su derivado el qui-
tosano como agentes de unión
iónica [7] aplicables para gran
variedad de usos en la industria.
Alginatos
Existen varios estudios acerca de
la capacidad de adsorción de los
alginatos o de otros componentes de
las algas [7]. De hecho, los alginatos
funcionan como una mezcla de resi-
nas de intercambio iónico, produ-
ciéndose en ellos procesos de inter-
cambio aniónico-catiónico y de
adsorción. En muchos casos, la
unión a ciertos metales es función
directa del pH, la presencia de ligan-
dos competidores o de iones [8].
Aderhold y col. [9] estudiaron la
capacidad de eliminación de meta-
les como el cobre, plomo, níquel,
zinc y cadmio por algas feófitas
como Ecklonia máxima, Lessonia
flavicans y Durvillea potatorum.
En estos experimentos, se cons-
tata la necesidad de encontrar una
relación entre los porcentajes de
adsorción para aguas sintéticas (con
un solo metal) y aguas residuales
fuertemente contaminadas con
varios metales y, por tanto, suscepti-
bles de sufrir fenómenos de compe-
tencia. Se han establecido unos
valores de pH en torno a 4 para la
adsorción de la mayoría de los iones
catiónicos. Sin embargo, también se
ha visto que, para la eliminación de
ciertos metales como el Au III, Ag I
y el Hg II, el pH es muy poco influ-
yente [10].
Carvalho y col. [11] demuestran
que en algas los alginatos no son los
absolutos responsables de los proce-
sos de adsorción, tras haber estu-
diado comparativamente la capaci-
dad de adsorción de Cu, Cd y Zn por
células de Ascophyllum nodosum.
Celulosa y derivados
Shukla y Sakhardande [12] lle-
varon a cabo estudios sobre la
adsorción de diferentes cationes
metálicos (Fe2+, Fe3+, Pb2+, Hg2+)
sobre materiales celulósicos tales
como fibras de algodón, pulpa de
bambú blanqueada, fibras de yute
y serrín, comprobándose niveles
de bioadsorción de hasta el 96% en
algunos casos.
Otros materiales celulósicos
abundantes, baratos y de origen
agrícola, pueden eliminar cantida-
des considerables de iones metáli-
cos de las disoluciones acuosas. En
este sentido, Eromosele y Otito-
laye [13] utilizaron las cáscaras de
las semillas de la planta silvestre
Butyrospermun Parkii, disponibles
en grandes cantidades como sub-
producto que se desechaba, com-
probando su capacidad para bioad-
sorber iones hierro, cinc y plomo
de disoluciones acuosas. Asi-
mismo, las pieles de las almendras,
subproducto de las industrias de
repelado de almendras, debido a su
elevado contenido en celulosa,
podrían encontrar aplicación en la
eliminación de metales tóxicos de
aguas residuales industriales.
La celulosa es insoluble en la
mayoría de los disolventes, pero
puede disolverse si se bloquean los
grupos hidroxilos como aductos de
sulfuro de carbono, el análogo con
azufre del CO2. El grupo funcional
restante se denomina xantato, y
éstos también han sido estudiados
como productos fácilmente obteni-
bles a partir de residuos industria-
les como el serrín, pulpa de maíz,
paja y cartuchos de filtros de celu-
losa. En este sentido, Holland [14]
observó que la capacidad de elimi-
nación de metales variaba en fun-
ción del número de grupos hidro-
xilo bloqueados, y que además
existían complicaciones como el
fuerte olor producido por la des-
composición de los xantatos, la
gran cantidad de agua de lavado
que era necesario utilizar, etc. Con-
cluyó que existía una imposibili-
dad práctica de desarrollar estos
procesos a gran escala.
Pectinas
Las pectinas son heteropolisacá-
ridos que se encuentran como sus-
tancias cementadoras en las paredes
celulares y en las capas intercelula-
res de todas las plantas terrestres,
 INGENIERIA QUIMICA
entre ellas la remolacha azucarera.
Químicamente están formadas por
polímeros del ácido galacturónico,
parcial o totalmente esterificado con
metanol. El polímero totalmente
desmetilado se denomina ácido péc-
tico y sus sales pectatos.
La pulpa de la remolacha azuca-
rera es un residuo abundante y
barato de las industrias azucareras y
es capaz, gracias a su contenido en
pectinas y mediante procesos de
intercambio iónico, adsorción y
quelación, de atrapar metales pesa-
dos de las aguas (Cu2+ eficacia
similar que para el Pb2+, ambos más
eficaces que para el Cd2+ que es
similar al Zn2+, Ni2+ y al Ca2+)
[15]. Asimismo, la pectina extraída
de dicha pulpa, después de procesos
de acilación por simple hidrólisis
alcalina, acumula Cd2+ tan eficaz-
mente como el alginato, eluyéndose
con cloruro cálcico 0,3 M [16].
Levaduras
Los residuos de levaduras como
subproductos de las industrias de
fermentación (cerveza, antibióti-
cos, etc.) presentan una afinidad
notable por los iones metálicos en
disolución (Zn, Cd, Ni, Pb, Cr,
Ag.), afinidad que es función del
pH, y se pueden utilizar, por tanto,
en procesos de bioadsorción para
la descontaminación de aguas con
metales [17].
La utilización de biomasa fún-
gica para los estudios de biorreme-
diación se basa en la capacidad de
las paredes de estos microorganis-
mos (cuyos componentes más sig-
nificativos son los polisacáridos
quitina y α (1, 3) ß-D-glucano)
para bioadsorbedor los metales
pesados independientemente de los
procesos internos que estén suce-
diendo en la célula, es decir, que se
puede partir de biomasa muerta sin
alterar las propiedades y benefi-
ciarse así de su mayor facilidad de
uso. Los procesos comunes son de
intercambio iónico y la capacidad
de adsorción puede ser manipulada
por una serie de mecanismos físi-
cos y químicos que tienen lugar a
nivel de la superficie celular. Esta
biomasa puede ser utilizada en bio-
rreactores de lecho empaquetado o
de flujo continuo [18].
160
Estudios llevados a cabo por
Guibal y col. [19] mediante espec-
troscopia IR han demostrado la
unión del catión uranilo a los gru-
pos amino del quitosano de la
pared celular de varias biomasas
típicas de algunas fermentaciones
industriales, como son Aspergillus
niger, Penicillium chrysogenum y
Mucor miehei. Esta unión del ura-
nilo a los sitios amino les confiere
una estructura similar a la de los
grupos amida, por lo que la unión
del metal provoca cambios en las
intensidades relativas de las ban-
das amina o amida.
La complejación del uranilo por
los ligandos amino están goberna-
dos por el pH. Asimismo, Tsezos y
Volesky [20] ya citaron algunas de
las propiedades de unión del ura-
nio a Rhizopus arrhizus, señalando
que los procesos de adsorción a las
paredes de quitina de dicho hongo
por parte del uranilo ocurren de
forma muy rápida, mientras que la
precipitación de hidróxido de ura-
nilo dentro de la estructura de la
pared celular se da en más baja
proporción. Asimismo señalaron
que se daban procesos de interfe-
rencia con otros iones como hierro
y zinc.
En el año 1995, Simmons y col.
[21] realizaron estudios referentes a
las capacidades de unir metales de la
levadura de cerveza (Saccharomyces
cerevisiae), que será uno de nuestros
materiales de estudio, y de Candida
albicans, obtenidas como residuos
industriales. En dicho estudio, ya se
encontraron notables diferencias
entre diferentes cepas de Saccha-
romyces (con diferentes estructuras
en su pared celular) y entre ésta y
Candida en la eliminación de meta-
les (cobre, plata) de las aguas.
Así, la adsorción de Cu II está
fuertemente influida por el pH
[22]. Mediante el uso de electrodos
selectivos de iones, se observó la
liberación de gran cantidad de
agentes complejantes de cobre
(posiblemente proteínas y carbohi-
dratos). En contraste con esto,
estos agentes no presentaron acti-
vidad complejante con la plata.
Incidiendo más en Saccharomy-
ces, Brady y col. [23] estudiaron
sus propiedades más particular-
mente llegando a la conclusión de
que se trataba de un buen agente
bioadsorbente a pH entre 5-9. Sim-
mons y col. [24] han estudiado la
respuesta de Saccharomyces frente
a la adsorción de plata en función
de la edad de la biomasa. Llegaron
a la conclusión de que aquellas
cepas más viejas presentaban valo-
res más bajos de eliminación de
metales que las más jóvenes, y esto
debido fundamentalmente a un
descenso en el número de comple-
jos de plata en el interior de la
célula. De esta manera, queda
claro que en estos procesos inter-
viene no sólo la pared externa del
hongo sino también su interior,
presentando agentes que aumentan
la eficacia del proceso de elimina-
ción. De ahí también que se haya
observado una mayor eliminación
usando biomasa formada por célu-
las completas que aquella formada
sólo por pared celular.
2. Materiales y
métodos
Materiales
Los reactivos ácido sulfúrico,
ácido clorhídrico 35% (Panreac, Bar-
celona, España), hidróxido sódico,
nitrato de uranilo hexahidratado
(UO2(NO3)2.6H2O) (Merck, Darms-
tadt, Alemania), arsenazo III, plomo
en polvo (Fluka Chemie Gmbh,
Buchs, Suiza), Tritón X100 (Sigma
Chem. Co.), Hypol 2002 (Grace Ser-
vice Chemicals Gmbh, Heilderberg,
Alemania), agua de calidad ultrapura
Milli-Q (Millipore) se obtuvieron de
las mencionadas fuentes.
Varias muestras húmedas de
Saccharomyces cerevisiae fueron
donadas por el grupo Cruz Campo
S.A. (Sevilla). Estas levaduras
exhaustas se recogieron de los fer-
mentadores industriales de la
empresa y se conservaron en
cámara frigorífica a 4°C.
Aguas de minas
Las tomas de muestra de las
aguas de corta de las minas se lleva-
ron a cabo en la primavera de 1999
transportándose y almacenándose a

temperatura ambiente en bidones de
PVC previamente lavados con ácido
clorhídrico 2N. Estas muestras de
agua procedían de las cortas de las
siguientes minas:
1) Mina Feli o Alabancos en el dis-
trito minero de Barruecopardo-La Fre-
geneda (La Fregeneda, Salamanca),
con los minerales casiterita (Sn02), wol-
framita [(Fe,Mn)W04], arsenopirita
(FeAsS), pirita (FeS2), lepidolita
[K2Li3A14Si7021(OH,F)3].
2) Mina Merladet en el distrito
minero de Barruecopardo-La Frege-
neda (Barruecopardo, Salamanca)
con los minerales scheelita (CaW04),
wolframita, arsenopirita y pirita.
3) Mina Terrubias en el distrito
minero de Morille – Martinamor
(San Pedro de Rozados, Sala-
manca), con los minerales schee-
lita, wolframita y casiterita.
4) Mina Alegría en el distrito
minero de Morille – Martinamor
(Morille, Salamanca), con los
minerales scheelita, wolframita,
casiterita.
5) Mina Dorinda en el distrito
minero del Granito de Ricobayo
(Villalcampo, Zamora), con el
mineral casiterita.
6) Mina Fe de ENUSA en el
distrito minero de Ciudad Rodrigo
(Saelices el chico, Salamanca), con
los minerales pechblenda [Com-
plejo], pirita y marcasita (S2Fe).
Instrumentación
Los instrumentos y equipos utili-
zados en este trabajo han sido: agita-
dores magnéticos BUNSEN MC-8,
pHmetro CRISON micro 2001,
equipo de ultrasonidos Granzón
2200, centrífugas Centrolit "Selecta
P" y Centromix, pipetas automáticas
Biohit Proline, filtros Millipore,
Millex-Gs Sterile 0,22 mm, picadora
Moulinex, balanzas Mettler Toledo
AB204 y Precisa 600C, horno de
secado WTB Binder, reactores de
vidrio y metacrilato de tanque y
columna, bombas peristálticas GIL-
SON Miniplus 2 e Ismatec, conductí-
metro, salinómetro, turbidímetro y
termómetro (sonda multiparamétrica
WTW Profilab), equipo de ecotoxici-
dad GEM Biochemical Inc. Bacterial
Systems "BG-1", espectrofotómetro
UV-Visible Hitachi 150-20, equipo
de análisis cuantitativo de metales y
otros elementos químicos por ICP
Plasma (Servicio Central de Análisis
de la Universidad de Salamanca),
espectrofotómetro de absorción ató-
mica (amablemente cedido por el
Dpto. de Química Analítica, Nutri-
ción y Bromatología de la Universi-
dad de Salamanca).
Preparación de la biomasa de
Saccharomyces cerevisiae
En los experimentos de bioad-
sorción, esta biomasa se utilizó: a)
En forma libre, sin ninguna modi-
ficación, es decir suspendiéndola
directamente en las aguas contami-
nadas con metales y después sepa-
rándolas por centrifugación. b)
Inmovilizada físicamente en el
polímero sintético espuma reticu-
lada de poliuretano.
Inmovilización de las levaduras
La inmovilización de las células
de Saccharomyces cerevisiae se llevó
a cabo por atrapamiento físico de las
mismas en espuma reticulada de
poliuretano, quedando el microorga-
nismo físicamente incluido dentro de
la matriz del polímero fuertemente
entrecruzado. Esta matriz se sintetiza
a partir de un poliisocianato hidrófilo
(Hypol 2002) suministrado por Grace
Service Chemicals Gmbh (Heidel-
berg, Alemania).
El procedimiento experimental
de inmovilización de células con-
sistió en:
1) Disolver 1,00 g de levadura
liofilizada en 40,0 cm3 de disolu-
ción de NaCl (8,5 g/1), determi-
nando su contenido en proteína
(mg proteína/cm3) mediante el
método de Lowry.
2) Mezclar lentamente, sin dejar
de agitar, los 40,0 cm3 de Saccha-
romyces con 20,0 g del prepolí-
mero Hypol 2002.
3) Dejar reposar durante 10 min.
4) Cortar la espuma reticulada
de poliuretano con células atrapa-
das en pequeñas láminas o cubos,
conservándose en la disolución de
NaCl (8,5 g/1) a 4°C.
Síntesis de la espuma reticu-
lada de poliuretano
La síntesis de la espuma reticu-
lada de poliuretano se llevó a cabo
Tratamiento de Aguas
Residuales
en las mismas condiciones y
siguiendo el mismo procedi-
miento experimental antes visto,
con la excepción de que en este
caso la mezcla se hacia con 40,0
cm3 de NaCl (8,5 g/1) más 20,0 g
de Hypol 2002. Esta matriz plás-
tica, vacía del microorganismo,
servirá de control en todos los
experimentos a fin de evaluar la
posible adsorción de los metales
sobre la matriz polimérica de
poliuretano.
Análisis fisicoquímico, quí-
mico y radiológico de las aguas
Los parámetros fisicoquímicos
que se determinaron (unos in situ y
otros en el laboratorio) en las
aguas de mina fueron la tempera-
tura, el pH, la conductividad espe-
cífica, el oxígeno disuelto, la turbi-
dez, la demanda química (DQO) y
demanda bioquímica de oxígeno
(DBO) siguiendo los métodos
habituales (Standard Methods)
para el análisis de aguas y aguas
residuales [3].
El análisis químico cualitativo
de las aguas se llevó a cabo obte-
niendo de las muestras su residuo
seco por calentamiento en estufa a
98 °C y efectuando, asimismo, una
precipitación química selectiva,
variando progresivamente el pH.
Sobre los residuos secos y los pre-
cipitados obtenidos se procedía a
un análisis químico por Barrido
Energético de Dispersión de Rayos
X (EDAX).
El análisis químico cuantitativo
de las muestras de aguas se llevó a
cabo por Espectroscopia de Emi-
sión de Inductividad Acoplada de
Plasma (ICP plasma) en el Servi-
cio Central de Análisis de la Uni-
versidad de Salamanca.
Con el fin de confirmar la posi-
ble radiactividad de algunas mues-
tras de agua, por el Laboratorio de
Radiactividad Medioambiental de
la Universidad de Salamanca se
determinaron (con réplicas) las
radiactividades α y β de muestras
de aguas ácidas de la corta 1 de la
mina Fe de ENUSA para extrac-
ción de uranio. Se siguieron méto-
dos estándar [3], mejorados por
Morón y col. [25-27].
abril 03
161
 INGENIERIA QUIMICA
Análisis ecotoxicológico de las
aguas
Según el test de bioluminiscencia
de Photobacterium phosphoreum
(test de Ames), se considera que una
muestra líquida es tóxica cuando se
produce una inhibición de la luminis-
cencia de dichas bacterias superior a
un 20% (umbral de toxicidad) en el
análisis llevado a cabo a 15°C y en
15 min. La cuantificación de la toxi-
cidad de las muestras se realiza de
acuerdo al EC50 (concentración
efectiva máxima: valor de dilución
de la muestra para la cual se produce
una inhibición del 50% de la lumi-
niscencia) y según la norma
ANFORT T-90-320.
Análisis químico del catión
UO22+
Se utilizó un sistema de inyección
en flujo (FIA) de dos canales con un
punto de confluencia. El portador era
una corriente de 3,6 M HCl, mientras
que por el canal del reactivo circu-
laba una corriente de 2.0.10-4 M
Arsenazo en 3,6 M HCl y en presen-
cia de Tritón X-100 al 1%. El caudal
de las corrientes de portador y reac-
tivo era de 2.0 cm3/min.
El análisis del catión uranilo en las
aguas se realiza mediante un método
rápido y sensible [28], que evita una
manipulación para conseguir la
reducción de U(VI) a U(IV) al inser-
tar una minicolumna reductora de
plomo dentro del sistema FIA [29].
Las disoluciones patrón y las
muestras se introducían en el sistema
FIA mediante una válvula de inyec-
ción (100 µl) para pasar, a continua-
ción, esta disolución de uranio (VI) a
través de la columna reductora de
plomo insertada en el canal de
entrada de muestra (CR, 2 mm de diá-
metro interno y 5,5 cm de longitud),
produciéndose la reducción a uranio
(IV), evitando así el contacto con el
oxígeno del aire. Posteriormente, el
bolo de muestra confluía con la
corriente de reactivo y en su paso por
el reactor helicoidal (1 m) se formaba
el complejo U(IV) - Arsenazo III
cuya absorbancia se registraba a la
longitud de onda de 665 nm. La
medida de la altura de los picos obte-
nidos para cada una de las disolucio-
nes inyectadas está directamente rela-
162
Cu residual/mg/l
Tiempo/min
Figura 1. Cinética de bioadsorción del Cu de la disolución acuosa ácida en contacto con Saccharomyces sp. a distin-
tas concentraciones iniciales del metal
cionada con la cantidad de muestra
inyectada y con la concentración de
uranio en la misma.
Procedimiento experimental
para las cinéticas y las isotermas
de bioadsorción
Los experimentos cinéticos de
bioadsorción se llevaron a cabo a
20°C mediante incubación con la bio-
masa (25 g) en reactor de tanque agi-
tado (120 r.p.m.) de 5 disoluciones
acuosas de 10 l de volumen cada una
y de concentraciones diferentes en un
único metal (entre 114 y 0,6 mg/1).
La toma de muestras de agua (alícuo-
tas de 10 cm3) se efectuó a tiempos
prefijados entre 0 y 24 h, separando la
levadura por centrifugación y estabi-
lizando cada disolución del metal
sobrenadante añadiendo otros 10 cm3
de 0,01 M H2SO4. Los experimentos
de equilibrio (isotermas de bioadsor-
ción) se efectuaron en lotes en pre-
sencia de una concentración cons-
tante de biomasa. El equilibrio se
consideró alcanzado a 20ºC en un
periodo de una hora de incubación,
tras el cual se extraía una muestra de
la disolución acuosa en la que medir
la concentración del metal.
El análisis de los metales en estas
disoluciones ácidas sobrenadantes
se realizaba mediante espectrofoto-
metría de absorción atómica a la
llama, a excepción hecha del Al que
se analizaba por espectrofotometría
UV-Visible, siguiendo el método de
la eriocromocianina-R y realizán-
dolo en continuo mediante análisis
por inyección en flujo (FIA).
Ajuste estadístico de los datos
El ajuste de los datos cinéticos y
de equilibrio de bioadsorción a
diferentes ecuaciones y modelos se
ha llevado a cabo con el paquete de
software científico SIMFIT, cuyo
autor es el Prof. W.G. Bardsley de
la Universidad de Manchester
(Reino Unido).
3. Resultados y
discusión
3.1. Caracterización
fisicoquímica,
ecotoxicológica y química
de las aguas de mina
–––––––––––––––––––––––––––––––
Dado que el objetivo inicial del
estudio era identificar y caracterizar
aguas ácidas de minas en la cuenca
del río Duero y más concretamente
en las provincias de Salamanca y
Zamora, tras la toma de muestra de
agua de cada una de las seis minas, se
comprobó que las aguas de las cortas
de las minas Merladet y Fé eran las
únicas aguas ácidas y ecotóxicas con
las que contar para nuestros estudios
posteriores de biorremediación de las
mismas (Tabla II). Con el propósito
 INGENIERIA QUIMICA

de conocer la composición química

Tabla II. Parámetros fisicoquímicos de las diferentes aguas de minas evaluadas
de tales aguas ácidas, se efectuaron
análisis químicos cuantitativos por
Aguas T pH O2 Conductividad Turbidez Acidez Ecotox Radioactividad espectroscopia de emisión de induc-
de mina °C soluble u.nefelom. mgCaC03/l equitox/m3 Bq/1 tividad acoplada de plasma (ICP),
mg/l mS/cm con los resultados que se recogen en
la Tabla III.
Merladet 12,9 3.16 12,2 0.91 0,91 96,0 14.6 0
Fé 9,0 3.10 100 6.4 15 100 69.2 978± 11 Como principales conclusiones
Feli 20,6 6.8 (-) 0 de este primer estudio cabe comen-
Terrubias 11,6 6.45 12,5 349 (-) 0 tar que se demuestra una estrecha
Alegria 11,8 6.45 (-) 0 correlación entre el pH ácido y la
Dorinda 11,2 6.9 8,8 60,2 11,3 (-) 0 concentración de metales en las
aguas. Así, las aguas de corta de pH
DQO y DBO5 fueron nulos para todas las aguas, es decir, no contaminación orgánica. ácidos (mina Merladet y Fé) son las

Tabla III. Análisis cuantitativo de los elementos químicos componentes de las aguas de corta de las minas Fé y Merladet
(concentraciones expresadas en ppm)

AGUA S Mg Ca Na K Li Si Mn Al Fe Zn Cu Ni
Fé 1501,8 781,7 267,9 34,89 6,36 0,63 12,13 114,1 89,43 6,26 7,12 0,54 4,68
Merladet 176,80 38,56 119,0 25,24 3,97 0,19 28,58 3,1 8,76 2,39 3,6 0,50 0,50
Concentración de catión uranilo en las aguas de la mina Fé: 40 mg/l.

que presentan mayores niveles de

Tabla IV. Porcentajes máximos de metal bioadsorbido de disoluciones acuosas áci- metales y de sulfatos en disolución
das de un único metal en incubación en discontinuo (batch) con Saccharomyces sp. y (datos no mostrados), siendo, ade-
a diferentes concentraciones iniciales del metal. más, las únicas aguas de las minas
analizadas que dan positivo el test
Cu Mn Ni Zn Al de ecotoxicidad de Ames.
Co % Co % Co % Co % Co %
mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l Los principales metales existen-
tes en estas aguas son aluminio,
84 53 111 43 114 40 107 76 84 100* manganeso, hierro, níquel, cinc y
17 45 19 61 15 44 24 71 17 100* cobre, estando el agua ácida de la
7 47 5 48 6 48 6 66 7 30 mina Fé significativamente más
2 70 2 62 1,5 43 2 64 1,3 100* contaminada (2870 mg/l de carga
0,8 42 0,6 61 0,6 36 0,8 58 0,7 26 química inorgánica) que el agua de
*Muestras contaminadas con Cladosporium sp. la mina Merladet (411 mg/l carga
química) y poseyendo aquélla,
además, una característica diferen-
ciadora, que es la presencia de
catión uranilo UO22+ (40 mg/1).
Tabla V. Porcentajes máximos de metal bioadsorbido de las aguas ácidas de la
mina Merladet (Barruecopardo, Salamanca) por Saccharomyces cerevisiae en sus- Además, se puede observar que
pensión libre las aguas examinadas muestran un
cierto grado de mineralización
Cu Mn Ni Zn (conductividad específica más bien
baja), escasa turbidez y elevado
Co % Co % Co % Co %
grado de oxigenación.
94 12 110 2,4 87 42 118 12
55 5 67 38 61 15,8 70 7 3.2. Bioadsorción de
30 16 33 37 36 44 45 0 metales de aguas ácidas
7 39 11 3,5 9 9 12 0 sintéticas
1,8 47 5 0,2 2,6 11 5,4 - –––––––––––––––––––––––––––––––
0,9 77 4 2,7 1,0 16 4 0
0,5 >80 3 3,2 0,5 40 3,6 0 Considerando la abundancia y el
Co: concentraciones expresadas en p.p.m. bajo coste del residuo de levaduras
cerveceras, se eligió esta biomasa de

164
 INGENIERIA QUIMICA

Saccharomyces cerevisiae como pri-

mer candidato con el que estudiar la
biorremediación de estas aguas áci-
das de minas. Dado que Al, Cu, Mn,
Ni y Zn eran los metales mayorita-
rios, el primer experimento consistió
en estudiar la selectividad, la cinética
y el equilibrio de bioadsorción de
cada uno de estos cinco metales
disueltos en agua destilada de pH
ácido (3.3-4.5) por las levaduras
exhaustas de cerveza.

Los resultados de este estudio se

recogen en las figuras 1 (para el caso
del Cu a modo de ejemplo) y 2 y en
la Tabla IV y de ellos se pueden
deducir las siguientes conclusiones:
Figura 2. Isotermas de bioadsorción de los metales de la disolución acuosa ácida por la acción de Saccharomyces sp. en sus-
1) En cuanto a la selectividad de pensión libre

la biomasa por los distintos meta-

les y su capacidad de bioadsorción
(Tabla IV), se comprueba que los
mayores porcentajes de elimina-
ción corresponden al Zn (76%)
seguido de Cu (70%), Mn (62%),
Ni (48%) y Al (30%).
2) Las cinéticas de eliminación
de cada metal disuelto en el agua
sintética por bioadsorción sobre
Saccharomyces sp. son de primer
orden respecto de la concentración
del metal ([Metal]disolución = Ae-kt +
C), alcanzándose el equilibrio en
los primeros 15-20 minutos, lo que
apunta a un proceso rápido de
adsorción superficial del metal
sobre la biomasa.
Para el caso de la bioadsorción
del Cu, k = 0,139 min-1, es decir
que el 50% de bioadsorción del
metal sobre la levadura se consi-
gue a los 5 min de proceso (t1/2).
3) Las isotermas de bioadsorción de
los metales sobre la biomasa (Fig. 2)
parecen ajustarse al comportamiento de
cíficas (efecto hidrofóbico, polares,
van der Waals) entre el catión metá-
lico y los distintos grupos funciona-
les sobre la superficie del microor-
ganismo pueden tener un menor
grado de participación.
4) Durante los experimentos de
bioadsorción de los metales disuel-
tos por las levaduras, el pH de las
aguas aumentaba de manera espon-
tánea desde sus valores iniciales (pH
3.3-4.5) hasta alcanzar valores en
torno a 5.5-6.0 (datos no mostra-
dos). Es decir, el proceso de bioad-
sorción del metal sobre las levadu-
ras neutralizaba parcialmente dichas
disoluciones acuosas ácidas.
Cu elim/ mmol/g
De la curva de valoración (pH
frente a NaOH añadido) de la bio-
masa disuelta en agua (datos no
mostrados), se ha deducido la exis-
tencia en ella de al menos cuatro
grupos químicos ácido-base, con
pK aparentes 3,7, 4,5, 6,8 y 9,5.
Conviene citar como de espe-
cial interés el hecho de que al rea-
lizar el experimento de bioadsor-
ción del aluminio sobre las levadu-
ras, los sobrenadantes de algunas
muestras alícuotas separadas del
biorreactor y una vez filtradas y
aciduladas con 0,01 M H2SO4 se
contaminaron con un microorga-
nismo, que posteriormente se iden-

Langmuir [Metaladsorbido/masa adsor-

b e n t e = K b [ M e t a l ] equilibrio/
(1+K[Metal]equilibrio)]. Las constantes de
afinidad para la unión metal-bioadsor-
bente son: K=7,29 (Zn), 3,65 (Cu), 3,31
(Mn) y 3,20 (Ni) dm3/mmol, y las cons-
tantes de capacidad de unión: b = 0,076
(Zn), 0,069 (Cu), 0,060 (Mn) y 0,059
(Ni) mmol/g.

Se propone que en el proceso de

bioadsorción participan mayorita-
riamente interacciones fisicoquími-
cas específicas (de tipo intercambio Cu residual/ mM
iónico, coordinación, complejación
de metales), si bien interacciones Figura 3. Isoterma de adsorción tipo Langmuir del Cu del agua ácida de la mina Merladet por Saccharomyces cere-
más físicas y lábiles y menos espe- visiae en suspensión libre

166
 Tratamiento de Aguas
Residuales

téticas, se propone que en el proceso

Tabla VI. Evolución de la ecotoxicidad de las aguas ácidas por incubación con la de bioadsorción participan mayorita-
matriz soporte vacía y cargada de células de Saccharomyces cerevisiae. riamente interacciones fisicoquími-
cas específicas (de tipo intercambio
iónico, coordinación, complejación
Muestra Poliuretano (± levadura) EC 50% de metales), si bien interacciones
Equitox/m3 más físicas y lábiles y menos especí-
200 cm3 agua ácida 11,5 g (- Saccharomyces) 14,63
ficas (efecto hidrofóbico, polares,
200 cm3 agua ácida 13,7 g (+ Saccharomyces) -
van der Waals) entre el catión metá-
200 cm3 lixiviado 11,3 g (- Saccharomyces) 8,20
lico y los distintos grupos funciona-
200 cm3 lixiviado 13,6 g (+ Saccharomyces) -
les sobre la superficie del microorga-
nismo puedan tener un menor grado
de participación.

tificó como el hongo filamentoso
Cladosporium sp. En consecuen-
cia, los correspondientes resulta-
dos de eliminación de Al por Sac-
charomyces cerevisiae fueron arte-
factos pero sorprendentes, ya que
Cladosporium sp. eliminó porcen-
tajes del orden del 70% del Al pre-
sente en las aguas. Este hallazgo
novedoso (no descrito en biblio-
grafía) podría servir de base para
futuros estudios de biorremedia-
ción de aguas ácidas con metales
pesados por la acción de este
microorganismo que, por otra
parte, creció espontánea y notable-
mente en aguas de pH 2.0-3.5.
3.3. Bioadsorción de
metales de aguas ácidas de
mina
–––––––––––––––––––––––––––––––
Conocida la selectividad, cinética
y capacidad de bioadsorción de cada
metal disuelto en agua ácida sintética
por la acción de Saccharomyces
cerevisiae, en el siguiente estudio se
pretendía comprobar dichos paráme-
tros para los procesos de bioadsor-
ción de los metales que contaminan
las aguas ácidas reales de la mina
Merladet (Barruecopardo, Sala-
manca) por la acción de las levaduras
cerveceras. Los experimentos son
análogos a los realizados en el estu-
dio anterior manteniendo las mismas
condiciones y el mismo tipo de aná-
lisis de las muestras.
Dada la baja contaminación meta-
logénica de las aguas ácidas de la
corta principal de la mina Merladet
(3,6 mg./l Zn, 3,1 mg/1 Mn, 0,5 mg/1
Cu, 0,5 mg/1 Ni según Tabla III), las
muestras de agua fueron dopadas
cada una por separado con cada metal
a estudiar su bioadsorción hasta con-
seguir siete concentraciones diferen-
tes entre 118 y 0,5 mg/1. Aunque el
análisis y seguimiento se hace de un
solo metal cada vez, en el agua de
corta están presentes los otros meta-
les, además de otras especies quími-
cas que pueden interferir o competir
con el propio proceso de bioadsor-
ción por levadura (Tabla III).
Los resultados de este estudio se
recogen en la figura 3 (para el caso
del Cu a modo ilustrativo) y en la
Tabla V, y de ellos se pueden dedu-
cir las siguientes conclusiones:
1) En cuanto a la selectividad y
capacidad de bioadsorción de los
distintos metales por la biomasa,
se comprueba que los mayores
porcentajes de eliminación corres-
ponden al Cu (80% eliminación, es
decir 0,19 mgCu/g bioadsorbente)
seguido de Ni (25 %, 0,24 mgNi/g
bioadsorbente) y Mn (3%, 0,026
mgMn/g bioadsorbente).
2) La cinética de bioadsorción de
los metales disueltos en el agua
ácida de mina por Saccharomyces
sp. es rápida, siendo de primer orden
respecto de la concentración del
metal ([Metal]disolución = Ae-kt + C) y
alcanzándose el equilibrio en los
primeros 10-15 minutos (datos no
mostrados), lo que apunta a un pro-
ceso rápido de adsorción superficial
del metal sobre la biomasa.
3) Las isotermas de bioadsorción
del Cu (Fig. 3) y los demás metales
(datos no mostrados) sobre la bio-
masa parecen ajustarse al comporta-
miento de Langmuir [Metaladsor-
bido/masa adsorbente=Kb[Metal]equili-
brio/(1+ K[Metal]equilibrio)]. La cons-
tante de afinidad para la unión Cu-
bioadsorbente es K = 2,46 dm3/mmol
y la constante de capacidad de unión
b = 0,1 mmol/g.
Al igual que con aguas ácidas sin-
4) Durante los experimentos de
incubación de las aguas ácidas de
corta con las levaduras, el pH de
las aguas aumenta de manera
espontánea desde sus valores ini-
ciales (pH 3.3) hasta alcanzar
valores en torno a 4.0-4.6 (datos
no mostrados). Es decir, el pro-
ceso de bioadsorción del metal
sobre las levaduras neutraliza par-
cialmente dichas aguas ácidas de
mina.
5) Comparando los procesos de
bioadsorción de metales por Sac-
charomyces sp en aguas sintéticas
y en aguas de la mina Merladet
(aunque dopadas) se observan
valores muy similares en cuanto a
la eliminación de los metales Cu y
Ni, siendo, sin embargo, sensible-
mente menor la eficacia del pro-
ceso con aguas reales para el caso
del Mn y nula para los demás
metales. Se postula una interfe-
rencia antagonista sobre la bioad-
sorción de un metal por la presen-
cia simultánea de otros metales.
3.4. Eliminación de la
ecotoxicidad del agua de
mina por levaduras
inmovilizadas
–––––––––––––––––––––––––––––––
Los experimentos se llevaron a
cabo en reactor discontinuo de tan-
que agitado a 120 r.p.m. y a tempe-
ratura de 20°C con el agua ácida de
la mina Merladet (Barruecopardo,
Salamanca) (0,06 mg/1 Al, 0,06
mg/1 Ni, 0,56 mg/1 Cu, 1,91 mg/1
Zn, 2,91 mg/1 Mn) y con un lixi-
viado de lodo de la mina (0,04
mg/1 Cu, 0,20 mg/1 Zn, 0,19 mg/1
Mn), tratados según el método ofi-
cial B.O.E. 10/ 11/89 de análisis de
ecotoxicidad. Los resultados del
estudio de la evolución de la eco-
toxicidad del agua y del lixiviado

abril 03

167
 INGENIERIA QUIMICA
de la mina de Barruecopardo tras
su incubación con el soporte de
poliuretano sin y con células de
Saccharomyces se recogen en la
Tabla VI. Como consecuencia de
este estudio se pudo extraer la
conclusión de que dicha agua
ácida ecotóxica por el hecho de
incubarla con levaduras cervece-
ras atrapadas en espuma de poliu-
retano dejaba de serlo.
4. Conclusiones
1. Tras evaluar la composición
química y los estados fisicoquí-
mico y ecológico de las aguas
superficiales de las cortas de una
serie de minas a cielo abierto de las
provincias de Salamanca y
Zamora, se ha podido concluir que
únicamente son aguas ácidas con-
taminadas con metales pesados
tóxicos las aguas de las minas Fé
(Saelices el Chico, Salamanca)
(con U, Al, Cu, Mn, etc.) y Merla-
det (Barruecopardo, Salamanca)
(con Al, Mn, Zn, Cu).
2. Tras investigar la cinética y
el equilibrio de eliminación de
metales de las aguas ácidas de la
mina Merladet mediante procesos
de bioadsorción sobre residuos
industriales de levaduras de cer-
veza (Saccharomyces cerevisiae),
se puede proponer, en principio, a
estos residuos, abundantes y
baratos, como agentes activos efi-
caces para la biorremediación de
este tipo de aguas contaminadas
con metales. Además, estos bio-
rresiduos se han demostrado efi-
caces a la hora de rebajar o anular
los niveles de ecotoxicidad y
radioactividad de estas aguas áci-
das de mina.
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[27] Moronta, M.J.S. “Determinación de la activi-
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with reagent injection. Application to the determi-
nation of uranium in ore leachates”, Anal. Chim.
Acta 230, pág. 217-220 (1990).
Agradecimientos
A Iberdrola Instituto Tecnológico y al Centro
de Investigación y Desarrollo Tecnológico del
Agua (CIDTA) de la Universidad de Salamanca
por la concesión de una beca. Al Director y per-
sonal del CIDTA por su eficaz colaboración, ase-
soramiento y cesión temporal de sus equipos e
instalaciones para el desarrollo de algunas de las
tareas del programa de trabajo. Al Departamento
de Química Analítica, Nutrición y Bromatología
de la Universidad de Salamanca por la cesión de
sus espectrofotómetros de Absorción Atómica. A
las empresas donantes de las aguas ácidas y de los
residuos biológicos utilizados en este proyecto:
Empresa Nacional del Uranio S.A. (ENUSA)
(Saelices el Chico, Salamanca), Merladet S.A.
(Barruecopardo, Salamanca), Grupo Cruz Campo
S.A. (Sevilla), por su excelente colaboración. Al
Prof. William G. Bardsley por la cesión gratuita
de la última versión del paquete SIMFIT.