ANEXO 1.

BIOENSAYO

A continuación, encontraran bibliografía adicional y un paso a paso para el desarrollo

del Bioensayo. Para esto, se deberá tener en cuenta la guía y rubrica de evaluación de
la etapa 3. Ejecución y Seguimiento, en cuanto a tiempos y rubrica de evaluación, en
este anexo podrán guiarse de una manera eficiente para el desarrollo de la actividad.

Actividades a desarrollar
El bioensayo a realizar es el “Ensayo de Toxicidad aguda con semillas de lechuga
(Lactuca sativa L.)”, cuyo protocolo se encuentra en el recurso relacionado en el
syllabus:
Castillo Morales, G (ed.) (2004). Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de
calidad de aguas: estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. México:
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. Recuperado de
http://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2048/login?user=proveedor&pass=danue0a0&url
=http://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2051/login.aspx?direct=true&db=nlebk&AN=13
5927&lang=es&site=eds-live

El protocolo se encuentra en el Capítulo 4. Protocolos de ensayo, 4.4 Ensayo de

toxicidad aguda con semillas de lechuga, p. 71-79., se recomienda a los estudiantes
que lean completamente el protocolo y los siguientes segmentos del libro, con el fin
de que tengan mayores elementos para el análisis de los resultados: Capítulo 1.
Conceptos generales, p. 17-22. Capítulo 2. Monitoreo ambiental, p. 23-30. Capítulo 6,
Aseguramiento y control de calidad de bioensayos, 6.3.2 Lactuca sativa, p. 131-132.

La práctica se podrá elaborar individualmente o en grupos de máximo 5 personas

del mismo CEAD, así si desean trabajar en grupo deberán ponerse en contacto entre
ustedes para que alisten materiales, recojan la muestra en grupo y desarrollen el
bioensayo en el lugar que ustedes dispongan, puede ser su casa o el mismo CEAD si se
lo permiten, pero no es práctica con acompañamiento de tutor práctico, por tal
motivo no la encontrarán programada en los CEAD. Si deciden realizar el trabajo
en grupo, se debe publicar en el foro la conformación de los grupos para el
desarrollo de la práctica (no es necesario que el grupo de la práctica sea el mismo grupo
del campus). Es indispensable tomar registro fotográfico de todos los pasos de la
práctica, pues se requiere para la elaboración del informe. Los integrantes del grupo
deben aparecer en el registro fotográfico tomado.

A continuación se explican algunas variaciones al protocolo original, para poder ajustarlo

a las condiciones en casa. Por favor siga los pasos al pie de la letra, esto le evitará
confusiones.

1. Leer la finalidad de la prueba

Leer segmento del protocolo: 4.4.1 Principio (p. 71-73)

2. Preparar los reactivos y materiales

- Material biológico: 1 sobre de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.), de

máximo un año de antigüedad (ver fecha de lote).
- 1 Litro de muestra de agua a evaluar, mínimo 500mL.
- 1 L de agua destilada o potable (agua purificada, no de la llave)
- 21 cajas de Petri (de vidrio o plástico, de 100 mm de diámetro, leer más
adelante otras opciones de recipientes)
- Papel de filtro Whatman No. 3 de 90mm de diámetro, deben ajustar bien en las
cajas de Petri (puede reemplazarse por papel absorbente de cocina)
- 3 Goteros o jeringas de 5mL que permitan medir 4mL.
- 1 Probeta de 250mL o un recipiente que este graduado cada 100mL o 50mL
(ver página 9 del presente documento con indicaciones de cómo crearlo usted
mismo).
- Pinzas o algo similar para coger las semillas.
- Sal de cocina.
- 1 recipiente o botella de 1,5 L limpia.
- Papel aluminio (el suficiente para envolver sus 5 cajas de Petri).
- Cinta de enmascarar.
- Libreta de apuntes, formato para la toma de datos diseñado por usted mismo.
- Regla.
- Guantes de látex.
- Bolsas Ziploc tamaño Sandwich.
- Materiales para la toma de muestra de agua: pg. 7 de la presente guía.
Características de las semillas: La obtención de semillas se realiza en tiendas agrícolas
locales, procurando que éstas sean semillas sin curar (sin fungicidas o plaguicidas), de
máximo un año de antigüedad. Es importante realizar la prueba de germinación de las
semillas (se explica más adelante), para asegurar el éxito del ensayo. Las semillas mal
almacenadas reducen su vitalidad y envejecen, disminuyendo su poder germinativo y
aumentando la variabilidad de las medidas de elongación de radícula e hipocótilo en el
control negativo (Castillo Morales, 2004). Por tanto, es importante probar las semillas
adquiridas antes de realizar el ensayo, pues normalmente no se sabe si su
almacenamiento ha sido el óptimo.

Características del papel absorbente utilizado: Leer protocolo, pg. 73. El papel de filtro
(o de cocina) que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes
características:
Trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de líquido.
Resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su superficie
sin atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las plántulas sin dañarlas.
Ausencia de residuos tóxicos (ej. blanqueadores). Que no promueva el desarrollo
de hongos (no asociados a las semillas). (Castillo Morales, 2004, p.73).

Características del recipiente para el bioensayo: En caso de no conseguir las cajas de

Petri, se recomienda al estudiante utilizar alguna de las siguientes opciones, siempre
tratando de mantener las condiciones de inocuidad del medio, con el fin de evitar que
las semillas se contaminen con microorganismos por efectos del recipiente utilizado. Los
recipientes deben tener forma circular, un diámetro similar al de las cajas de Petri, tener
el fondo plano y poder taparse y cubrirse con papel aluminio. Entre las posibilidades, se
dan algunas ideas que han tenido otros estudiantes, como platos desechables o
recipientes para postres (Figuras 1 y 2).

Figura 1. Recipiente para postres. Figura 2. Platos desechables.

 Foto: Manuel Cepeda (2016) Foto: Jairo Porras (2016)

1. Revisión de porcentaje de germinación de las semillas

compradas

Previamente al montaje del experimento, es importante hacer una prueba de

germinación inicial, para comprobar que las semillas están en buen estado y que tienen
un porcentaje de germinación cercano al que dice el empaque en el que vienen,
usualmente del 90%, el mínimo permitido será del 80%.

Para esta prueba se montará una caja de Petri con agua potable (no de la llave) y se
seguirá el procedimiento que se describe más adelante para cálculo del porcentaje de
germinación. Si el porcentaje de germinación está por debajo del 80% entonces se
deberán cambiar las semillas.

Una vez que la prueba arroje el porcentaje de germinación deseado, se podrá utilizar
ese sobre de semillas para el montaje del bioensayo.

1. Obtención de la muestra

La muestra a trabajar será idealmente del entorno contaminado que están investigando
en el proyecto del curso, pero si no es posible (porque usted no vive cerca al lugar
elegido), simplemente deberá escoger un sitio diferente donde se presuma
contaminación industrial, no solo doméstica, ya que ésta contiene contaminantes que
al contrario favorecen el crecimiento de las plantas. Recuerde que alguno de los
miembros del grupo en el campus virtual debe desarrollar el bioensayo con una muestra
tomada en el sitio elegido para el proyecto del grupo.

La recolección de la muestra dependerá del tema elegido. En todo caso, se deberá tener
en cuenta para el análisis las condiciones climáticas del día de recolección de la muestra,
ya que la lluvia o un alto caudal (en el caso de cuerpos de agua) puede disminuir la
concentración de los contaminantes de la muestra tomada. Tenga muy en cuenta el
diagrama de rutas del tóxico elaborado en la Etapa 2, pues le ayudará a tener clara la
forma en que se presenta el tóxico en la muestra a tomar.

Atmósfera.
Existen variados métodos para el monitoreo de contaminantes atmosféricos de forma
precisa y continua. Para efectos del presente curso se tomará una muestra superficial
(el primer centímetro) de suelo de un lugar en donde sea observable la acumulación de
contaminantes atmosféricos en plantas y suelo. Tome la muestra en suelo desnudo, que
no tenga cobertura vegetal. Guarde la muestra en una bolsa Ziploc (tamaño sandwich),
una cantidad que llene media bolsa (aproximadamente 250g). Utilice guantes de látex
y tapabocas al momento de recolectar la muestra.

La bolsa Ziploc debe estar adecuadamente rotulada con el nombre de quien toma la
muestra, tipo de cobertura vegetal que hubiera tenido (en este caso suelo desnudo),
hora y fecha de muestreo.

Suelo.
Si su tema de proyecto es contaminación de suelos con sustancias tóxicas, el
procedimiento para toma de muestra es el siguiente:

Remover entre 2-3 cm de la superficie del terreno (capa vegetal superficial) en el punto
escogido con el fin de limpiar y eliminar los residuos frescos de materia orgánica, polvo
de la carretera u otros contaminantes. Utilizar guantes de látex y tapabocas.

La muestra debe ser tomada a una profundidad de 0-15 cm. Una vez tomada la muestra
debe homogenizarse, destruir terrones y remover material orgánico como: hojas, raíces
y animales. Una vez realizado esto, incorporar la muestra de aproximadamente 250g
en la bolsa ziploc (alrededor del media bolsa), asegurándose que quede bien sellada.

La bolsa ziploc debe estar adecuadamente rotulada con el nombre de quien toma la
muestra, tipo de sistema agrícola o cobertura vegetal que hubiera tenido, hora y fecha
de muestreo.

Agua.
Si su tema de proyecto es la contaminación de algún cuerpo de agua con tóxicos deberá
recolectar una muestra de esta agua para utilizarla en el bioensayo.

Los materiales requeridos para el muestreo dependerán del lugar donde se planee
recolectar la muestra. Se recomienda seguir el protocolo establecido por el IDEAM en
la Guía de monitoreo de vertimientos, aguas superficiales y subterráneas, disponible
en el link
http://www.corponor.gov.co/control_calidad/2014/Guia_monitoreo_IDEAM.pdf
El muestreo que se realizará es puntual, pero deberá seguir las indicaciones para
preparación del recipiente, llenado de la botella, marcación, preservación y transporte
de la muestra hasta el sitio donde hará el montaje de su bioensayo. Sin embargo, como
materiales generales se recomienda llevar para el muestreo (Figura 3): balde, soga, un
recipiente limpio para recolectar 1 Litro de muestra (pueden ser botellas de agua
lavadas y desocupadas), toalla para secar, cinta de enmascarar para marcar el
recipiente donde se pondrá la muestra, marcador indeleble, nevera de icopor con hielo,
guantes de caucho, formato de campo para recolectar información del sitio como
nombre del lugar, del cuerpo de agua, hora, fecha, etc. (En la guía del IDEAM
encontrarán ejemplos de estos formatos), importante también tomar fotos del sitio de
muestreo y no ir solos a tomar la muestra.

La guía del IDEAM habla de medir algunos parámetros in situ a las muestras, pero estos
datos no se tomarán.

IMPORTANTE: la muestra no debe tener más de 24 horas de recogida para el montaje

del bioensayo.

Figura 3. Toma de muestra de agua con un balde. Fuente: Aquatox (2010)

1. Ejecución del ensayo

a) Preparación de las soluciones

 (1) Solución de control positivo:

Las soluciones de control positivo están diseñadas para obtener resultados similares de
los que se obtendrían con agua contaminada. Esta solución le permitirá observar cómo
reaccionan las semillas al agua contaminada.

Se preparará una solución salina de 5g/L, se requerirá 200mL de agua potable (no de
la llave), y adicionar 1 gramo de sal. Si se cuenta con una balanza o una gramera se
podrá pesar el gramo de sal, si no, se tendrá que calcular dicha cantidad a ojo con una
cucharita de cocina, llenándola hasta ¼. Se debe mezclar bien y luego marcar el
recipiente que diga "Control (+)".

(2) Solución de control negativo

Será una muestra de agua potable (no de la llave), sin gas y sin saborizante, alistar
mínimo 200mL para el bioensayo. Marcar con “Control (-)”.

(3) Soluciones de muestra contaminada

Leer “preparación de las diluciones” en la pg. 74 del protocolo. Para el ensayo a realizar
en el curso, se realizarán 5 diluciones: 100%, 30%, 10%, 3% y 1%.

Para preparar las diluciones, se recomienda que cuente con una probeta (Figura 4) o
un recipiente para medir volumen, en caso de no tenerlo, puede fabricarlo usted
mismo, tome un recipiente cilíndrico (uniforme, que no sea cónico), y mida la altura

del recipiente hasta 10 cm, realizando una marcación cada centímetro. La base del
recipiente será el centímetro 0, y aumenta hacia arriba, hasta el centímetro 10. Este
recipiente no le permitirá medir ml, pero sí le permitirá tener proporciones adecuadas.
 Figura 4. Probeta.

El agua con que se preparan las diluciones es agua potable (no de la llave).

Para guardar las diluciones preparadas, marque cinco recipientes con cinta de
enmascarar con la etiqueta: 100%, 30%, 10%, 3% y 1%.

Para preparar las diluciones, siga las siguientes instrucciones:

100%: Corresponde a usar la muestra de agua tal y como se muestreó. Para el caso de
suelos, se toma un recipiente en donde se pueda agregar toda la muestra tomada, y se
satura el suelo hasta su capacidad de carga (agregar agua hasta llegar al límite superior
del suelo), y mezclar. Agregue en el recipiente marcado con “100%”.

30%: Corresponde a usar 3 partes de la muestra al 100% y 7 partes de agua. Sea

agua o suelo, se agregan 3 ml de la dilución al 100%, y se completa hasta 10 ml con
agua potable. En el caso de haber usado un recipiente cilíndrico con marcas,

construido por usted, agregue de la muestra al 100% en el recipiente marcado hasta el

cm 3, y complete con agua hasta el cm 10. Agregue en el recipiente marcado con “30%”.
El cálculo sería: 3 del 100% + 7 de agua = 10. 100% * 3 / 10 = 30%.

10%: Corresponde a usar 1 parte de la muestra al 100% y 9 partes de agua. Sea agua
o suelo, se agrega 1 ml de la dilución al 100%, y se completa hasta 10 ml con agua
potable. En el caso de haber usado un recipiente cilíndrico con marcas, construido por
usted, agregue muestra del 100% hasta el cm 1, y complete con agua hasta el cm 10.
Agregue en el recipiente marcado con “10%”. El cálculo sería: 1 del 100% + 9 de agua
= 10. 100% * 1 / 10 = 10%.

3%: Corresponde a usar 1 parte de la muestra al 30% y 9 partes de agua. Sea agua o
suelo, se agrega 1 ml de la dilución al 30%, y se completa hasta 10 ml con agua potable.
En el caso de haber usado un recipiente cilíndrico con marcas, construido por usted,
agregue de la dilución del 30% hasta el cm 1, y complete con agua hasta el cm 10.
Agregue en el recipiente marcado con “3%”. El cálculo sería: 1 del 30% + 9 de agua =
10. 30% * 1 / 10 = 3%.

1%: Corresponde a usar 1 parte de la muestra al 10% y 9 partes de agua. Sea agua o
suelo, se agrega 1 ml de la dilución al 10%, y se completa hasta 10 ml con agua potable.
En el caso de haber usado un recipiente cilíndrico con marcas, construido por usted,
agregue de la dilución del 10% hasta el cm 1, y complete con agua hasta el cm 10.
Agregue en el recipiente marcado con “1%”. El cálculo sería: 1 del 10% + 9 de agua =
10. 10% * 1 / 10 = 1%.

a) Montaje del bioensayo:

Colocar en cada caja de Petri un disco de papel filtro o un recorte de papel absorbente
con la forma de la circunferencia de la caja de Petri.

Marcar correctamente cada caja de Petri con la dilución correspondiente y la solución

que se aplicará, así como la fecha y hora de inicio del bioensayo. Cada dilución tendrá
tres réplicas, es decir, tres repeticiones. Cada estudiante o grupo de 3 personas deberá
tener 21 cajas de Petri (o recipientes) y marcarlas de la siguiente manera (Tabla 1):

Tabla 1. Diluciones y réplicas.

Dilución Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Control (+) C(+) R1 C(+) R2 C(+) R3
Control (-) C(-) R1 C(-) R2 C(-) R3
D100% D100% R1 D100% R2 D100% R3
D30% D30% R1 D30% R2 D30% R3
D10% D10% R1 D10% R2 D10% R3
D3% D3% R1 D3% R2 D3% R3
D1% D1% R1 D1% R2 D1% R3
Las réplicas son repeticiones que se realizan del mismo tipo de dilución para eliminar
errores experimentales en el bioensayo.

(1) Medida de elongación de radícula (ER) en cada caja de

Petri

Primero ingrese la longitud (tomada en milímetros) de la radícula de cada plántula en

la sección resaltada en color verde en la hoja “RADÍCULA” del Simulador de cálculos,
repitiendo lo indicado en el punto anterior. Una vez haya ingresado los datos, la hoja
calculará los datos necesarios para el análisis. Los cálculos son iguales a los realizados
en el hipocótilo, por favor siga las mismas recomendaciones.

El porcentaje de inhibición de la radícula se calcula de la siguiente forma (la hoja lo

calcula una vez haya ingresado los datos):

% Inhibición Radícula = (Promedio ER C(-) – Promedio ER D) x 100

Promedio ER C(-)

b) Análisis de resultados

Analice los resultados obtenidos en los tres parámetros analizados: germinación,

elongación del hipocótilo y elongación de la radícula. Tenga muy en cuenta los
indicadores obtenidos: NOEC, LOEC, MATC y CI50/CE50.

Deberá concluirse si la muestra es tóxica o no, y cuáles son sus niveles de toxicidad.
según el ensayo realizado.

En el informe deben contestar las siguientes preguntas:

1. ¿Qué significa cada indicador obtenido?

2. ¿En qué parte de la planta tuvo más efecto la posible presencia de tóxicos en la
muestra?
3. ¿Hubo inhibición o exaltación? ¿A qué se le puede atribuir este resultado?
4. ¿Hay riesgo de toxicidad en la muestra tomada? Argumente su respuesta
utilizando términos de la toxicología ambiental.
 2. Alternativas de restauración ambiental
Una vez analizada la toxicidad de la muestra, proponga por lo menos una alternativa
de restauración ambiental que se pueda ejecutar en el lugar del caso. Para esto, lea las
referencias relacionadas en el syllabus del curso y en el contenido de la Unidad 3, en el
entorno de conocimiento.

3. Ficha de monitoreo ambiental

Una vez tenga lista la propuesta de restauración, elabore una ficha de monitoreo
ambiental. Para ello, debe leer el siguiente recurso:

Borderías Uribeondo, M. P., Muguruza Cañas, C. (2014). Evaluación ambiental. Madrid:

Universidad Nacional de Educación a Distancia. Recuperado de
http://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2048/login?user=proveedor&pass=danue0a0&url
=http://bibliotecavirtual.unad.edu.co:2051/login.aspx?direct=true&db=edselb&AN=ed
selb.11013791&lang=es&site=eds-live
Nota: Leer Tema 3, sección 5. Programa de vigilancia ambiental, pg. 6-7.

La ficha debe tener, como mínimo, los datos incluidos en la ficha de ejemplo que se
encuentra en el Cuadro 3.11 del recurso relacionado.
Informe en MS Word
Informe de máximo de 12 páginas tamaña carta, con fotografías del experimento
(Anexos).
 Editor de texto MS Word
 Fuente: Verdana
 Tamaño fuente: 11
 Espacio entre líneas: 1,15
 Párrafo: justificado
 Márgenes: izquierda, derecha, superior e inferior de 2 cm.
 Títulos en la fuente, tamaño 14, negrilla y centrado.
 Subtítulos en cursiva, tamaño 12, negrilla, espacio 1,15 alineado al margen
izquierdo.
  Registre todas las referencias de las fuentes bibliográficas, que le darán soporte
teórico, conceptual y metodológico a su informe.

Las partes del informe serán:

- Portada: indicar nombre completo, cédula y grupo en campus de cada
integrante.
- Introducción.
- Diagrama de flujo de la práctica elaborada.
- Descripción de la muestra llevada al bioensayo.
- Resultados.
- Análisis de resultados.
- Alternativas de restauración ambiental.
- Ficha de monitoreo ambiental.
- Conclusiones.
- Recomendaciones.
- Bibliografía.
- Anexo fotográfico. Debe incluir por lo menos una fotografía de cada paso, y
deben estar todos los integrantes del grupo en las fotos.

Los estudiantes deben subir individualmente el informe en el entorno de Evaluación y

seguimiento. Si la práctica se desarrolló en grupo, cada integrante del grupo debe
subir al entorno de evaluación y seguimiento el informe desarrollado de forma grupal.

Resumen en inglés de la práctica desarrollada.

Cada estudiante debe redactar un texto en inglés con el resumen de la práctica
realizada, que contenga:
 Información del lugar de donde se extrajo la muestra
 Tipo de contaminación a la que está siendo sometido el lugar
 Resultados obtenidos
 Conclusiones
El texto lo debe publicar en el foro de la Etapa 3, con el título: “Resumen práctica
autónoma de (su nombre)”.